MOTORS AND SWITCHES: AAA+ MACHINES WITHIN THE REPLISOME
Megan J. Davey, David Jeruzalmi, John Kuriyan, Mike O'Donnell (odonnel@mail.rockefeller.edu) Nature Reviews Molecular Cell
Biology3, No 11, P. 826-835 (2002)
Clamp loaders are required to load the ring-shaped clamps that
tether replicative DNA polymerases onto DNA. Recently solved crystal
structures, along with a series of biochemical studies, have provided a
detailed understanding of the clamp loading reaction. In particular,
studies of the Escherichia coli clamp loader — an AAA+ machine —
have provided insights into the architecture of clamp loaders from
eukaryotes, bacteriophage T4 and archaea. Other AAA+ proteins are also
involved in the initiation of DNA replication, and studies of the E.
coli clamp loader indicate mechanisms by which these proteins might
function.
(Табл.1) | Clamp loader subunits from different organisms.
(Табл.2) | AAA+ proteins involved in DNA replication.
The χ-subunit interacts with the ssDNA binding protein (SSB), and this contact is important in the exchange of the primase for both the clamp loader and polymerase at the primed site. The role of the ψ-subunit remains somewhat enigmatic. The χ- and ψ-subunits are not required for clamp loading in vitro, nor are they required for replication elongation in vitro. The χ-
and &psi-subunits interact to form a 1:1 complex. The ψ-subunit interacts with γ and forms a link between χ and the γ-complex. When χ and ψ are missing from the γ-complex, both clamp loading and replication elongation become sensitive to elevated salt concentrations. The basis of this sensitivity seems to be the interaction between χ and SSB. Genetic characterization of the genes for these proteins remains tobe determined.
Для репликации хромосом нужна ДНК полимераза, которая быстро удваеивает тысячи нуклеотидов. Во всех клетках репликативная полимераза закрепляется на ДНК с помощью кольцеобразной которая окружает ДНК и скользит свободно вдоль нее. Это обеспечивает высокую степень производительности репликативной полимеразы. Кольцеобразная скользящая манжетка коструируется из двух или трех ддентичных кольцеобразных протомеров, а их закрытая циркулярная структура нуждается в активном механизме, чтобы открыть ее и защелкнуть на ДНК. Этот процесс осуществляется мультибелковой машиной, известной как , которая открывает кольцо и помещает его вокруг primed ДНК с помощью АТФ-управляемой реакции.
Занрузчик манжетки состоят из субъединиц, которые относятся к AAA+ семейству (Box 1) и законсервированы у бактерий, archaea и эукариот. Загрузчики манжеток в каждой ветви живых существ довольно сходны по своей структуре и механизму (Табл. 1). У Escherichia coli, загрузчик манжетки известен как γ-complex, который представлен 5 субъединицами: δ,&delta' и тремя копиями γ. Кроме того, две др. субъединицы, χ и ψ ассоциируют с загрузчиком манжетки, хотя они не обязательны для загрузки in vitro (Box 2).
Загрузчики манжеток из бактериофага T4, archaea и эукариот также содержат 5 субъединиц, хотя композиция комплексов варьирует. Эукариотический загрузчик манжетки — (RFC) — имеет 5 разных субъединиц, все они AAA+ белки. Archaeal загрузчики манжеток состоят из двух разных субъединиц, обе из AAA+ белков, хотя стоихметрически этот комплекс не полностью распознан. Хотя многие вирусные не используют загрузчик манжетки и кольцеобразные манжетки, но бактериофаг T4 имет загрузчика, который состоит из двух разных субъединиц в 4:1 stoichiometry.
Многие и др. важные для репликации белки также являются AAA+ белками — в частности, белки, участвующие в инициации репликации ДНК. AAA+белки включают DnaA и некоторые субъединицы (ORC), инициаторы у E. coli и эукариот репликации. Кроме того, предполагаемые в эукариотических клетках, Mcm2–7,
является комплексом из 6 различных AAA+ белков. Один из белков, необходимый для сборки Mcm2–7 комплекса на оригиналтьной ДНК, Cdc6, и его E.coli гомолог, DnaC, также являются членами этого семейства. За исключением archaeal Cdc6 и бактериального DnaA, структура которых установлена, имеется мало структурной информации об этих белках.
Clamp loaders in various organisms
The E. coli clamp loader.
Биохимические и структурные исследования γ-комплекса и его β-манжетки привели к пониманию того, как функциониует загрузчик манжетки. β-Манжетка является кольцевой формы олигомером, состоящим из двух месяцеобразных субъединиц, которые охватывают двунитатую double-stranded (ds) ДНК и скользит свободно вдоль нее. Циркулярная β-манжетка оказавшись на ДНК, связывает репликативную полимеразу (Pol III) и прикрепляет ее к матрице с высокой производительностью. β-Димер закрывает кольцо и АТФ-управляемый процесс необходим для сборки манжетки на ДНК — процесс осуществляемый загрузчиком манжетки. Энергия связей АТФ и гидролиз используются для обеспечения загрузки манжетки, хотя гидролиз АТФ не нужен для открытия манжетки.
Загрузчик манжетки у E. coli состоит из 3-х различных субъединиц:γ3, δ и δ' (Рис. 1). Три γ-субъединицы являются лищь субъединицами, которые связывают АТФ и , следовательно, представляют собой 'мотор', который управляет реакцией загрузки манжетки. Субъединица δ открывает β-димер — даже при полном отсутствии γ и δ'— на одной стороне, и по этой причине она названа отмычкой ('wrench'). Субъединица δ не соединяется с АТФ, чтобы открыть манжетку используется энергия, производимая в результате межбелковых взаимодействий с помощью механизма, обеспечиваемого δ–β структуры. Имеется одна копия δ в комплексе для открытия манжетки, а др. субъединицы манипулируют этой активностью для помещения β на праймер/матрицу и для закрытия кольца.
Внутри γ-комплекса δ блокируется от взаимодействия с β. Однако, АТФ индуцирует конформационные изменения в γ-комплексе, открывая δ для взаимодействия с β и последующего открытия кольца. Далее было установлено, что δ' внутри γ-комплекса помогает предупредить связывание δ c β. Считается, что связывание АТФ с γ вызывает отделение части δ' от δ, это позволяет δ соединиться с β. δ' названа 'stator'. Статор является стационарной частью машины, остальные части которой подвижны, и δ', по-видимому, является ригидным белком, в котором отсутствуют гибкие смещения, имеющие место в δ и γ субъединицах. Статор δ' м. также функционировать как упор для управления движением др. частей.
Структура β1–&delta комплекса показывает, что δ контактирует с β1 в двух местах — в гидрофобном кармане и в петле, вблизи димерного интерфейса β. Эта петля соединяется с α-спиралью, которая формирует часть β-димераного интерфейса (строн, обращенных др. к др.). δ меняет позицию петли, которая в свою очередь изменяет конформацию α-спирали (a1"),и нарушает структуру интерфейса димера. Внутри β-димера спираль в интерфейсе принимает искаженную конформацию, которая необходима для упаковки двух гидрофобных остатков на спирали напротив второго промотора. В β1–δ структуре эта спираль принимает каноническую α-спиральную конформацию, изменяя тем самым структуру интерфейса, так что она становится несовместимой с димеризацией.
Эти наблюдения показывают, как δ-субъединица нарушает интерфейс β-димера, но не объясняет как этот интерфейс β раскрывается, чтобы пропустить внутрь нить ДНК. Раскрытие интерфейса димера для образования щели м. объяснить, исходя из сравнения структуры β-димера со структурой β-мономера (в β1–δ структуре). β-промотор состоит из трех глобулярных доменов, каждый из которых имеет одну и ту же сложеную цепочку, это обеспечивает β-димеру шестискладчатую симметрию (Рис. 2). β1 воспринимает менее изогнутую форму полумесяца, чем субъединица внутри β-димера. Изменения в степени искривленности осуществляются благодаря движениям ригодного тела между тремя доменами β. Самое значительное движение наиболее удалено от места, где δ контактирует с β, указывая тем самым, что это движение внутренне управляется архитектурой β скорее, чем δ связыванием β. Увеличение изгиба β2 при сравнении с β1 показывает, что промоторы β2 изгибаются в более крутую форму полумесяца, чтобы образовать закрытое кольцо. Возможно, что сила интерфейса димера достаточна для управления изгбом β. Такое расположение обеспечивает механизм, с помощью которого продуцируется пробел после взламывания интефейса β. Когда интерфейс димера изменен с помощью δ, то промоторы более не нужны для поддержания изгиба и тогда субъединицы пружинно открывается в более мелкую форму полумесяца, образуя просвет для прохождения ДНК (Рис. 2).
Кристаллическая структура γ3δδ' AAA+ машины показывает, что 5 субъединиц расположены в круг, δ и δ' заключают как бы в скобки три γ субъединицы (Рис. 3). Субъединицы внутри γ-комплекса имеют тот же самый паттерн укладки цепи, каждая воспринимает общую трехдоменную структуру (Рис. 3a). Домены I и II соответствуют доменам AAA+. Субъединицы расположены параллельно своими С-терминальными доменами (домен III), образуя наиболее сильные контакты между субъединицами. Если γ-комплекс рассматривать снижу, то С-терминальные домены субъединиц образуют пентамерную форму закрытого кольца (Рис. 3b). Напротив, если смотреть снизу на N-терминальные стороны, то виден пробел между δ и δ'(Рис. 3b).
β-взаимодействующие элементы δ, в домене I, расположены в просвете между δ и δ'. Эта структура была получена в отсутствие АТФ и т.обр., β-взаимодествующий элемент δ д.б. недостаточно открыт для связывания β. АТФ необходим для γ-комплекса, чтобы открыть его достаточно, чтобы δ связалась с β. Возможно, что просвет между δ и δ' сужается в растворе, т.к. силы, упаковывающие в кристалл м.б. задействованы γ3δδ' комплексом в частично открытой конформации. В самом деле, если β смоделировать на γ3δδ' структуру, используя β–δ структуру, то β-кольцо сильно дисгармонирует с др. субъединицами загрузчика менжетки. Следовательно,γ3δδ' находится в закрытом состоянии. Сходное моделирование использовали для проверки гипотезы о полностью закрытой и полностью открытой конформации γ3δδ' ансамбля. В закрытом состоянии &delta упаковывается напротивt δ', скрывая β-взаимодействующий элемент δ. В самом деле, имеются открытые гидрофобные участки в домене I &delta и &delta', которые, по-видимому, образуют комплементарные поверхности для взаимодействия в закрытой конформации. В предполагаемом полностью открытом состоянии домен I δ д.б. ротирован наружу, по крайней мере на 20–30° по отношению к домену III,чтобы обеспечить взаимодействие δ с β2 без стерической дисгармонии с др. субъединицами загрузчика манжетки. В этой модели β проникает под γ-комплекс и потенциально формирует контакты с γ и δ'. Инспирированное такой возможностью взаимодействие между γ и β наблюдалось, хотя оно было слабее, чем δ–β контакт. Эти дополнительные контакты м. помочь стабилизировать открытую форму β.
Сайты связывания АТФ обнаруживаются на интерфейсе пар субъединиц, в результате три АТФ сайта внутри γ-комплекса на δ'/γ1, γ1/γ2 и γ2/γ3 интерфейсах. Большинство из контактов с нуклеотидами формируется с одной субъединицей, хотя каталитический сайт, как полагается, нуждается в законсервированном остатке аргинина из соседней субъединицы. В загрузчике манжетки этот аргинин является частью высоко законсервированного , который локализован в спирали αG. Аргинин SRC мотива напоминает '' в GTPase-активируемых белках, которые стимулируют гидролиз ГТФ связей с малыми G белками, такими как Ras. Этот аргининовый остаток, как полагают, стабилизирует переходное состояние, в основном стимулируемое гидролизом ГТФ с помощью Ras. Соответственно, мутации γSRC сказываются на γ функции. Сравнение АТФ сайтов γ-комплекса с таковыми AAA+ белков, таких как (NSF) и родственного p97 assembly белка (оба участвуют в мембранном переносе), показало, что аргинины SRC в γ3δδ' расположене некорректно, чтобы обеспечивать гидролиз АТФ. Интересно, что гидролиз АТФ с помощью γ-комплекса наиболее эффективен, когда γ-комплекс связан с β и с праймер/матрицей. Ассоциация γ-комплекса с сайтом праймера м. сдвигать SRC в конформацию, которая способствует гидролизу АТФ, этим самым запускается механизм собственно заправления нити ДНК в β-манжетку прежде чем осуществится гидролиз АТФ.
Структура γ3δδ' и биохимические данные привели к созданию модели загрузки манжетки (Рис. 1). В отсутствие АТФ загрузчик манжетки находтся в закрытом состоянии. Часть δ-отмычки, которая взаимодействует с — и открывает — β-манжетку, закупорена &delta'-статором; он или расположен слишком близко к β, чтобы связать δ, или возможно он упакован напротив δ. Когда γ-моторные субъединицы связывают АТФ, то N-терминальные домены γ-субъединиц поворачиваются кнаружи, вызывая также скручивание N-терминального домена δ и открывая его для взаимодействия с β.
В противоположность γ и δ, &delta'-субъединица, по-видимому, более ригидна. В то время как γ и δ имеют 4–6 остатков-коннекторов между доменами II и III, δ' имеет только один остаток с дополнительными четвертичными контактами между двумя доменами в &delta'. Более того, конформация изолированной δ' сильно напоминает ту, что у δ' внутри γ3δδ' ансамбля и по этой причине была уподоблена статору.Очевидная ригидность δ'-статора м. действовать опора, направляющая индуцируемые АТФ конформационные изменения, чтобы распространить их от γ1 через γ2, γ3 и, наконец, через δ, отталкивая ее прочь от &delta'. В такой конформации β-взаимодействующий элемент δ-отмычки открывается и загрузчик манжетки взаимодействует с и открывает β-кольцо. Комплекс загрузчик манжетки-манжетка м. тесно связываться с сайтом праймера и это является наилучшим эффектором гидролиза АТФ. После взаимодействия с сайтом праймера загрузчик манжетки гидролизует АТФ и возвращается в закрытое состояние, которое м. приводить δ в непосредственную близость с δ', обеспечивая взаимодействие с β. В этой акции, ригидный δ'-статор действует подобно наковальне, сплющивая β, т.к. δ сближается с δ'. Одинокая β-манжетка, затем повторно замыкается, отловив внутрь ДНК.
The eukaryotic clamp loader, RFC.
Загрузчик манжетки у эукариот, RFC, состоит из одной копии каждой из 5 различных субъединиц. Все 5 субъединиц RFC комологичны и γ и δ'. Стоихометрия и гомология укахзывают на то, что RFC субъединицы расположены в виде циркулярнрого пентамера подобно γ3δδ'. Кроме того, манжетка у эукариот — proliferating cell nuclear antigen (PCNA) — структурно сходна с E. coli β-манжеткой.
Предполагаемое функциональное предназначение субъединиц RFC соответствует таковому γ-мотора, δ-отмычке и &delta'-статору (Рис. 4b). Аналогично γ3δδ', С-концы субъединиц RFC человека необходимы для главных контактов субъединиц, т.к. мутанты с укороченными С-концами в RFC человека препятствуют образованию RFC комплекса.
Подобные &delta-отмычке последовательности обнаружены в Saccharomyces cerevisiae (p140 человека), сходной с др. субъединицами RFC и подобно δ, тесно взаимодействующей с собственной распознаваемой манжеткой, PCNA. Более того, подобно δ, Rfc1 является единственной субъединицей, в которой отсутствует SRC мотив. Роль статора м.б. приписана /p38 complex (Рис. 4b). Подобно δ', Rfc5/p38 имеет измененную P петлю и не связывается с АТФ, хотя она содержит SRC мотив.
Отсальные субъединицы — (p37), (p36) и (p40) — образуют гетеротримерный комплекс у дрожжей и человека. Кроме того, подобно γ-тримеру дрожжевой Rfc2/3/4 и человечьий p37/p36/p40 комплексы являются ДНК-заисимыми АТФазами. Наконец, каждая из этих субъединиц, подобно γ, содержит и АТФ-связывающий сайт и SRC мотив (Табл. 1). Расположение субъединиц RFC, показаное на Рис. 4b, также согласуется с исследованиями межбелковых взаимодействий.
Archaeal clamp loaders.
Archaea обладают двумя субъединицами в загрузчике манжеток, RFCL (большая) и RFCS (малая), обе являются AAA+ белками. RFCS родственна Rfc3, тогда как RFCL сходна с Rfc1. У большинства archaeal видов, RFCL не содержит SRC мотива подобно δ-отмычке, однако она содержит петлю подобно Rfc1. Подобно γ RFCS субъединица имеет и SRC и P-loop мотивы. Кристаллическая архитектура Pyrococcus furiosus малой субъединицы (PfuRFCS) указывает на то, что структурной единицей является тример, сходный с γ-тримером в γ-комплексе, в котором АТФ связывающие сайты образуют инитерфейсы субъединиц. Отношение RFCS к RFCL в загрузчике манжетки у Pyrococcus не ясно.В некторыз исследованиях обнаруживаются взаимоотношения 3–4:1–2 (малых к большим субъединицам). Авт. склоняются к 3:2 соотношению исходя из тримерной структуры единицы из RFCS при исследовании кристалла.
Возможна аналогия archaeal RFC с E. coli γ3δδ' пентамером показана на Рис. 4c, три RFCS субъединицы (S1, S2 и S3) и две RFCL субъединицы (L1 и L2) образуют комплекс. L1 субъединица единственная, которая не участвует в формировании АТФ-связывающего сайта, так что она м. играть роль отмычки. Используя ту же логику, S1 субъединица д.б. аналогична δ'-статору т.к. это единственная субъединица имеющая SRC мотив. Хотя S1 имеет интакную P петлю и м. связывать АТФ, но не гидролизует АТФ благодаря отсутствию SRC в L2. Фактически, некоторые прокариотические δ'-субъединицы имеют интактные P петли и т.обр., м. связывать ATФ, но они м. не гидролизовать его по тем же самым причинам.
The bacteriophage T4 clamp loader.
Бактериофаг T4 кодирует свою собственную кухню (machinery) репликации, включая манжетку (gp45 тример) и загрузчик манжетки (gp44/62 комплекс). Тример gp45 принимает кольцевую структуру с общей упаковкой цепей, сходной с таковой в E. coli β-манжетке. Подобно γ-комплексу загрузчик манжетки T4 состоит из 5 субъединиц — четырех gp44 субъединиц и одной gp62 субъединицы. Субъеддиница gp44является AAA+ белком и содержит и SRC и P-loop мотивы, которые связывают и гидролизуют АТФ. Итак, gp44 тетрамер имеет моторную функцию. Субъединица gp62 подобно δ не обнаруживает существенной гомлогии последовательностей с AAA+ белками. По аналогии с плохо законсервированной δ-отмычкой γ-rjvgktrcf, субъединица gp62 м.б. отмычкой загрузчика манжетки у T4 (Рис. 4d; Табл. 1). М. предположить, что gp62 м. даже иметь сходную структуру с δ, хотя этому нет доказательств.
Нет отдельной третьей субъединицы в загрузчике T4 сравнимого с δ'-статором E. coli γ комплекса. Возможно, что 'extra' gp44 моторная субъединица м. действовать как статор. Т.к. gp62 субъединица не содержит SRC мотива, то gp44 субъединица, которая рядом с gp62 д.б. неспособной гидролизовать АТФ. Такая субъединица gp44 м.б. постоянно связана с АТФ или вообще gp62 препятсвует связи АТФ с этой субъединицей.
AAA+ machines that initiate DNA replication
Несколько др. важных репликационных белков являются членами семейства AAA+, особенно факторы, которые участвуют в инициации репликации ДНК (Табл 2).
Bacterial initiation proteins
The E. coli initiator, DnaA.
Первой ступенью репликации ДНК у E. coli является связывание инициатора репликации, DnaA, с источником репликации, oriC. Источник репликации содержит 4 из 5 копий DnaA-связывающего сайта. DnaA соединяется с этим сайтом как мономер, а ЭМ картина DnaA, связанного с oriC, показывает, что DnaA олигомеризуется на источнике, а ДНК обвернута вокруг стержня из DnaA. АТФ индуцирует DnaA к расплетанию A+T-богатой области, которая соседствует с DnaA-связывающими сайтами (Рис. 5). Расплетание этой A+T-богатой области необходимо для репликации, т.к. образующаяся однонитчатая single-stranded (ss)ДНК является местом сборки репликативной геликазы, DnaB (Рис. 5). Анализ количества молекул DnaA, связанных с источником репликации показал, что имеется 4-5 молекул, это согласуется с количеством DnaA-связывающих сайтов oriC.
DnaA является членом семейства белков AAA+ и , следовательно, некоторые структурные свойства γ-комплекса м.б. приложимы к DnaA. Напр., олигомеризация DnaA на источнике м.давать в результате циркулярное расположение субъединиц, сходное с γ-комплексом (рис. 6a). Интересно, что два DnaA-связывающих сайта находятся на противоположных сторонах ДНК спирали по сравнению с др. тремя DnaA-связывающими сайтами. Итак, образование пентамерного кольца, как это показано на Рис. 6a, м. нуждаться в некотором закручивании ДНК, которое, как мы полагаем, м. вносить вклад в раскручивание A+T-богатой области. Согласуется с этой идеей и распределение спиральных phasing между DnaA-связывающими сайтами, влияющими на функционирование источника. Раскручивание источника репликации с помощью DnaA м. облегчаться за счет прямого взаимодействия DnaA с A+T-богатой областью после того, как DnaA соединяется со своим двунитчатым сайтом распознавания. Конформационные изменения, индуцируемые АТФ связыванием с DnaA м. поворачивать часть белкаt (как в случае γ и δ в γ-комплексе), приводя DnaA в контакт с ssDNA в A+T-богатой области и удерживая ее открытой.
Источник, расплетаемый с помощью DnaA, тонко регулируется за счет состояния нуклеотидных мостиков данного белка: DnaA–ATФ поддерживает источник расплетенным, тогда как DnaA–AДФ нет. Итак, DnaA м. вести себя как ATФ/AДФ-переключаемый белок. Замена АДФ на АТФ очень медленное и м.б. использовано для регуляции реинициации. DnaA содержит законсервированный аргининовый остаток в Box VII (расположенном в том же самом положении что и законсервированный аргинин SRC мотива в субъединицах загрузчика манжетки; см Box 1). Вообще-то гидролиз АТФ с помощью DnaA субъединицы (называемой Hda) м. запускать последовательный гидролиз АТФ вокруг предполагаемого кольца DnaA. Это м. б. благодая конформационным изменениям, которые посепенно переносятся с аргининового остатка в Box VII на нуклеотид-связывающий сайт соседней субъединицы,способствуя гидролизу АТФ вокруг кольца. Несколько факторов, как полагают, стимулируют гидролиз АТФ и АДФ/АТФ замену (напр., IdaA, IdaB и Hda). Одним из способов действия этих белков м.б. модулирование положения предполагаемого аргининового пальчика в DnaA, чтобы начать цикл ATФ-гидролиза.
DnaC, the helicase loader.
После того как DnaA соединится с oriC и расплетет A+T-богатую область, репликативная helicase, DnaB, загружается на ssDNA вздутие (Рис. 5). Этот процесс нуждается в загурзчике helicase DnaC, небольшом AAA+ белке, который использует жнрегию АТФ связывания, чтобы загрузить DnaB на oriC. DnaC расширяет ssDNA bubble в источнике репликации, создавая достаточно ssDNA для двух DnaB гексамеров. После того как DnaB загрузится на oriC, DnaC гидролизует ATф и уходит из источника. Интересно, что DnaC также является ATФ/АДФ белком-переключателем, так как ATФ-связанная форма DnaC ингибирует активность DnaB helicase, а AДФ-связанная форма - нет.
ATФ гидролиз — а , следовательно, переключение с АТФ-связанной формы на АДФ-связанную форму — нуждается в гексамерной DnaB геликазе. Вообще-то мономерный статус DnaC лежит в основе потребности в DnaB гексамере, чтобы индуцировать DnaC к гидролизу связанного АТФ. Специфически, DnaC олигомеризуется в гексамерное кольцо после ассоциации с DnaB гексамером (Рис. 6b). Более того, DnaC также содержит Box VII аргинин, который соответствет аргинину в SRCмотиве субъединиц загрузчика манжеток. Подобно γ-комплексу олигомеров олигомеризация DnaC (на DnaB) м.б. необходимой для перенесения аргининовых пальчиков в juxtaposition с соседними DnaC субъединицами, чтобы способствовать гидролизу АТФ. Как и в случае γ-комплекса гидролиз АТФ с помощью DnaC также зависимт от присутствия ДНК субстрата.
Eukaryotic replication initiation
The origin–recognition complex (ORC).
Инициатором репликации у эукариот является ORC, гетеро-олигомер, который представлен 6 разными субъединицами, –Orc6.
ORC действует как посадочная подушка для последовательно связывания белков во время инициации репликации. Напр., Cdc6 (cdc18), который контролирует инициацию, также взаимодействует непосредственно с ORC.
По крайней мере три ORC субъединицы, Orc1, Orc4 и Orc5, являются AAA+ белками. Изучение S. cerevisiae ORC показало, что Orc1и Orc5 связываются с ATA и нуждаются в интактных P loops для своей активности. Т.к. Orc4 имеет модифицированную P петлю, он не связывает АТФ. Интересно, что Orc4 перекрестно связывается с ATФ, но нуждается в интактной P петле в Orc1, не в Orc4, указывая тем самым, что АТФ связывается с помощью Orc1, соседом Orc4. Более того, Orc4 содержит законсервированный Box VII аргининовый пальчик, это открывает возможность того, что Orc4 вставляет аргининовый пальчик в АТФ-связывающий сайт Orc1. Не наблюдается прямое взаимодействие между Orc1 и Orc4, хотя ассоциация Orc1 с Orc2/3/4/5 нуждается как в Orc4, так и в Orc5 в человеческой системе.
ЭМ показала, что ORC подвергается существенным конформационным изменениям в присутствии ssDNA (Рис. 6c). Наиболее впечатляющим свойством структуры ORC в связи с ssDNA является ее C форма, аналогичная N-терминальной стороне γ3δδ' (Рис. 3b) и ЭМ картине RFC. Хотя три из субъединиц ORC не обнаруживают общих гомологиных последовательностей с AAA+ белками, интересно предположить, что подобно δ-субъединице γ-комплекса одна или более из них м. принимать структуру, которая сходна с таковой их AAA+ дубликатов.
Dj время формирования preRC, ORC взаимодействует с др. членом семейства AAA+, ( у S. pombe). Cdc6, вместе с , поставляет 'minichromosome maintenance' (MCM) комплекс в (preRC). Комплекс MCM , как полагают, является репликативной геликазой, это говорит о том, что Cdc6 м. выполныть роль, которая сходна с таковой у E. coli DnaC ATФ-переключающим белком по загрузке геликазы в oriC. Структура archaeal Cdc6 известна, как и ожидалось,внутри AAA+ области она содержит туже самую складку цепи, что и др. AAA+ белки, включая субъединицы загрузчика манжетки.
The MCM complex.
Комплекс MCM состоит из 6 различных белков, –7, каждый из которых является AAA+ белком. 6 Mcm белков взаимодействуют, чтобы сформировать гетерогексамерный комплекс, каждый представляет одну субъединицу. Этот комплекс, как полагают, является эукариотической репликативной геликазой. В соответствии с этой предполагаемой ролью все 6 Mcm субъединиц необходимы для элонгации.
Mcm4, Mcm6 и Mcm7 образуют субкомплекс с геликазной активностью, который, как полагают, перемещается с репликативной вилкой у S. cerevisiae. Геликазная активность гетерогексамера не установлена, хотя у почкующихся дрожжей MCM комплекс функционирует на ATPase. Геликазная активность MCM гетерогексамера м. нуждаться в контексте репликационой вилки. Напр., бактериальная репликативная геликаза, DnaB, наиболее эффективна, если купирована с репликативной полимеразой. Одиночная archaeal MCM обладает геликазной активностью, а ЭМ исследование показывает, что она соответствует гексамерам, наложенным один на др. Эукариотический Mcm2–7 комплекс также м.б. кольцеобразным (Рис. 6d).
Интересно, что MCM ATPase активность нуждается, по крайней мере в двух субъединицах, это говорит о том, что АТФ-связывающие сайты образуются интерфесами субъединиц. Более того, аргинин Box VII законсервирован также и у MCMs т вставлен в 'SRF'мотив, подтверждая тем самым, что комплекс MCM м. иметь аргининовые пальчики, которые сходны с таковыми γ-комплекса. Соотв. было показано, что мутация в законсервированном аргининоваом остатке в мотиве SRF у Mcm3 влияет на АТФ гидролиз с помощью Mcm3/7 субкомплекса в почкующихся дрожжах. Интересно, что др. геликазы — включая некоторые из тех, которые являются AAA+ белками (такие как E. coli RuvB)
— также имеют законсервированный аргинин, которы, как полагают, действует как аргининовый пальчик. Аргининовые пальчики м. действовать, чтобы координировать последовательность гидролиза в олигомерах.
Conclusions
Biochemical and structural studies of the E. coli γ-complex
combine to yield a detailed model of the clamp-loader mechanism. This
model might be applied to clamp loaders of different organisms, and
possibly to other DNA-replication proteins in the AAA+ family. In
particular, the functional roles of the motor, wrench and stator of each
of the γ-complex subunits, might be conserved in
clamp loaders from all branches of life. Furthermore, the arrangement of
ATP-binding sites at the interface of subunits is probably conserved in
many AAA+ protein machines on the basis of a conserved arginine residue in
Box VII of many AAA+ proteins. Further structural and biochemical studies
on clamp loaders and other DNA replication assemblies will yield details
of the function of AAA+ sequence elements within these complex
multiprotein machines.
