Посещений:
Centromere Formation
Образование Центромер:Роль центромерной ДНК

The role of DNA sequence in centromere formation
Jonathan C Lamb and James A Birchler (BirchlerJ@Missouri.edu)
Genome Biology 2003 4(5):214



Рис.  |  Центромеры хромосом

Centromeres and the Nucleus





Centromeres are highly complex chromosomal substructures involved in essential aspects of chromosome transmission during cell division. The centromere/kinetochor complex is responsible for directing chromosome movements in mitosis and for faithful progression of mitotic events at the transition between metaphase and anaphase.
Accurate chromosome segregation relies on the interactions between the centromere/kinetochor complex and the spindle apparatus. Aberrant chromosome transmission causes genomic instability which can result in common birth defects, spontaneous abortions and is also tightly correlated with almost all types of cancer. In addition, viral proteins are able to target specific centromere components causing the destruction of the centromere complex and subsequent cell-cycle arrest of the host cell.
Within the cell nucleus centromeres undergo changes in their intranuclear localization during the cell cycle. They have been found to associate or colocalize with subnuclear structures, such as the nucleolus or nuclear bodies. Dynamic interactions between centromeres and other nuclear substructures may be important in controlling gene expression and centromere function as well.



Research Goals

The elucidation of structure-function relationships of centromere components and their dynamic interplay within the nucleus will provide insight into centromere function and may help to understand mechanisms underlying genome instability and viral pathogenesis. We are studying the following aspects of centromere function in Yeast (Saccharomyces cerevisiae) and/or mammalian cells:

(a) identification of new centromere proteins (molecular biology, biochemistry)
(b) elucidation of the structure of centromere proteins (Cristallography, NMR, collaborative projects)
(c) identification of specific protein/protein interactions in vitro (biochemistry)
(d) centromere protein/protein interactions in vivo (cell biology/live cell microscopy)
(e) connection between centromeres and subnuclear structures (FRET, FCS in vivo)




contig: "A chromosome map showing the locations of those regions of a chromosome where contiguous DNA segments overlap. Contig maps are important because they provide the ability to study a complete, and often large segment of the genome by examining a series of overlapping clones which then provide an unbroken succession of information about that region.
related terms: bacterial artificial chromosome (BAC) , chromosome, cloning, deoxyribonucleic acid (DNA), gene, genome, physical map, yeast artificial chromosome (YAC)
Центромеры являются ключем для правильного расхождения и наследования генетической информации. Центросомы эукариот, которые локализуются в виде больших блоков высоко повторяющейся ДНК и связаны с белками кинетохор, которые необходимы для прикрепления микротрубочек к хромосомам во время митозов. Центромеры являются парадоксальными в отношении их основной функции, которая сильно законсервирована у эукариот, но их последовательности дивергентны даже у тесно родственных видов. Секвенирование их последовательностей затруднено, т.к. центромеры расположены в областях высоко повторяющейся ДНК. Несколько групп исследователей разработали новые методы для преодоления этих трудностей и установили центромерные последовательности у людей, Drosophila и Arabidopsis..
Делеции больших областей Y хромосомы человека показали, активность ценромер ассоциирована с блоком тандемно повторяющихся единиц в 171 base-pair (bp), названных ?-сателитная ДНК. Дальнейшие исследования продемонстрировали, что каждая центромера человека ассоциирована с наборами этих ?-сателитных ДНК, которые м. составлять несколько megabases (Mb) по размру. Эти массивные наборы вставлены между блоками перицентрического гетерохроматина, содержащими высоко поврторяющуюся ДНК. In situ гибридизация с ?-сателитами и иммуномечение с использованием антител против белков кинетохор, также подтверждает, что центромеры расположены в этих областях.
Schueler et al., использовали изменчивость среди повторов из 171 bp ?-сателитной ДНК в центромере человека, чтобы создать PCR маркеры. Маркеры были использованы для конструкции 500 kilobase (kb) contig of bacterial artificial chromosomes (BACs), которые перекрывают область, непосредственно соседствующую с и включающую часть из 3 Mb массива ?-сателлитов, локализованных в центромере Х хромосомы человека. Shotgun и BAC-end секвенирование дало выборки этой области, которые содержали примерно 62% дивергентной ?-сателитной ДНК, около 24% др. сателитных повторов и около 16% LINE-типа ретроэлементов, а также и др последовательности. Массив в 3 Mb ?-сателитной ДНК состоит почти из идентичных копий единиц в 171 bp, которые обнаруживают более чем 99% идентичных последовательностей, ориентированных в одном и том же направлении. По карю массива примерно 40 kb ?-сателитной ДНК, которая становится более дивергентной с расстоянием от центра массива в 3 Mb, начиная от 98% до 70% идентичности на краю.
Центромеры Arabidopsis содержат сателитные повторы в 178 bp, которые организованы тандемно в массивы размером от 0.4 Mb до 1.4 Mb в разных хромосомах и расположены между областями, богатыми разными сателитами и др. повторяющимися элементами. Кластеры ?-сателитной ДНК у человека и в 178 bp центромерные элементы у Arabidopsis организованы сходным образом, хотя их первичные последовательности полностью неродственны. Интересно, что центромеры др. растений также содержат ДНК элементы сходной длины и это м. указывать на общую потребность в них для центромерной функции.
Для секвенирования ДНК из центромер Drosophila использовали новый подход с участием Drosophila minichromosome Dp1187, которая происходит из Х хромосомы и сохраняет полностью функциональную центромеру. Несколько делеционных производных этой микрохромосомы выявлено после облучения и они были использованы для картирования центромеры в области в 420 kb. Одно производное хромосомы в 620 kb получено с помощью электрофореза и гель экстракции. Его ДНК фракционирована и клонирована и бактериальные транспозоны вставлены в клонированную ДНК. Было продемонстрировано, что центромера Х хромосомы Drosophila состоит из массивов двух типов из простых сателитов в 5 bp, AATAT и AAGAG, которые прерываются 5 ретротранспозонами и 'островком' сложной ДНК. Используя праймеры, специфичные для вставленных бактериальных транспозонов или меченные праймеры, которые состоят из сателитных последовательностей, прикрепленных к негомологичным последовательностям, Sun et al. оказались способными получить выборку в 31 kb из AATAT и AAGAG сателитов. Было показано, что массивы в центромерах Drosophila очень сходны - последовательности AATAT обнаруживают 2.2% вариаций, а AAGAG только 0.3% изменчиваости - и что повторы в каждом сателите имеют одну и ту же ориентацию. В то время как транспозон-подобные последовательности, обнаруженные ранее в гетерохроматине Drosophila часто состоят из смешанных (scrambled) кластеров из различных элементов, ретротранспозоны в центромере Х хромосомы были интактными. Это указывает на то, что они вставлены довольно недавно в геном или что их последовательности функционально законсервированы. Островок сложной ДНК имеет длину в 39 kb, включая 16.2 kb последовательность, богатую AT, и ретротранспозон-подобные элементы, которые расположены в виде блоков разной ориентации. TНачало и конец этого островка содержит сходные последовательности, но ориентированные в противоположных направлениях - расположение аналогичное центромерам делящихся дрожжей.
Все элементы, идентифицированные Sun et al. обнаружены также в нецентромерных районах генома Drosophila ; AATAT и AAGAG сателиты присутствцют и в др., но не во всех центромерах. В самом деле, у Drosophila нет ДНК последовательностей, которые локализуются в каждой центромере, это указывает на то, что только первичных центромерных последовательностей не достаточно и они необязательны для формирования центромер. Массивы, идентифицированные в Х хромосоме, м.б. скорее пермиссивными центромерными организациями
Центромеры Drosophila необычны по составу последовательностей, которые широко представлены и в др. участках генома, тогда как у растений или млекопитающих это не так в нормальных условиях. Однако известны некоторые случаи, в которых обычные центромерные последовательности у людей м.б. обнаружены в др. местах хромосом, где они не обнаруживают видимой центромерной активности. Напр., Robertsonian транслокации, при которых происходит перестройка целых плеч акроцентрических хромосом, м.б. связаны с двумя центромерами в результате чего такие хромосомы стабильно передаются в митозах и мейозе. Более того, in situ анализ с помощью антител против кинетохорных белков, таких как CENP-C, важного компоента внутренней кинетохорной пластинки, и CENP-A, специфичного для центромер варианта гистона H3 у людей, показал, что только одна из двух центромер сохраняет функцию.
У людей также обнаружены хромосомы с перестройками, в которых отсутствует область, в которой обычно присутствует центромера, и в этих случаях новое место приобретает центромерную активность. Новый сайт ('neocentromere') имеет обычные признаки центромеры - он формирует цитологически различимое сужение на центромере и имеет присоедирненные кинетохорные белки. Последовательность ДНК, которая дала две такие неоцентромеры определена с помощью иммунопреципитации хроматина антителами против центромерного гистона H3 белка CENP-A. Анализ изолированной области ДНК показал, что отсутствуют элементы, общие между двумя неоцентромерами и нормальными центромерами.
Искусственные хромосомы человека м. б. получены введением массивов ?-сателитной ДНК в клетки, но не введением последовательностей ДНК неоцентромер. Тем не менее, когда хромосомные плечи, окружающие неоцентромеру укорочены за счет введения теломерных послбедовательностей, то возникающие минихромосомы, содержащие неоцентромерную ДНК, м.б. увековечены благодря клеточным делениям. Это указывает на то, что сателитный массив нормальных центромер м. управлять формированием центромер de novo , тогда как ДНК неоцентромер - не может.Тем не менее, струткрура хроматина неоцентромер, по-видимому, стабильно поддерживается в течение клеточного цикла. Т.к. первичные последовательности неодинаковы у неоцентромер и обычных центромер, то присутствие неоцентромер указывает на то, что функция центромер м. регулироваться на эпигенетическом уровне независимо от последовательностей ДНК.

Models of centromere determination


Важность хроматиновой структуры для функции центромер подтверждается присутствием видо-специфичных вариантов гистона H3, обнаруживаемого в центромерном хроматине всех эукариот. Варианты взаимодействуют с др. стрежневыми гистоновыми белками H2a, H2b и H4, чтобы сыормировать тип нуклеосом, который присутствует только в функциональных центромерах. Было предположено, что нуклеосомы, содержащие центромерный гистон H3, обязательны для функции центромер и скорее всего служат как якоря для образования кинетохор. Предложена модель, согласно которой корректное пространственное положение центромерных и нормальных нуклеосом необходимо для функции центромер, это подтверждается данными на клетках Drosophila и человека, показавшими, что stretched хроматин из центромер организван в блоки центромерных нуклеосом, разборосанными между блоками нуклеосом, содержащими нормальный стержневой гистон H3. Такое расположение м.б. облегчено сателитами, в центромерах. Центромерные сателиты от млекопитающих и растений примерно такой длины, которая необходима , чтобы обернуться вокруг нуклеосомы и даже у Drosophila мультиплеты из 5 bp сателитов м. добавляться пока не достигнут единицы нуклесомной длины.
Анализ центромерного гистона H3 у родственных видов млекопитающих, мух и растений показал, что варианты очень сходны со стержневыми гистоновыми H3 белками в областях, которые взаимодействуют с др. гистоновыми белками. Но в области, в которой скорее всего происходит контакт ДНК нити, центромерные гистоновые Н3 белки, по-видимому, находятся под адаптивным отбором. Т.к. элементы ДНК последовательности, которые находтся в контакте с центромерными Н3 гистонами, дивергентны между видами, то м. предположить, что центромерный гистон H3 и ДНК эволюционируют совместно. Мейотический дрейф (нарушение сегрегации хромосом), возникающий в результате преимущественного позиционирования более сильных ('stronger') центромер в яйце во время мейоза у самок м. б. тем самым механизмом такой ко-эволюции.
Многие модели детерминации центромер предсказывают, что функция центромер не зависит от подлежащих последовательностей. Такие модели сформулированы, чтобы объяснить, как нуклеосомы, содержащие центромерный гистон H3 поддерживаются во всех функциональных центромерах независимо от последовательности ДНК, с которой они асстоциируют. Пространственное или временное секвестрирование центромер внутри ядерного компартмента связано с доступностью центромерных нуклеосом внутри этих компартментов или с временными фазами м.б. предложено в качестве механизма. Др. модель предсказывает, что имеющиеся нуклеосомы, содержащие центромерный гистон H3, распределены на каждой нити во время репликации и впоследствии используются для пострепликационной поставки дополнительных центромерных нуклеосом.
Модели образования центромер, которые не увязаны с последовательностями, м. объяснить некоторые элементы, такие как ?-сателитная ДНК у человека и у Arabidopsis 178 bp повторы, которые присутствуют в каждой центромере в нормальном кариотипе у данных видов. По-видимому, д.б. механизм, который гомогенизирует повторяющиеся элементы, такие как центромерные повторы. Напр., неравный кроссинговер постулирован для объяснения гомогенеизации ?-сателитной ДНК внутри хромосом, но д.существовать также процесс, который гомегенизирует повторы между негомологичными хромосомами. Если механизм гомогенизации налагает ограничения на субстратные последовательности, изменяя центромерные элементы, которые становятся фиксированными в разных популяциях, то он будет становиться случайно распределенным в отсутствии селекции по содержимому последовательностей. Анализ центромерных сателитов у Arabidopsis и человека идентифицировал области, которые были законсервированы среди различных итераций (iterations), а также области, которые были боее вариабельными, чем средние, это указывает на то, что давление отбора действует на последовательности центромерных элементов. Наблюдение неслучайного распредления центромерной сателитной ДНК не согласуется с этой моделью, предполагающей полную нецуместность последовательностей.
Некоторые исследователи оставляют возможность того, что вторичрная структура или даже более высокого порядка структура ДНК м.б. фактором, детерминирующим положение и функцию центромер. Эта идем м. примирить данные, показывающих ненужность первичных последовательностей, с одной стороны, с данными, показывающими консервацию элементов ДНК. с др. стороны. Консервация вторичной структуры ДНК допускает большую изменчивость последовательностей, но не исключает тонкой настройки первичных последовательностей, в общем-то посредством ко-эволюции с доменом центромерного гистона Н3, который ассоциирует с ДНК. Сходным образом, эпигенетические модели образования центромер, предполагающие регуляцию на уровне хроматина, не м. исключить тонкой настройки первичных последовательностей. В любой модели, образование центромер с новыми последовательностями, будет дозволено, пока область будет разрешать собственно организацию ДНК высшего порядка.
Данные анализа неоцентромер подтверждают идею, что центромеры само-увековчиваются, не нуждаясь в специфических подлежащих последовательностях. Напротив, консервация центромерных повторов у человека и Arabidopsis указывает на специфическую потребность на этом уровне. Крайние модели, говорящие в пользу специфических элементов ДНК в центромерах в противоположность отсутствию потребности, нуждаются в новом ситезе. Способ, с помощью которого предопрделяется положение центромеры на хромосоме еще неизвестен, но выявление последовательностей ДНК из центромер разных видов дадут необходимую информацию для создания новых моделей. Чтобы определить важность разных элементов ДНК, обнаружиенных вблизи или в центромере, необходимо знание механизмов, которые управляют эволюцией центромерной ДНК. Напр., отсутствие каких-либо центромерных элементов, общих всем центромерам у Drosophila м.б. результатом механизма гомогенизации, который фундаметально отличен от того, что функционирует у млекопитающих и растений.
Сайт создан в системе uCoz