Ono, T. et al. Differential contributions of condensin I and condensin II to mitotic chromosome architecture in vertebrate cells. Cell115, 109-121 (2003) | | |
WEB SITE
Mitotic chromosome assembly, or condensation, is an essential part of the cell cycle, and the canonical condensin complex (condensin I) is known to have enzymatic and structural roles in this process. But how these functions are coordinated to establish and maintain mitotic chromosome structure remains unknown.
Tatsuya Hirano и др. идентифицировали второй конденсиновый комплекс, condensin II. Подобно condensin I, condensin II состоит из 5 субъединиц — две из structural maintenance of chromosomes (SMC) семейства и три non-SMC субъединицы. Однако в то время как две SMC субъединицы ( и ) идентичны в обоих комплексах, non-SMC субъединицы различны — , и по сравнению CAP-D3, CAP-G2 и CAP-H2 в condensins I и II, соотв.
Hirano и др. использовали small interfering (si)RNA-обусловленную деплецию для изучения in vivo функции SMC субъединиц в клетках HeLa. Хотя ход клеточного цикла не блокируется при деплеции любого из SMC белков, метафазные хомосомы не выглядят более палочковидными, а пушистыми ('fuzzy') и облоко-образными ('cloud-like'). Помимо этого тяжесть морфологических дефектов коррелирует с количеством SMC белков, оставшихся на хромосоме.
Затем авт. истощали non-SMC субъединицы CAP-G и CAP-G2, которые уникальны для condensin I и condensin II, соотв. Снова ход клеточного цикла оставался неизменным, а морфологические дефекты бвли очевидными, но дефекты были иными, специфичными для depleted субъединиц. Истощение обеих non-SMC субъединиц вызывало дефекты подобные тем, что наблюдались после деплеции SMC. Авт. приходят к выводу, роли двух комплексов не перекрываются, что было подкреплено иммунофлюоресцентным окрашиванием.
Hirano и др. затем использовали immunodepletion для изучения комплексов in vitro в экстрактах яиц Xenopus. Condensins I и II присутствуют в соотношении ~5:1 (в HeLa клетках они одинаковы). В соответствии с этим хроматин спермиев, инкубированных с condensin-I-истощенными экстрактами, деконденсировался и хромосомы не формировались. И condensin-II-истощенным экстрактом отдельны хромосомы формировалвись, хотя и имели аномальную морфологию. Иммуноблотирнг хроматиновых фракций подтвердил, что два комплекса загружаются на хромосомы независимо. Двойное иммунофлюоресцентное окрашивание выявило спираль-подобное распределение condensin I и "...distinct, somewhat irregular, and less continuous..." распределение condensin II. Было также установлено, что condensin II локализуется глуюже, чем condensin I по отношению к оси хромосомы.
Итак, распределение двух комплексов сравнимо in vitro и in vivo, но что всё это значит? Авт. полагают, что non-SMC субъединицы регулирую пространственное и временное распределение двух комплексов и что вместе condensins I т II облегчают конценсацию и помогают сохранять форму метафазных хроматид — варьирующие их соотношения предопределяют форму и свойства хромосм у разных организмов. Предложены две модели condensin-based архитектуры хромосом, в обеих "...condensin I would act as the primary organizer of chromatin fibers, whereas condensin II would play an additional, architectural role in determining the final shape of chromosomes". Hirano's не исключают также возможностиучастия множественных конденсинов в динамике мейотических хромосом.
Конденсин и Кохезин
Lavoie, B. D. et al. In vivo requirements for rDNA chromosome condensation reveal two cell cycle regulated pathways for mitotic chromosome folding. Genes Dev. 30 Dec 2003 (doi:10.1101/gad.1150404) |
The molecular understanding of chromosome condensation has been hampered by the lack of useful mutants and by the low resolution of cytological staining procedures. However, modern imaging technologies, such as fluorescence in situ hybridization (FISH), allow a more detailed analysis of the process of chromosome condensation, a nice example of which was published recently in Genes & Development by Brigitte Lavoie and colleagues.
Lavoie и др. синхронизировали клетки почкующихся дрожжей в M фазе и отслуживали морфологию хромосом во время одного клеточного цикла. Микрофотографии FISH повторяющихся локусов рибосомной ДНК позволили выявить 5 отдельных стадий в конденсации хромосом: в G1/S фазе, рДНК существует в виде двух видов — крупных и малых пуфов — которые в G2/M фазе конденсируются в высоко компактыне кластеры, которые последовательно распространяются в упорядоченные линии и наконец становятся петлями.
Condensin необходим для конденсации хромосом, ранее авт. было показано, что в отсутствие кондесиновых субъединиц рДНК неспособна формировать и поддерживать петли, а , следовательно, остаётся пуфф-подобной. Если экспрессировать чувствительную к температуре мутацию субъединицы condensin, то при рестриктивной температуре арестованные в метафазе клетки содержат в основном кластеры и пуфы рДНК, а также несколько петель. А если клетки арестованы после начала анафазы, то большинство ядер обнаруживает рДНК пуфы. Это указывает на то, что конденсация и в самом деле многоступенчатый процесс и что condensin необходим с начала митозов и вплоть до начала анафазы.
Cohesins, как полагают, необходимы для конденсации и поддержания хромосом почкующихся дрожжей, но необходимо также удалять их из хромосом, чтобы позволить хромосомам сегрерировать в начале анафазы. Чтобы понять роль cohesin, Lavoie и др. арестовывали клетки после того, как хромосомны расходились к противоположным полюсам, но когда рДНК оставалась конденсированной. Субъединица cohesin выявляется на метафазных хромосомах, но не на конденсированных хромосомах после началаа анафазы — указывая тем самым, что конденсация рДНК в анафазе не зависит от cohesin.
Кроме того, когда линии, которые лишены функционального Mcd1, обнаруживают низкую конденсацию, если арестованы в метафазе, но конденсация такая же как в линиях дикого типа, если клетки арестованы в анафазе. Итак, конденсация после начала анафазы м.б. вызвана и поддерживаться с помощью cohesin-независимого пути.
Авт. нашли, что субъединица condensin Ycg1 фосфорилируется в митозе и что фосфорилирование зависит от митотической киназы (известной также как Aurora). Учитывая, что пик фосфорилирования Ycg1 соответствует времени накопления петель рДНК, очень возможно, что оно играет роль позднее в процессе конденсации — возможно модулируя cohesin-независимый путь. В самом деле, в отсутствие функции Ipl1 конденсация рДНК не м. поддерживаться и происходит возвращение к структурам пуфов.
Эти находки проливают свет на высшего порядка укладку хромосом во время митозов и указывают на то, что необходимы два пути. Понимание митотической структуры рДНК м.б. пригодным для создания рабочей модели для изучения процесса конденсации эухроматиновых хромосом у дрожжей и др. организмов.