THE SPINDLE CHECKPOINT
Контрольно-Пропускной Пункт, Отвечающий за Веретено

THE SPINDLE CHECKPOINT: STRUCTURAL INSIGHTS INTO DYNAMIC SIGNALLING
Andrea Musacchio (amusacch@ieo.it), Kevin G. Hardwick
Nature Reviews Molecular Cell Biology 3, No 10, 731-741 (2002)


Chromosome segregation is a complex and astonishingly accurate process whose inner working is beginning to be understood at the molecular level. The spindle checkpoint plays a key role in ensuring the fidelity of this process. It monitors the interactions between chromosomes and microtubules, and delays mitotic progression to allow extra time to correct defects. Here, we review and integrate findings on the dynamics of checkpoint proteins at kinetochores with structural information about signalling complexes.


(Рис.1.)  |  Key steps in the regulation of mitotic progression.




(Рис.2.)  |  Kinetochores and checkpoint signalling.




(Рис.3.)  |  Structural insights into Mad2 function.



(Табл.1)  |  Checkpoint components and complexes

Boxes


(Вох 1)  |  Checkpoints

Box 2 | Checkpoint kinases and phosphorylation

Genetic studies in budding yeast have implied that the Mps1 and Bub1 kinases act at or near the top of the checkpoint pathway, because the overexpression of either wild-type (MPS1) or mutant (BUB1–5) forms of their genes requires all other Mad and Bub proteins to induce a metaphase arrest.

Surprisingly, the importance of the kinase domains for Bub1 and BubR1 checkpoint function has been brought into doubt. In Xenopus laevis egg extracts, kinase-dead proteins can efficiently rescue immunodepleted extracts>; kinase-dead human BubR1 efficiently inhibits the anaphase-promoting complex (APC) in vitro; and, in budding yeast, a kinase-dead bub1 mutant is capable of robust checkpoint function. Yeast Mad3 proteins lack the carboxy-terminal kinase domain found in their vertebrate BubR1 homologue. It remains to be shown whether the Bub/BubR1 kinase activities do have checkpoint roles, perhaps in the amplification of subtle defects or maintenance of prolonged checkpoint arrests. Mps1 kinase activity is clearly required for spindle-checkpoint function.

Most of the checkpoint proteins are phosphorylated (Mad1 , Mad2, BubR1, Bub1 and Mps1 ) but, in general, it is not known where this takes place or whether it is important for checkpoint function. It has been shown that the hyperphosphorylated forms of Bub1 and BubR1 are enriched on chromosomes and that this modification depends on Mad1 but not on Mad2 .



Box 3 | Spindle-checkpoint defects and disease

Genetic defects in the spindle checkpoint lead to chromosome loss during mitosis and meiosis, and could therefore be a cause of aneuploidy and birth defects. In budding yeast, the Mad and Bub proteins do not contribute equally to chromosome segregation fidelity. Deletion of either Bub1 or Bub3 has the greatest effect, and these two proteins might have roles in chromosome segregation in addition to their checkpoint function.

Although the spindle checkpoint is not essential for growth in yeast, the two reported mouse knockouts (Mad2 and Bub3) have revealed that it is required for embryonic viability in mammals. After embryonic day 5 or 6, cells of these embryos accumulate mitotic errors and undergo apoptosis. Why is the spindle checkpoint essential in mammals? Disrupting Bub1 and Mad2 function (with dominant alleles or antibodies) has been shown to accelerate mitotic exit in vertebrate cells. Such shortened mitoses probably have increased error rates and lead to aneuploidy. In Caenorhabditis elegans, embryogenesis and larval development can proceed in the absence of spindle-checkpoint function. However, there are so many segregational errors that the worms are sterile and short-lived. Similarly, in Drosophila, loss of bub1 function results in an accumulation of mitotic abnormalities and lethality at the larva–pupa transition.

Although checkpoint nulls are unlikely to be observed in humans, haploinsufficiency of one checkpoint component (Mad2) has been reported, with very interesting phenotypes. Deletion of one Mad2 allele results in a defective checkpoint in human cancer cells and primary mouse embryonic fibroblasts, and Mad2+/- mice are susceptible to lung cancer in later life. Bub1 and BubR1 mutations have also been reported to co-operate with BRCA2 deficiency in the pathogenesis of breast cancer. In addition, dominant Bub1 mutants were suggested to be responsible for the chromosome-instability phenotype of certain colorectal cancer cell lines, although this finding has recently been disputed because the cell lines that harbour these mutations have been found to be capable of quite a robust checkpoint response. It is likely that additional mutations within these cell lines, such as the commonly found truncations of the adenomatous polyposis coli protein, also contribute to chromosomal instability.



Links

DATABASES
LocusLink: Aurora-B | BRCA2 | INCENP | MCAK | Zw10
Saccharomyces genome database: Bub1 | Bub2 | Bub3 | Cdc20 | Ipl1 | Mad1 | Mad2 | Mad3 | Mph1 | ndc10-1 | rad9 | Sli15
Flybase: Cdc16 | Cdc27 | Polo | Rod
Для клеток важно поддержание интеграциии своего генома. Репликация ДНК и расхождение хромосом чрезвычайно сложны, подвержены ошибкам и многие контролеры клеточного цикла участвуют в их регуляции (Box 1). Рассматривается один из таких контролеров, spindle checkpoint (КПП)(Рис. 1). Этот checkpoint имеет несколько названий (spindle assembly, KINETOCHORE attachment, metaphase), но мы для простоты будем использовать обозначение 'spindle checkpoint'. Существуют и др., менее охарактеризованные контрольно пропускные пункты (checkpoints), которые жействуют позднее в митозе и которые, по-видимому, отслеживают полжение полюсов веретена и ориентацию веретена (Box 1).
Компоненты spindle КПП впервые идентифицированы при генетическом скрининге почкующихся дрожжей. Это привело к открытию белков Mad и Bub (Табл. 1). Позднее все они были обнаружены законсервированными от дрожжей до человека. Если возникают проблемы в кухне (machinery) сегрегаци хромосом, то комбинированное действие Mad и Bub задерживает начало анафазы, за счет сохранения слипчивости сестринских хроматид. Недавно идентифицированы дополнительрные компоненты КПП у высших эукариот, такие как Zw10 (Zeste-white 10) и Rod (Rough-deal) (Табл. 1).
После репликации ДНК хромосомы представлены парами сестринских хроматид, связанными вместе с помощью комплексов белков, известных как cohesins. Во время митоза сестринские хроматиды присоединяются к микротрубочкам веретена посредством своих кинетохор, которыя являеются чрезвычайно сложными машинами, которые собираются на центромере каждой из хромосом. Чтобы гарантировать равное расхождение генетического материала, две кинетохоры в каждой паре сестринских хроматид должны взаимодействовать с микротрубочками, исходящими от противоположных полюсов веретена один к др. (это биполярное прикреплениеt; Рис. 2). Вхождение в анафазу зависит от всех хромосом, прикрепленных таким биполярным способом. Клетки отслеживают и прикрепление микрорубочек к кинетохорам, и натяжение, которое испытывают кинетохоры от биполярного прикрепления.
Молекулярные детали регуляции хода митоза хорошо изсестны (Рис. 1). В отсутствие биполярного прикрепления, белки spindle-checkpoint испускают глобальный сигнал через всю митотическую кухню (machinery), чтобы ингибировать начало анафазы. Кинетохоры, как полагают, действуют как каталитические сайты, продуцирующие этот сигнал ожидания анафазы ('wait anaphase'). На дрожжах было продемонстрировано, что мишенью для spindle checkpoint (КПП) является дополнительная субъединица комплекса, обеспечивающего анафазу (anaphase-promoting complex (APC)), которая обычно обозначаетя как CDC20 (известна также как Fizzy, Slp1 или p55). Mad2 соединяется непосредственно с Cdc20, a cdc20 мутанты, которые больше не взаимодействуют с Mad2, оказываются нечувствительными к ингибирующему действию checkpoint. Хотя и имеются некоторые несоответствия в интерпретации функции Cdc20–APC ингибитора, однако, ясно, что и Mad2 и BubR1/Mad3 играют ключевую роль. Ингибирование Cdc20–APC предупреждает деструкцию securins и тем самым задерживает разделение сестринских хроматид и анафазу (Рис. 1).

Kinetochores host the spindle checkpoint


Установлено, что одиночного неприкрепленного кинетохора достаточно, чтобы ингибировать начало анафазы во всей клетке. Лазерное удаление такого кинетохора устраняет митотическую задержку. Манипуляции с хромосомами сперматоцитов насекомых показали, что натяжение, оказываемое на кинетохоры во время митоза или на неразрешившиеся кроссоверы во время мейоза, достаточно, чтобы удовлетворить spindle checkpoint. Следовательно, не сюрприз, что и Mad2, затем и все остальные белки Mad, Bub и Mps1 позвоночных (за исключением Bub2) находятся в кинетохорах. Что они в действительности делают, менне ясно. Кинетохоры являются местами, где происходят взаимодействия хромосом с микротрубочками, они отслеживают и являются источником checkpoint сигналов. Кроме того, кинетохоры являются ключевым эффекторным сайтом, т.к. разделение сестринских хроматид д. предупреждаться и локально и глобально. Локализация checkpoint белков в кинетохорах, следовательно, мало что говорит об их функции.

Sensory machinery


Выявление временной корреляции между локализацией checkpoint белков на кинетохорах и ходом прикрепления хромосом должно пролить свет на сигналы, которые запускают работу КПП. Два условия ассоциированы с биполярной ориентацией сестринских хроматид по отношению к веретену: присоединение, возникающее в результате закрепления (docking) концов микротрубочек на поверхности кинетохоров; и натяжение, возникающее после биполярного прикрепления как равновесие между силами, направленными в сторону полюса и в противоположном направлении, включая и слипчивость сестринских хроматид (Рис. 2).

Attachment.
Три микротрубочковых мотора — CENP-E, dynein и MCAK/XKCM1 — и несколько белков, связывающих микротрубочки, расположены в кинетохорах матазоа во время митоза. Функция MCAK, по-видимому, несущественна для хромосомной CONGRESSION, но необходима для анафазы. CENP-E, kinesin-подобный направленный к плюс концу мотор, участвует в congression хромосом и формировании метафазы и в передаче сигналов checkpoint. CENP-E формирует стоихометрический комплекс с BubR1 в клетках HeLa, который обеспечивает первую прямую связь между прикреплением микротрубочек и spindle-checkpoint кухней.
Единственным известным мотором, направленным к минус-концу, в кинетохорах является динеин, который является кандидатом на роль двигателя сестринских хроматид в направлении полюса после их прикрепления и в анафазе. Zw10 и Rod необходимы в клетках метазоа для локализации цитоплазматического динеина на кинетохорах, их инактивация снижает скорость движения хромосом к полюсам. Они необходимы для spindle-checkpoint функции и это обеспечивает ее вторую связь с процессом прикрепления микротрубочек.

Tension.
До сих пор не сложилось определенного мнения о том, как натяжение регулирует checkpoint. Анализ локализации Mad2 в некоторых клеточных системах подтверждает идею, что локализация Mad2 на кинетохорах коррелирует в основном с натяжением во время мейоза и с прикреплением во время митоза. У кукурузы наблюдается корреляция между прикреплением микротрубочек и исчезновением Mad2 во время митозов, но диссоциация Mad2 из мейотических кинетохоров происходит в то же самое время, что и потеря 3F3/2 PHOSPHOANTIGENS, указывая тем самым, что натяжение скорее, чем оккупация, важно. В отсутствие натяжения Mad2 исчезает из прикрепленных кинетохоров в клетках PtK1 и HeLa, тогда как чувствительные к натяжению 3F3/2 phosphoantigen остаются во всех хромосомах. Низкие концентрации vinblastin закрепляют соединение микротрубочек с кинетохором, но активируют Mad2-независимый spindle checkpoint в клетках HeLa, при отсутствии Mad2 в кинетохорах. Напротив, Bub1 и BubR1 остаются в кинетохорах в обработанных vinblastin или noscapine клетках, подтверждая тем самым, что эти белки м. участвовать на пути, который следит за нятяжением.

Attachment versus tension.
Мнение, что оккупации достаточно, чтобы инактивировать Mad2 checkpoint, слишком упрощенно. Syntelic хромосомы (хромосомы с обеими сестринскими хроматидами, прикрепленными к одному и тому же полюсу) часто содержат Mad2 в своих кинетохорах, это указывает на то, что прикрепление - это не конец истории в локализации Mad2. Кроме того, хотя Mad2 и не обнаруживается в прикрепленных кинетохорах в обработанных taxol клетках, он все еще необходим для поддержания ареста митоза. Это, однако, м.б. обусловлено присутствием небольшой пропорции неприкрепленных кинетохоров. У почкующихся дрожжей установлено, что Mad2 необходим клеткам, чтобы отвечать на отсутствие прикрепления или натяжения во время как мейоза, так и митоза. Mad1, Rod и Zw10 (также как и Mad2) удаляются из кинетохоров после их прикрепления во время митозов, тогда как количество Bub1, Bub3, BubR1 и CENP-E уменьшается лишь слегка.
Хотя это и ведет к предположению, что эта последняя группа белков м.б. вовлечена в отслеживание натяжения, использование количественных подходов для измерения флюоресценции выявило более сложную картину. Напр., хотя Bub1 и рекрутируется активно в кинетохоры, когда натяжение реализовано с помощью taxol или vinblastin, он асимметрично распределеяется в кинетохорах моно-ориентированных пар сестринских хроматид, с пониженными уровнями в закрепленных кинетохорах. Это указывает на то, что Bub1 начинает диссоциировать из кинетохоров после прикрепления и что его уровень в кинетохорах регулируется их и натяжением и закреплением. Существенно, что распределение BubR1 не нарушается прикреплением кинетохоров, это согласуется с его возможной ролью в слежении за натяжением.
Aurora kinases являются законсервированными регуляторами митоза и цитокинеза. Идентифицированы Ipl1–Sli15 complex (гомолог комплекса почкующихся дрожжей Aurora-B–INCENP ) как чувствительные к натяжению активности, которые действуют, обслуживая взаимодействия между кинетохорами и веретеном, вплоть до того момента, пока не установится собственно биполярная ориентация. Очевидно, что Ipl1 корректирует неправильное присоединение за счет увеличения оборота взаимодействий между микротрубочками и кинетохорами. Эффекты Ipl1 на spindle checkpoint изучены. У почкующихся дрожжей, отсутствие натяжения в присутствии присоединения м. б. достигуто за счет полного предупреждения репликации ДНК, в этих условиях активируется spindle checkpoint. У мутантов ipl1 spindle checkpoint не реагирует на такие условия, это указывает на то, что Ipl1 является частью tension-sensing кухни spindle checkpoint. Однако, имеется и др. возможное объяснение. Если Ipl1–Sli15 реагирует на отсутствие натяжения, обеспечивая взаимодействия между микротрубочками и кинетохорами, то occupancy, как ожидается, будет теряться в то же самое время. Из-за того, что ipl1 мутанты не м. обеспечить обычные контакты, которые не дают натяжения, то продолжающаяся оккупация микротрубочек м. предупреждать активацию checkpoint.
Почкующиеся дрожжи характеризуются точковыми центромерами, чьи кинетохоры прикрепляются к одиночным микротрубочкам и биполярное прикрепление и натяжение осуществляются в одно и то же время. Законсервирована ли обеспечивающая прикрепление машина, сходная с Ipl1's и в клетках позвоночных? Когда киназа-неактивные доминантно-негативные мутации Aurora-B экспрессируются в клетках нормальных почек крыс, то взаимодействия кинетохоры-микротрубочки сильно затронуты, а Mad2 преждевременно высвобождается кинетохорами. Инъекции anti-Xenopus Aurora B антител в клетки Xenopus tissue culture (XTC) нарушают взаимодействия между кинетохорами и микротрубочками и хромосомную congression. Антитела инъецированные в клетки XTC или добавление антител к экстрактам яиц Xenopus нарушает передачу сигналов checkpoint. Однако, снова неясно, как эти эффекты ингибирования Aurora B упарвляют checkpoint, т.к. и динеин и CENP-E были удалены из кинетохоров. В клетках с региональными центромерами, чьи кинетохоры захватывают множественные микротрубочки,процесс прикрепления д. происходить в несколько этапов, фаза слабого прикрепления д. сопровождаться фазой тесного прикрепления. Слабое прикрепление часто м.б. потеряно, тогда как сильное прикрепление д. происходить только после биполярной ориентации.

Dynamic checkpoint pathways


Mad–Bub dependencies at kinetochores.
Картина, которая складывается это, что кинетохоры служат местом, в котором различные checkpoint комплексы приходят в тесное соприкосновение, стимулируя вообще-то пост-трансляционную модификацию и даже обмен партнерами (Box 2). Природа прямых молеклярных взаимодействий между checkpoint белками и кинетохорами изучена плохо. Единственное, хорошо задокументированное взимодействие это между белком наружной пластинки кинетохра CENP-E (kinesin-подобным белком для которого нет аналога у дрожжей) и BubR1 checkpoint protein. Однако, рекрутирование кинетохором BubR1 относительно позднее событие и врядли абсолютно необходимо для локализации др. checkpoint белков.
Сеть взаимодействий и взаимозависимостей checkpoint белков лучше всего определена для кинетохорной локализации. Mad2 нуждается в Mad1, Bub1 млекопитающих, а BubR1 нуждвется в Bub3, а у делящихся дрожжей Mad3 нуждается в Bub1, Bub3 и Mph1 (гомолог Mps1). Xenopus Bub1 необходим для локализации Bub3, Mad1, Mad2 и CENP-E; Xenopus Mps1 необходим для локализации CENP-E, Mad1 и Mad2; иммунодеплеция iXenopus BubR1 снижает уровни Bub1, Bub3, Mad1, Mad2 и CENP-E в кинетохорах. Это указывает на то, что checkpoint компоненты зависят один от др., хотя и в различной степени, для точной локализации в кинетохорах. Предполагается, что один или несколько checkpoint белков (возможно Bub1 и/или Mad1) возможно действуют как поддержка (scaffold) для рекрутирования др. Bub1 необходим для рекрутирования в кинетохоры многих др. белков и, как было показано биохимически, он ассоциирует с Bub3 и Mad1. Взаимодействие Bub1–Mad1 обнаруживается только тогда, когда КПП активен. N-конец Xenopus Mad1 (остатки 1–445) достаточен для таргетинга кинетохоров. Эта часть Mad1 не соединяется с Mad2 или Bub1 и это хороший кандидат на роль прямого взаимодействия с кинетохорным белком.

Mad2 exchange at kinetochores.
Ассоциация Mad2 с кинетохорами чрезвычайно динамична. Используя слитые конструкции между Mad2 и green fluorescent protein (GFP) и микроинъецируя Alexa-меченные Mad2 конъюгаты, было показано, что период полу-жизни Mad2 на незакрепленных кинетохорах составляет ~24 сек. Скорость обмена для др. checkpoint белков (BubR1, Bub3 и Cdc20) сходного порядка величин, если не выше.
Эти исследования динамики Mad2 привели к предположению, что кинетохоры действуют как каталитические сайты для продукции checkpoint сигнала. Считается, что Mad2 'активируется' в кинетохорах, чтобы приобрести способность эффективно ингибировать функцию Cdc20–APC. Важно установить, какие checkpoint белки связываются непосредственно с Mad2 в кинетохорах и делают они это отдельно или в комплексе. Bub1, Mad1 и Mps1, как известно, необходимы для локализации Mad2 в кинетохорах, но нет доказательств, что какой-либо из этих белков непосредственно взаимодействует с Cdc20 или играет непосредственную роль в ингибировании APC. Предполагается, что эти checkpoint компоненты выполняют сигнальные функции и нацелены на перенос Mad2 на Cdc20.
Др. checkpoint белок, который ингибирует непосредственно функцию Cdc20–APC in vitro это BubR1. Покидает ли BubR1–Mad3 кинетохоры вместе с Mad2? Хотя он и обнаруживается в прямой ассоциации с Mad2 и Cdc20 в экстрактах, но имеются некоторые сомнения об источнике этого комплекса и о том, действительно ли кинетохоры участвуют в его продукции. Напр., установлено, что комплекс Mad2–Cdc20–BubR1–Bub3 у людей м. б. очищен из интерфазных экстрактов и что комплекс Mad2–Cdc20–Mad3–Bub3 почкующихся дрожжей все еще м. генерироваться у ndc10-1 мутантов, у которых, как полагают, полностью отсутствуют структуры кинетохоров.
Однако, кинетохоры м.б. главным каталитическим сайтом продукции таких комплексов и/или они м. модифицировать их каким-то образом. Необходимо установить, происходят ли APC циклы через неприкрепленные кинетохоры и если да, то как это сказывается на функции КПП.

Mad–Bub dynamics and checkpoint silencing.
Помимо быстрого обмена Mad2, описанного выше, имеется зависимый от микротрубочек путь вовлечения в движение checkpoint белков прочь от кинетохор. Этот путь, как полагают, м.б. играть роль в checkpoint silencing (замалчивания), путем выключения spindle checkpoint, как только все хромосомы присоединятся к веретену (Рис. 2d). Т.к. кинетохоры являются каталитическими генераторами сигнала 'ожидания анафазы', то динамический цикл рекрутирования и высвобождения м. ремоделировать шаг за шагом их биохимическую композицию во время процесса прикрепления, приводящего в конце концов к инактивации checkpoint.
Некоторые компоненты наружного домена кинетохоров, включая Mad2, BubR1, CENP-E, 3F3/2 phosphoantigens и Rod, подвергаются циклу динамического перераспределения во время активации checkpoint. Эти белки непрерывнао удаляются из кинетохоров с помощью динеин-зависимого механизма. В то же самое время, кинетохорный пул пополняется с помощью АТФ-зависимой ступени (по крайней мере, когда активен checkpoint). Если динеин ингибирован, то накопление Mad2 кинетохорами и поддержание цикла с высокой скоростью оборота указывает на то, что разные механизмы регулируют взаимодействие Mad2 с кинетохорами. Более того, установлено, что присоединения per se недостаточно, чтобы арестовать или заставить молчать перадачу checkpoint сигналов и что динеином-обеспечиваемое перераспределение Mad2 и др. компонентов прочь от кинетохор при закреплении кинетохоров явуляется существенным. В самом деле, в клетках PtK1 имеется точная определяемая задержка между деплецией Mad2 из кинетохоров последней congressing хромосомы и началом анафазы (10.71.2 мин). Эта временная корреляция не просто указфвает на то, что удаление Mad2 из кинетохоров предопределяет время анафазы, т.к. это предопрделяется и др. молекулярными событиями, включая деструкцию securin и расщепление cohesin.
Zw10 и Rod необходимы для локализации dynein в кинетохорах, который в свою очередь необходим для инактивации checkpoint. Т.о., продолжительная активация Mad2 checkpoint ожидаема при инактивации Zw10 и Rod, но инактивация Zw10 и Rod предупреждает клетки от активации spindle checkpoint. Ничего не известно о взаимодействии между Zw10–Rod и Mad–Bub путями. Локализация Mad1, Mad2, BubR1, Bub3 или CENP-E в кинетохорах не нарушается при удалении Zw10–Rod, a Bub1 не нужен для взаимодействия Zw10 и Rod с кинетохорами. Следовательно, возможно, что Zw10 и Rodпринадлежат к параллельной ветви checkpoint machinery, которая кооперирует с Mad2 путем. чтобы генерировать сигнал 'wait anaphase'. Однако, молекулярная природа checkpoint сигнала, который генерируется с помощью Zw10–Rod пути, неизвестна.
CENP-E также м. удалять Mad2 из закрепившихся кинетохоров. Когда CENP-E человека удален антисмысловыми олигонуклеотидами или когда микроинъецированы anti-CENP-E антитела, то хромосомы не расправляются эффективно. Даже если в этих клетках кинетохоры соединены с микротрубочками клетки обнаруживают строгое Mad2 окрашивание, а spindle checkpoint активирован. парадоксально, в экстрактах Xenopus CENP-E необходим для активации checkpoint и поддержания, а также для локализации некоторых checkpoint белков (включая Mad2) в кинетохорах. Причины подобного расхождения неясны. Mad2 перемещается в веретено клеток делящихся дрожжей в позднем митозе, но белки, которые необходимы для этого, пока неизвестны.

Mad behaviour and interactions with Cdc20


Каковы молекулярные основы механизмов динамического поведения spindle-checkpoint белков? первым шагом в этом направлении служит наблюдение, что Mad2 является компонентом и сигнала 'wait anaphase' и каталитической machinery, которая необходима для его генерации. Два связанных взаимодействия Mad2 — с Cdc20 и с Mad1 — являются центральными в checkpoint (Рис. 3).
Комплекс Mad2–Cdc20 рассматривается как важный компонент сигнала 'ожидания анафазы'. Быстрая кинетика Mad2, обнаруживаемая в кинетохорах м.б. обусловлена его связыванием с Cdc20 и последующим высвобождением из кинетохоров в форме Mad2–Cdc20 комплекса. Взаимодейтвисе Mad2 с Mad1 абсолютно необходимо для образования комплекса Mad2–Cdc20 in vivo. Рекрутирование Mad2 в кинетохоры зависит от Mad1, это подтверждает модель, согласно которой формируется Mad2–Cdc20 комплекс. Во время checkpoint silencing, возможно, что dynein-зависимыйй механизм действует непосредственно на Mad1–Mad2 комплекс, чтобы снижить его концентрацию и тем самым прогрессивно ингибировать его способность генерировать сигнал 'wait anaphase'. Mad1-связывающие сайты, по-видимому, отсутствуют в прикрепленных кинетохорах. Неясно, или они просто маскируются, или удаляются.
Механизм связывания лиганда Mad2 выявляется структурой Mad2–MBP1 (Mad2-binding peptide 1) комплекса и тетрамера Mad1–Mad2. Связывание лиганда выявляет заметные конформационные изменения в С-терминальном хвосте Mad2, напоминая цикл buckling–unbuckling ремня безопасности. Известно, что Cdc20 и Mad1 обладают общими законсервированными 10 остатками Mad2-связывающего мотива, который соединяется с одним и тем же карманом Mad2.
Эти находки уазывают на то, что Mad1 и Cdc20 являются конкурирующими Mad2 лигандами и идентифицируют Mad1 и как позитивный регулятор и как конкурентный ингибитор комплекса Mad2–Cdc20. Такая противречивая роль м.б. объяснена предположением, что только Mad1-связанный Mad2 являтся источником Mad2, который доступен для связывания Cdc20, несмотря на присутствие цитозольного пула Mad2. Заметная стабильность обычного комплекса Mad1–Mad2 м. б. мешать Mad2 встречаться с Cdc20, когда checkpoint неактивен. Mad1-обусловленная локаализация Mad2 на веретене м. увеличивать локальную концентрацию Mad2, чтобы дать толчек образованию комплекса, это возможно объясняет позитивную роль Mad1 во взаимодействии. Факторы локализованной на кинетохорах сборки д. распознавать комплекс Mad1–Mad2 и благоприятствовать последующему переходу Mad2 на Cdc20. Комплекс Bub1–Bub3, напр., образует комплекс с Mad1, его разушение анулирует checkpoint. Полной длины Cdc20 соединяется с Mad2 с более низким сродством, чем фрагменты, которые содержат только Mad2-связывающий сайт, это указывает на то, что Cdc20 м. менять свою конформацию, чтобы соединиться с Mad2. Более того, масса Cdc20 связывается с клеточными chaperones, намекая тем самым, что он м.б. частично или полностью расправлен (unfolded).
Т.о. , комплекс Mad1–Mad2 м. иметь разную судьбу в зависимости от состояния checkpoint. С низким оборотом цитозольный Mad1–Mad2 м.б. рекрутирован в кинетохоры и превращен в быстро-обменивающийся комплекс, высвобождающий Mad2 для Cdc20, тогда как сам он пополняется Mad2 из цитозольного пула. Конформационные изменения в тетрамерном ансамбле м.б. необходимы для высвобождения Mad2 и возможно, что переход фосфорилрование-дефосфорилирование регулирует этот переход. Mad2 человека фосфорилирвется во время митозов. Mps1 фосфорилирует Mad1 у почкующихся дрожжей, тогда как Mad1 человека является субстратом для Bub1 in vitro. Митотическое фосфорилирование человеческого и Xenopus Mad1 не установлено, это м.б. обусловлено преходящей природой модификации. В качестве альтернативного механизма, предполагается, что олигомеризация Mad2 важна для функционирования checkpoint, но недавние данные ставят это под вопрос.
Цитозольный пул свободного Mad2 м.б. важным для поддержания высокой скорости оборота Mad2 в веретене, т.к. его снижение нарушает checkpoint. В соответствии с этим, Mad2+/- клетки становятся ANEUPLOID и Mad2 HAPLOINSUFFICIENCY у мышей вызывает опухоли (Box 3). Тот факт, что баланс между Mad1 и Mad2 является критическим для собственно работы КПП (checkpoint) м. обяснить противоречащие эффекты избыточной продукции Mad1 или Mad2 на ход клеточного цикла. Напр., Mad1 м. способствовать аресту клеточного цикла при низких концентрациях, но нарушает checkpoint при высоких концентрациях.

Deconstructing the 'wait anaphase' signal


Каково предназначение 'wait anaphase' сигнала, который генерируется незакрепленными кинетохорами? Т.к. он диффундирует прочь от неприсоединенного или частично присоединенного кинетохора, то этот сигнал д. просто найти и ингибировать APC. Альтернативно, он м. захватываться микротрубочками веретена и транспортироваться к 'интеграционному центру', который контролирует ход анафазы, а возможно к центросоме. Эта гипотеза подтверждается экспериментами на гетерокарионах, которые показали, что checkpoint сигнал не м. диффундировать прочь от веретена, в котором он возникает.
Если условий для образования комплекса Mad2–Cdc20 непосредственно из цитозольного пула не существует, то что препятствует его распаду после высвобождения из кинетохоров? Одна из возможностей в том, что механизм связывания типа 'ремень безопасности' действует как кинетическая ловушка, чтобы удлиннить период полу-жизни комплекса, несмотря на относительно низкое сродство взаимодействия. Возможно также, что Mad2–Cdc20 стабилизируется с помощью включения в крупный комплекс. Согласно size-exclusion chromatography, большая часть APC-ингибирующей активности в клетках HeLa фракционируется при пике 450–700-kDa, который содержит в основном BubR1. Попытки установить композицию этой фракции дали противоречивые результаты, возможно из-за разных способо очистки. В одном случае идентифицируется BubR1–Bub3 в качестве превалирующего компонента, с sub-stoichiometric количествами Cdc20; в др., Mad2, Cdc20, BubR1 и Bub3 были выявлены в качестве примерно stoichiometric компонентов APC ингибитора и связаны с этим комплексом (названным MCC - mitotic checkpoint complex) с более строгой ингибрующей активностью APC, чем только у одного Mad2. Эквивалентный четвертичный комплекс, содержащий Mad2, Cdc20, Mad3 и Bub3, обнаружен в почкующихся дрожжах.
Установлено, что Mad3 делящихся дрожжей нуждается в Mad2 для ингибирования APC in vivo и что иммунодеплеция XBubR1 из экстрактов яиц нарушает взаимодействие между Mad2, Bub3 и Cdc20. Однако, вопрос могут ли Mad2 и BubR1–Bub3 вступать в четвертичный комплекс с Cdc20, остается открытым. Хотя рекомбинантный BubR1 ингибирует Cdc20-обусловленную активацию APC с более высокой специфической активностью, чем Mad2 in vitro, эти белки обнаруживают кооперативное связывание Cdc20 и ингибирующие эффекты на APC и оба они предупреждают прямое связывание Cdc20 с APC, указывая тем самым, что они действуют путем оттитровывания Cdc20. Это плохо согласуется с сообщениями, показавшими, что Mad2 и Bub3–BubR1 включаются в комплекс с Cdc20–APC во время митозов.
Повышенное сродство митотического APC к Cdc20, возможно является следствием фосфорилирования APC или Cdc20, такж м.б. важным для ступени рекрутирования. В соответствии с этим было установлено, что интерфазный MCC м. ингибировать APC, который очищен митотических — но неинтерфазных — клеток. Предполагается, что APC комплексы в клетках являются гомогенными, но недавние исследования на Drosophila поставили под вопрос это утверждение. GFP–Cdc16 и GFP–Cdc27 оба включены в эндогенный APC, оказывается они локализованы по-разному и RNA INTERFERENCE эксперименты показали, что они м. даже выполняеть разные функции. Ясно, что такая идея нуждается в подтверждении на др. системах, идеально без non-tagged APC субъединиц, но она открывает возможность, что spindle checkpoint ингибирует лишь субпопуляцию от всех APC в клетке.
Как обсуждалось выше, dynein-обеспечиваемый путь — с помощью которого checkpoint белки м. перемещаться от кинетохоров к полюсам веретена — является одним из возможных механизмов предупреждения продукции комплексов, ингибирующих APC. Кроме того, выявлены некоторые Mad2 комплексы, которые разбираются перед выходом из митоза и м. наступить необратимая активаци APC после высвобождения BubR1–Bub3 и Mad2.
Недавно было установлено, что Mad2 и BubR1 действуют в одном общем пути, который вызывает митотическую задержку в клетках PtK в гипотермических условиях. Такие клетки имеют нормальные количества кинетохорных микротрубочек, но с пониженным натяжением.Это подтверждает, что Mad2 необходим клеткам, чтобы отвечать на отсутствие натяжения. Кроме того, показано, что если Hec1 (Ndc80) человека удален из клеток с помощью siRNA, то ни Mad1/Mad2 комплекс, ни Mps1 киназа не м.б. обнаружены в кинетохорах, хотя spindle checkpoint активирован.


Сайт создан в системе uCoz