Посещений:
Нервный Гребень и Развитие Головы

Development of the vertebrate head

CRANIAL NEURAL CREST AND THE BUILDING OF THE VERTEBRATE HEAD
Nature Reviews Neuroscience , V.4. №10. P. 806 -818 (2003)
Fabio Santagati & Filippo M. Rijli

Перевод И.Г. Лильп (lilp@mail.ru) и В.А. Мглинца
Развитие головы у позвоночных представляет собой сложную цепь молекулярных и морфогенетических событий, в результате которых возникает скоординированный паттерн, состоящий из хрящей, костей и нервов, и которые ведут к видоспецифичному черепно-лицевому морфогенезу. Специализированный тип клеток неврального происхождения – клетки нервного гребня – играют центральную роль в этом процессе, поскольку именно они являются основным источником черепно-лицевой мезенхимы. Степень паттернирующей информации, присущей нервному гребню, обсуждалась достаточно долго и активно. Новые достижения в этой области свидетельствуют о влиянии сигналов из микроокружения на транскрипционное считывание (transcriptional readout), координирующее пространственно-временной черепно-лицевой морфогенез.


(Рис.1.)  |  Skeletal fate of cranial neural crest cells in vertebrates


(Рис.2.)  |  Molecular integration of anteroposterior and dorsoventral patterning information


(Рис.3.)  |  Cranial neural crest cell prepatterning versus plasticity (1).


(Рис.4.)  |  Cranial neural crest cell prepatterning versus plasticity (2).


(Рис.5.)  |  Molecular pathways involved in the specification of frontonasal, maxillary, mandibular and hyoid structures.


(Box.1.)  |  Homeobox genes

DIENCEPHALON The more posterior of the two subdivisions of the forebrain (the anterior subdivision being the telencephalon). Structures that are derived from the diencephalon include the retina, the pineal gland, the thalamus and the hypothalamus.
FLOOR PLATE The neural tube has been divided into different regions. The ventral cells closest to the midline constitute the floor plate. The dorsal cells closest to the midline correspond to the roof plate. The alar plate (dorsal) and the basal plate (ventral) lie between these two cell populations, and are separated by the sulcus limitans.
HOMEODOMAIN A 60-amino-acid DNA-binding domain that comprises three б -helices and is found in many transcription factors.
RETINOIC ACID A derivative of vitamin A that acts as a morphogen and regulator of differentiation during embryogenesis.
FIBROBLAST GROWTH FACTORS (FGFs). Multifunctional factors that are involved in embryonic development. More than 20 FGFs and 4 FGF receptors have been described. Their coordinated activity controls cell proliferation, migration, survival and differentiation. FGFs regulate growth and morphogenesis by early action on regional patterning, and a later effect on the growth of progenitor cells of the forebrain.
WNT PROTEINS A family of highly conserved secreted signalling molecules that regulate cell–cell interactions during embryogenesis. Wnt proteins bind on the cell surface to receptors of the Frizzled family.
RHOMBOMERES Neuroepithelial segments found transiently in the embryonic hindbrain that adopt distinct molecular and cellular properties, restrictions in cell mixing, and ordered domains of gene expression.
BONE MORPHOGENETIC PROTEINS Multifunctional secreted proteins of the transforming growth factor superfamily. In the early embryo, they participate in dorsoventral patterning.
BASIC HELIX–LOOP–HELIX A structural motif present in many transcription factors that is characterized by two б -helices separated by a loop. The helices mediate dimerization, and the adjacent basic region is required for DNA binding.
CRE RECOMBINASE Part of a site-specific recombination system derived from Escherichia coli bacteriophage P1. Two short DNA sequences (loxP sites) are engineered to flank the target DNA. Activation of the Cre recombinase enzyme catalyses recombination between the loxP sites, leading to excision of the intervening sequence.


Box 2 | Skeletogenic potential in cranial neural crest cells The cranial neural crest cells (NCCs) are unique among NCC populations, in that they can differentiate into skeletal tissue 1 .What confers this skeletogenic potential? Interestingly, recent work indicates that this potential is inversely related to Hox expression status 80,82 .The anterior-most cranial neural crest is Hox-negative and generates most of the cartilage and membranous bones of the face and jaw, as well as the greatest number of skeletal elements. The NCCs of the second pharyngeal arch, which express only group 2 Hox genes, form a smaller number of skeletal elements, which contribute to the middle ear and hyoid bone in the neck region. The third arch NCCs, which express both group 2 and 3 Hox genes, make an even less significant contribution to the neck skeleton. The NCCs of the trunk, which express several additional posterior Hox genes, do not generate any skeletal structures at all. A skeletogenic fate can be acquired by trunk NCCs after long-term in vitro culture 155 , and interestingly, this correlates with a loss of Hox gene expression 82 .Conversely, forced constitutive expression of Hoxa2, Hoxa3 or Hoxb4 in Hox-negative NCCs in the chick embryo gradually inhibits the development of the craniofacial skeleton 80 .In Hoxa2 null mutants, cartilage and bone specification genes, such as Sox9 and CbfaI,respectively,are upregulated in a broader pattern 145 .Moreover, overexpression of Sox9 in the second arch can lead to ectopic cartilaginous elements similar to those observed in Hoxa2 mutants 145 . Recent studies have provided molecular clues as to how Hoxa2 regulates skeletogenesis in the pharyngeal arch environment. Hoxa2 locally represses the expression of first-arch-specific genes, such as Ptx1 and Lhx6,by participating in a pathway that antagonizes epithelial FGF signalling 83 . On the other hand, Hoxa2 positively regulates the second-arch-specific expression of Gsc 49,51 .The levels of Hoxa2 protein might modulate the competence of the cranial NCCs to respond to FGFs by locally regulating the balance between survival, proliferation and specification into a skeletogenic fate 82 .From these data, the emerging picture is that to select for hyoid-specific patterning, Hoxa2 would act not just as an inhibitor of skeletogenic fate, but as a spatial and temporal modulator of local proliferative versus differentiative responses of cranial NCCs to environmental signals.

Box 3 | Craniofacial defects Anomalies of the face and skull bones account for approximately one-third of all congenital defects. Some of them have been linked to distinct genetic disorders, and are either confined to the craniofacial region or occur in association with a set of abnormalities in other parts of the body. Other anomalies are caused by exposure of the embryo to teratogenic substances or environmental factors. Some craniofacial anomalies, including those described here, also involve abnormal development of the brain. These diseases generally consist of malformations of the cranial vault and/or the frontonasal process (reviewed in REFS 146,147 and references therein). Holoprosencephaly originates from an early disturbance of forebrain development, and encompasses a broad spectrum of phenotypes of variable severity, involving brain and facial malformations along the midline. The typical facial features include, in the most severe cases, short or absent nose, cleft upper lip, and a single central eye (cyclopia), often associated with the formation of an overlying proboscis. The brain is not subdivided into hemispheres and the olfactory bulbs are missing. Holoprosencephaly can be caused by genetic factors, including mutations of SHH, GLI2, PTCH, ZIC2, SIX3, CRIPTOand DHCR7,or by teratogens, such as alcohol or retinoic acid. Anencephaly is characterized by an open neural tube in the brain region, which results in exposure and degeneration of neural tissue and absence of the cranial vault. The cerebral hemispheres can be completely missing or reduced in size. The skeletal defects can extend to malformations of the skull floor and of the jaw and neck region. Encephalocele is a neural tube defect caused by a gap in the skull, which results in the protrusion of the meninges and brain tissue (herniation). It can occur in the occipital, parietal or frontonasal regions. Craniosynostosis is defined as early closure of one or more of the cranial sutures. The brain is forced to grow in directions where the bone is not resisting, often resulting in multiple neurological defects. The symptoms of craniosynostosis depend on which, and how many, cranial sutures are involved. The symptoms range from aesthetic concerns to seizures, blindness, developmental delay and mental retardation. There are more than 100 syndromes associated with craniosynostosis, including Apert, Crouzon, Pfeiffer and Saethre–Chotzen syndromes. Familial cases of craniosynostosis are associated with mutations in FGF receptor genes (FGFR1, 2, 3), TWIST and MSX2.



Links

DATABASES
LocusLink: bapx1 | Bmp4 | dHand | Dlx1 | Dlx2 | Dlx3 | DLX3 | Dlx5 | Dlx6 | eHand | Eta | Et1 | Fgf2 | fgf3 | Fgf4 | Fgf8 | Fgfr1 | GLI2 | Gsc | hand2 | hoxa2 | Hoxa2 | Hoxa3 | Hoxa4 | hoxb2 | Hoxb2 | Hoxb4 | Hoxc4 | Hoxd4 | Lhx6 | Msx1 | Msx2 | Noggin | Otx2 | PTCH | Ptx1 | RAR | sef | Shh | SHH | SIX3 | Sox9 | sprouty | TWIST | ZIC2
ZFIN: sucker
OMIM: anencephaly | holoprosencephaly
Черепно-лицевой скелет покрывает мозг и органы чувств, и важен для функционирования пищеварительной и респираторной систем. Он происходит главным образом из нервного гребня – мигрирующей популяции клеток, отделившейся от нейроэпителия.
Краниальный нервный гребень (cranial neural crest) может использовать сходную с развивающейся нервной системой стратегию паттернирования, посредством которой сетевидная система позиционных ориентиров создается градиентами внеклеточных сигналов или морфогенов, а также их внутриклеточных молекулярных эффекторов.
Антеро-постериальная индивидуальность каждой субпопуляции клеток нервного гребня оказывает сильное влияние на развитие черепно-лицевого скелета. Вдоль этой оси позиционная идентичность клеток детерминируется избирательной экспрессией Hox генов. Dlx гены, вероятно, обеспечивают позиционно-тождественное расположение клеток вдоль дорсо-вентральной оси жаберных дуг (pharyngeal arches).
Долгое время велись споры о том, препаттернированы ли клетки нервного гребня или они обладают пластичностью. Скелетогенные клетки нервного гребня могут быть или необратимо фиксированы (предетерминированы) еще до своей миграции или могут сохранять выраженную пластичность до того, как достигнут своих окончательных мест расположения. Накопленные к настоящему времени данные указывают, что истина находится где-то посередине этих двух моделей.
Процессы, лежащие в основе морфогенеза черепно-лицевого скелета, регулируются эпителиально-мезенхимной двунаправленной перекрестной «наводкой» (cross-talk). Сигналы из эпителия запускают локальный ответ в лежащей ниже мезенхиме, которая, в свою очередь, инициирует программу дифференцировки и обратные сигналы в эпителий.
Градиент эндотелин -1 (endothelin-1) сигнализирования, диффундирующий из эпителия и мезодермы жаберной дуги, дает общие «инструкции» для костной дифференцировки и в зависимости от его концентрации осуществляется трансляция в морфогенетическую информацию, указывающую на пространственно-временное появление определенной кости.
Фактор роста фибробластов 8 (fibroblast growth factor 8, FGF8), экспрессирующийся в специфических областях лицевой и фарингеальной эктодермы, а также в энтодерме жаберного кармана (глоточного кармана, pharyngeal pouch), является ключевым фактором в выживаемости клеток нервного гребня. Он также может индуцировать экспрессию генов, контролирующих тканеспецифичную дифференцировку клеток нервного гребня.
Другие сигналы, включающие sonic hedgehog, retinoids и bone morphogenetic proteins, также играют важную роль в детерминации лицевых структур.
Крайне мало известно о временных параметрах для ключевых транскрипционных факторов в регуляции морфогенеза жаберных дуг. Временные параметры регулируемой инактивации позволили бы определить критический период действия транскрипционного фактора, необходимого для паттернирования краниальных клеток нервного гребня.
Важно также выстроить сигнальные механизмы, лежащие в основе эпителиально-мезенхимного взаимодействия во время клеточной дифференцировки и морфогенеза. Будущие исследования должны быть направлены на выявление изменений в структурной организации клеток нервного гребня на белковом уровне во время каждой стадии развития до тех пор, пока клетки не займут своего окончательного положения для формирования дефинитивной структуры.

Черепнолицевой скелет является сложной системой взаимосвязанных костей, правильное образование которых необходимо для собственно упаковки головного мозга и сенсорных органов и для нормального функционирования пищеварительного и дыхательного трактов. Он возникает в основном из наиболее универсальных типов клеток эмбриона — нейрального гребня1.
Нейральный гребень является популяцией миграторных клеток, отсоединившихся от эмбрионального нейрального эпителия. Виды позвоночных обладают разными паттернами эмиграции neural crest cell (NCC). Напр., у млекопитающих, NCCs начинают эмигрировать с верхушки или ‘гребня’ всё ещё открытых нейральных складок2, тогда как у птиц NCCs возникают только после закрытия нервной трубки3. NCCs подвергаются эпителиально-мезенхимному переходу и мигрируют прочь от нейрального эпителия в виде потоков в различные области эмбриона, где они вносят вклад в форирование различных структур1. Процесс индукции и миграции NCCs изучался очень активно4–6.
NCCs v/ дифференцироваться в большое количество клеточных типов, когда они достигают своего окончательного места предназначения1 (Табл. 1). Краниальные NCCs возникают из DIENCEPHALON, среднего и заднего мозга, в виде отдельной популяции. Они отличаются от клеток нейрального гребня туловища тем, что они обладают потенциалом дифференцироваться в хрящи, кости и соединительную ткань1,7,8 (Табл. 1; Рис. 1). Ростральные краниальные NCCs дают frontonasal скелет, тогда как более задние краниальные NCCs заполняют фарингеальные дуги — известные также как бранхиальные (жаберные) дуги у рыб и амфибий — где они формируют хрящи и кости челюстей, среднего уха и шеи1,7,9–11. Краниальные NCCs вносят также важные вклады в мембранозные кости свода черепа7,10,12,13 (Рис. 1). Недавние серии экспериментальных наблюдений у мышей, кур и рыбок данио возродили интерес к специфическим аспектам морфогенеза головы (REFS 14–16 и ссылки внутри).

Establishing spatial identity in cranial NCCs


Чтобы понять, как краниальные NCCs приобретают свои пространственные качественные особенности необходимо рассмотреть, как закладываются и интерпретируются пространственные координаты вдоль оси тела17,18. Краниальный нейральный гребень м. использовать сходную стратегию формирования паттерна, что и развивающаяся нервная система, причем решетко-образная система позиционных сигналов создается на базе градиентов внеклеточных сигналов или морфогенов и их внутриклеточных молекулярных эффекторов. В вентральной части спинного мозга, напр, градиент sonic hedgehog (Shh) возникает в FLOOR PLATE и в ответ на этот градиент клетки экспрессируют разные комбинации HOMEODOMAIN транскрипционных факторов, которые и предопределяют домены для, по крайней мере, 5 различных классов нейронов (см. REFS 19,20). вдоль anteroposterior (AP) оси зависимые от позиции качественные особенности детерминируются за счет гнездовой экспрессии др. классов гомеодоменовых факторов, Hox генов (BOX 1). Ранняя экспрессия Hox в нервной трубке регулируется с помощью градированной активности RETINOIC ACID (RA) и локальных источников ростовых факторов, таких как FIBROBLAST GROWTH FACTORS (FGFs) или WNT MOLECULES21–33. В заднем мозге, члены семейства Hox генов специфицируют AP особенности поперечных компартментов из родоначальных клеток, известные как RHOMBOMERES (R1–R7; Рис. 1) (см. REFS 34–36). В результате интеграции активностей гомеодоменовых эффекторов вдоль AP and dorsoventral (DV) осей, нейральные предшественники м. приобретать специфические программы развития. Сходным образом краниальные NCCs, которые колонизируют глоточные дуги, м. получать пространственную информацию, которая и будет предопределять их позиционные качественные особенности и ограничивать их онтогенетический потенциал.

Anteroposterior positional identity. NCCs, которые возникают в заднем мозге мигрируют отдельными потоками37–39, вызывая в результате перенос кода экспрессии Hox с AP оси нервной трубки на AP ось мезенхимы головы и глоточных дуг40,41. Однако, Hox код в NCCs не является простой репликой паттерна экспрессии в нервной трубке, а он м.б. респецифицирован в начале миграции42–44. Напр., экспрессия Hoxa2 в нервной трубке имеет своим передним пределом границу между R1 и R2, но NCCs, которые возникают из R2 и мигрируют в первую дугу лишены экспрессии Hox гена45,46 (Рис. 2). AP распределение паттернов экспрессии Hox в мезенхиме, произошедшей из NCC, является важным для детерминации качественных особенности фарингеальных дуг вдоль ростокаудальной оси. Это лучше всего иллюстрируется исходом целенаправленного мутагенеза Hoxa2 у мышей. Ослабление Hoxa2 ведет к тому, что вторая (гиоидная) дуга теряет свои качественные особенности — и вместо этого продуцирует свои собственные отличающиеся структуры, она подвергается гомеозисной трансформации в скелетные элементы первой (мандибулярной) дуги, хотя и с обратной полярностью47,48. Т.к. NCCs первой дуги лишены экспрессии Hox, то Hoxa2, по-видимому, накладывает характерный для второй дуги способ действия, на путь развития, характерный для первой дуги47. Роль Hoxa2 в качестве гена-селектора для развития воторой дуги подтверждена с помощью комплементарых gain-of-function экспериментов у эмбрионов кур и лягушек. Эктопическая экспрессия Hoxa2 ингибирует формирование структур первой дуги и вызывает в результате образование удвоенной серии элементов второй дуги49,50. Важно, что недавние нокаутные и по избыточной функции подходы у рыбок данио приводили к гомеозисныым трансформациям второй дуги в первую или первой во вторую, соотв., подтверждая консервацию роли Hoxa2 (REF. 51). Однако у рыбок данио hoxa2 действует, перекрываясь (redundantly) со своим паралогом hoxb2, и инактивация продуктов обоих генов необходима, чтобы вызывать гомеозисный фенотип. Напротив, нокаут Hoxb2 у мышей не обнаруживает какого-либо эффекта на формирование паттерна скелетных NCC52,53, даже в содружестве с мутацией Hoxa2 (F. M. R., неопубликовано). Это м.б. объяснено ранним подавлением экспрессии Hoxb2 в постмиграторных NCCs у мышей42, чего не происходит у рыбок данио51. Эти результаты подчеркивают важность учитывать регуляторные различия для генов Hox у разных видов позвоночных.
Функциональные инактивации Hox генов паралогов группы 1 и 3 (BOX 1) не вызывают четких гомеозисных трансформаций, а вместо этого продуцируют селективные делеции или уродства производных скелетных NCC второй дуги, или третьей и четвертой дуг, соотв.54–57. Это подтверждает важность потребности в Hox генах для формирования росторокаудального паттерна NCC. Более тяжелые фенотипы были получены у комаундных мутантов, опять же указывающие на частичное функциональное перекрывание (redundancy) Hox генов, а также на синергичную активность между членами-паралогами58–60.
Hox-негативные краниальные NCCs, которые расположены ростральнее второй дуги, специфицируются др. классами гомеодоменовых транскрипционных факторов. Otx2 экспрессируется в NCCs frontonasal области и NCCs первой дуги, которые возникают из среднего мозга61 (Рис. 2). Otx2-экспрессирующие NCCs из первой дуги формируют дистальные (вентральные) элементы челюстей, тогда как ромбомерные Otx2-негативные клетки вносят вклад в проаксимальные (дорсальные) части дуги. Соответственно, мутации Otx2 в основном затрагивают развитие фронтоназальных и дистальных мандибулярных элементов62. Заслуживает внимания то, что у мутантов Hoxa2, трансформация второй дуги в первую ограничивается проксимальными структурами47,48 , указывая тем самым, что дистальные структуры нуждаются в дополнительной AP спецификации Otx2. Качественные особенности каждой субпопуляции клеток нейрального гребня вдоль AP оказывают строгое влияние на развитие и сборку черепно-лицевого скелета. Клетки разного AP происхождения в целом не перемешиваются и хотя они м. вносить вклад в формирование одних и тех же струткур, они остаются разделёнными (segregated)63. Интересно бы посмотреть, участвует ли экспрессия HD транскрипционного фактора в поддержании популяций NCC сегрегированными.

Dorsoventral positional identity. Гены Dlx экспрессируются в виде паттерна гнёзд вдоль DV axis фарингеальных дуг (Рис. 2), это указывает на то, что они обеспечивают зависимые от положения качественные особенности NCCs вдоль этой оси (см. REF. 64). Это недавно подтверждено одновременным инактивированием генов Dlx5 и Dlx6 у мышей, которое приводило к гомеозисной DV трансформации. Вентральные элементы первой дуги трансформировались зеркально в дорсальные (максиллярные) элементы, давая мышей с двумя верхними челюстями, лицом др. к др, это указывает на лежащую в основе прирожденную тенденцию первой дуги формировать структуры, сходные с верхней челюстью65,66. Такой исход особенно важен в отношении эволюционных перспектив, т.к. м. говорить об атавистической форме симметричного рта у примитивных позвоночных65.
Dlx1 и Dlx2 экспрессируются гомогенно вдоль всей DV оси, при этом они избирательно контролируют формирование паттерна дорсальных старуктур фарингеальной дуги67,68. Возможно, что функция этих генов в вентральном домене супрессируется с помощью Dlx5 и Dlx6, чья экспрессия ограничена вентральными частями. Потеря экспрессии Dlx5/Dlx6 м. вызывать в вентральнйо части избыточную функцию Dlx1/Dlx2, это ведет к гомеозисной трансформации в дорсальные структуры. Интересно бы проверить, м. ли эктопическая экспрессия Dlx5/Dlx6 в дорсальной половине первой дуги оказаться достаточной, чтобы генерировать обратный гомеозисный фенотип, а именно, трансформировать верхнюю челюсть в нижнюю. По аналогии с моделью posterior prevalence функции Hox69 , которая утверждает, что экспрессируемые в задних частях Hox белки являются функционально доминирующими на теми, что экспрессируются более кпереди, тогда модель ‘ventral’ prevalence с участием Dlx генов м.бы оперировать вдоль DV оси фарингеальной дуги.
Законсервированная регуляция паралогичной пары Dlx3 и Dlx7 в наиболее дистальных кончиках фарингеальных дуг указывает на то, что эти гены м. вносить вклад в респецификацию вентральных элементов70, хотя роль их в обеспечении DV positional identity все ещё под вопросом. Интересны серии черепнолицевых нарушений, наблюдаемые у людей, несущих мутаций DLX371. Из-за ранней летальности мутантов Dlx3 мыши72, необходима стратегия conditional мутагенеза, чтобы выявить в точности потребность в этих генах при формировании паттерна NCC.

Integrating anteroposterior and dorsoventral cues. AP позиционные адреса и Hox коды, по-видимому, создаются на премиграторных стадиях в NCC11,46,73–76, тогда как Dlx коды и качественные особенности в зависимости от DV позиции, ао-видимому, устанавливаются позднее в условиях внутри фарингеальной дуги в ответ на поляризующие сигналы от окружающего эпителия. AP позиционные адреса обеспечиваются с помощью Hox генов, различаюащих качественные сегментные особенности каждой дуги от их соседей, тогда как Dlx-обеспечиваемое формирование DV паттерна оперирует внутри каждой дуги, не затрагивая AP сегментные качественные осбенности. Интересные параллели вырисовываются с механизмами формирования AP и DV паттерна в заднем мозге, где AP и DV пространственные координаты закладываются независимо и последовательно, с DV позиционными значениями всё ещё лабильными, в то время как AP значения фиксированы77.
После тогоа как позиционные значения AP и DV установлены, то молекулярная информация, распространяемая в их подразделах, конвертируется в программы дифференцировки NCC, которые являются специфическими для кажого осевого уровня. М. предположить, что третьего измерения информация обеспечивается вдоль медиолатеральной оси фарингеальных дуг, хотя имеется мало доказательств дифференциальной экспрессии генов вдоль этой оси. В настоящее время предполагается, что сигналы от подлежащей энтодермы и/или аксиальной мезодермы вносят вклад в индукцию срединной линии или латеральных структур.

NCC prepatterning versus plasticity


Давно дебатируется вопрос о формировании препатерна краниальных NCC в противопложность пластичности. Существуют два крайних мнения — скелетогенные NCCs д.б. необратимо детерминированы (committed) прежде чем они мигрируют в фарингеальные дуги или что они не получают паттерн-формирующей информации в нервной трубке и сохраняют широкую пластичность вплодь до достижения ими своего финального места предназначения. Накапливаются доказательства, подкрепляющие обе эти модели, и, по-видимому, правда находится где-то между. Существенное влияние оказывают классические эксперименты по трансплантациям нейрального гребня у эмбрионов птиц Noden в 1980s11. Noden постулирует, что краниальные NCCs являются “specified with respect to their morphogenetic potential prior to their leaving the neural tube”11. С др. стороны, он также подчеркивает, что формированияе паттерна NCC-производных компонентов дуг “is the result of a series of interactions between the crest population and the surrounding tissue”11. Более 10 последующих лет морфогенетическая информация, переносимая клетками краниального нейрального гребня изучалась на различных моделях позвоночных, включая мышей, кур и рыбок данио. Эти исследования привели в результате к контрастирующим интерпретациям (см. REFS 41,44,78) (Рис. 3 и 4). Чтобы прояснить ситуацию, необходимо пересмотреть и попытаться интегрировать результаты. Первым важным вопросом является степень компетентности краниальных NCCs, чтобы давать специфичные для дуг скелетные элементы в соответствии с их Hox кодом. Hox-негативные и Hox-экспрессирующие NCCs отличаются по своей компетентности формировать скелетные производыне фарингеальных дуг. Hox-негативные NCCs обладают широким потенциалом давать весь frontonasal и лицевой скелеты79. Напротив, экспрессия Hox, как было показано, несовместима с генерацией скелетных производныхпервой дуги74,80. Тем не менее Hox-экспрессирующие NCCs необходимы для генарации производных второй и более задних дуг47,48,54–60,81. Итак, премиграторные Hox коды, по-видимому, ограничены скелетогенным потенциалом NCCs, но возможна модуляция реакции краниальных NCCs на скелетогенные сигналы в среде фарингеальных дуг82,83 (BOX 2).

Hox-expressing NCCs. Хотя приведенные выше наблюдения и являются доказательством препатернирования, однако мигрирующие Hox-экспрессирующие NCCs м. и не быть детерминированы необратимо. Если Hox код м.б. нарушен с помощью новой среды, тоprepatterning информация м.б. изменена. Во время миграции NCC экспрессия Hox генов поддерживается в окружающих условиях, и на уровне нервной трубки, где клетки возникают, и в фарингеальных дугах, где они дифференцируются. Мезодермальный компонент дуг играет роль в поддержании экспрессии Hox генов84 и в эффектах клеточных сообществ (community)85 это также, по-видимому, важно84. Если индивидуальные Hox-экспрессирующие NCCs переносятся в Hox-негативную среду, то они теряют свои Hox коды и репрограммируются. Однако, если большой блок клеток переносится в эктопическое место, то исходный Hox код сохраняется, указывая тем самым, что общение между подобными клетками рнеобходимо для сохранения их идентичности46,74,84,86.
Достаточно ли Hox-экспрессирующих условий, чтобы индуцировать экспрессию Hox в Hox-негативных NCCs, зависит от экспериментальных условий46,74–76,84,86. В экспериментах Noden’s трансплантации Hox-негативных нейральных складок в проспективную премиграторную область второй дуги эмбрионов кур вызывали удвоения элементов челюстей на месте производных гиоидной дуги, сходных с теми. что наблюдалист при целенаправленной инактивации Hoxa2 у мышей11,47,48,74. Однако, как было недавно показано, эти трансформации генерируются только тогда, когда тканть из Fgf8-экспрессирующего перешейка (isthmus) на границе между средним и задним мозгом трансплантировалась вместе с премиограторными предшественниками NCC76 (Рис. 3). Fgf8 обладает активностью24, заставляющей молчать Hoxa2, и он м. репрессировать экспрессию Hoxa2 в NCCs, которая м. возникнуть в области, окружающей трансплантат, в результате чего и приобретается эктопическая судьба первой дуги. В сходном эксперименте, где трансплантация не сопровождалась переносом ткани перешейка, возникал склет обычной второй дуги76. Важно уяснить, м. ли эксперссия Hoxa2 быть индуцирована в Hox-негативных трансплантированных клетках в тких условиях.
Эти результаты вместе с исходами от нокаута Hoxa2 у мышей показывают, что экспрессия Hoxa2 в NCCs необходима для формирования паттерна гиоидных скелетных элементов. Соответственно, избирательная делеция Hoxa2 в предшественниках NCC воспроизводит те же самые гомеозисные трансформации, что и полная инактивация Hoxa2 у мышей (S.-Y. Ren, M. Pasqualetti & F. M. R., неопубл.). Но достаточно ли экспрессии Hoxa2 в Hox-негативных NCCs для обеспечения формирования паттерна второй дуги? Избыточная экспрессия Hoxa2 в презумптивных NCCs первой дуги не вызывает трансформаций первой дуги во вторую49,80 незавимимо от того, индуцируется ли Hoxa2 в тканях, окружающих NCCs49,50. Итак, Hox-экспрессируемые совместимые условия необходимы для развития Hox-экспрессирующих NCCs. Мезодерма фарингеальных дуг лишена экспрессии Hox, но эктодерма второй и последующих фарингеальных дуг экспрессирует Hox гены40, в дополнение к нервной трубке и регуляция этой экспрессии не зависит от NCC мезенхимы74. Итак, Hox-зависимые сигналы от эктодермы и/или нейроэктодермы м. вносить вклад в формирование паттерна NCC мезенхимы второй и последующих дуг.

Hox-negative NCCs. Сколько внутренне присущей морфогенетической иинформации несут Hox-негативные NCCs, которые вносят вклад в frontonasal и лицевой скелет, и сколько паттерн-формирующей информации они воспринимают от среды головы или фариногеальной дуги? Большинство экспериментальных данных заставлдяют пересмотреть инструктивную роль эпителиальных тканей в индукции мезенхимных выростов и в морфогенезе этой популяции из NCC. Сигнальные молекулы от покрывающей эктодермы — включая FGFs, BONE MORPHO-GENETIC PROTEINS (BMPs) и Shh — совершенно необходимы для образования максиллярных и фронтоназальных скелетных элементов, также как и для зубов и фарингеальных дуг (Рис. 5). Эти процессы серьезно ограничиваются мутациями или манипуляциями, которые затрагивают передачу сигналов от эктодермы, а в более крайних случаях, сообщается о тотальной потере производных нейрального гребня87,88. Однако, эти данные выявляют потребность в эктодермальном вкладе в пролиферацию и/или дифференцировку NCC скореее, чем в формирование паттерна. В недавнем исследовании Hu et al. идентифицировали polarizing zone — frontonasal ectodermal zone (FEZ) — в эктодерме, которая лежит поверх frontonasal process (FNP) эмбрионов кур. FEZ не только ориентирует DV ось максиллярного выроста, но также индуцирует эктопическую верхнюю часть клюва, когда трансплантируется в другую область FNP89(Рис. 4). Эта работа выявляет доминантную паттерн-формирующую роль эктодермы над NCC мезенхимой в спецификации лицевых структур. Было также показано, что удаление полоски энтодермы передней кишки у эмбрионов кур предупреждает развитие лицевой кости в соседней NCC мезенхиме79. Некоторые мутанты рыбок данио обнаруживают неспособность формировать вентральную часть скелета головы в результате уменьшения или отсутствия энтодермы90. Более того, Couly et al. показали, что энтодерма не просто выполняет поддерживающую функцию для развития лицевого и висцерального скелета, но и что она играет реальную паттерн-формирующую роль во время морфогенеза. Специфические трансплантированные порции энтодермальной ткани эмбрионов кур м. индуцировать образование сверхчисленных элементов челюстей и м. даже детерминировать их положение и ориентацию79(Рис. 4).
Эти наблюдения, по-видимому, указывают на полное согласие Hox-негативных скелетогенных NCCs с паттерн-формирующими сигналами от соседнего эпителия. Однако, др. экспериментальные доказательства ставят под сомнение эту точку зрения об абсолютной пластичности и указывают на то, что Hox-негативные NCCs имеют более инструктивную функцию в черепнолдицевом развитии. Schneider and Helms показали, что когда предшественников краниального нейрального гребня из области презумптивного клюва эмбрионов перепела и уток обменивали, то появлялись гибридные формы уток с клювами перепела и перепела с клювами уток91(Рис. 4). Донорские NCCs обеспечивали паттерн-формирующими инструкциями морфогенез клюва в среде хозяина, указывая тем самым что они несут некоторую внутренне присущую им, независимую морфогенетическую информацию. Более того, NCCs м. влиять на молекулярную активность соседней эктодермы хозяина, указывая тем самым на обратные иерархические взаимоотношения менжду эпителиальной и мезенхимной тканью.
Как же примирить столь контрастирующие результаты? Необходимо отметить, что паттерн-формирующая активность FEZ эктодермы или энтодермы передней кишки ограничена и что она зависит от специфической NCC популяции, с которой они взаимодействуют вдоль AP оси. Трансплантаты задней гетеротопической эктодермы или энтодемы не меняют судьбы Hox-экспрессирующей NCC мезенхимы, указывая тем самым, что эктопические эпителиальные сигналы не м. превалировать над внутренне присущим Hox-обусловленном NCC prepatterning79,89. Более того, когда FEZ трансплантируется на мезенхиму первой мандибулярной дуги, то формируется добавочная нижняя часть клюва — а не эктопическая верхняя часть клюва89. Couly et al. описали удвоения клюва только после имплантации дополнительных полосок энтодермы ниже или вокруг позиции, которая соответствует их исходному AP аксиальному уровню79. эти находки указывают на то, что эпителием обусловленные паттерн-форимрующие инструкции не являются абсолютными, а интерпретирубются NCCs в соответствии с их относительно AP позиционной идентичностью.

Epithelial–mesenchymal cross-talk. Процессы, которые лажат в основе морфогенеза черепнолицевого скелета , следовательно, регулируются эпителиально-мезенхимными двунаправленными переговорами, которые характеризуются попеременно управляющей активностью (alternating ruling activity). Развитие зубов является прекрасной моделью такого механизма. Первоначально сигналы от эпителия запускают локальный ответ в подлежащей мезенхиме. В свою очередь, последняя инициирует соответствующую программу дифференцировки и передает сигналы обратно в эпителий, предписывая специфические инструкции для морфогенеза зубов (см. REF. 92). Трансплантанты нейрального гребня от эмбрионов мыши к эмбриона кур показали, что мышиная NCC меззенхима м. способствовать развитию зубов у кур-хозяев93, указывая тем самым, что эпителий обеспечивает общие сигналы, которые запускают программы морфогенеза зубов, но которые интерпретируются в соответствии с происхождением NCCs.
Итак, хотя краниальная NCC мезенхима постоянно подпитывается AP-ограниченным препаттерном для образования скелетных элементов, она также нуждается в индуцирующих сигналах от окружающего эпителия, чтобы получить информацию о положении и ориентации структуры, которая будет создана. Пространстввенная организация и аксиальная полярность фарингеальных дуг предопределяется независимо от вклада NCC94, но однажды пространсвенная инфофрмация оказывается переданной с помощью эпиталаиально-мезенхимной передачи сигналов и NCC мезенхима принимает на себя ведущую роль и продолжает процесс морфогенеза на базе своего собственного потенциала. Мезенхима прогрессивно теряет свою способность отвечать на эпителиальные сигналы и вступает на независимый путь развития95.

Pharyngeal arch morphogenesis


Чтобы полностью понять, как различные ткани и популяции клеток внросят свой вклад в формирование паттерна и морфогенез черепнолицевых структур, необходимао идентифицировать участвующие молекулярные факторы. Достигнут определенный успех в поиске генов, которые участвуют черепнолицевом развитии15,96–99(Рис. 5 and BOX 2).

Endothelin-1 signalling. Мутант sucker рыбок данио представляет собой интересный пример того, как пространственная информация, обеспечиваемая локально секретируемыми сигнальными фактрами, м. модулировать морфогенез произвожных NCC. Мутанты sucker дефектны по секретируемому пептиду endothelin-1 (Et1) и обнаруживают нарушение развития вентральных элементов фарингеальных дуг100. Вентрализующий градиент передачи сигналов Et1, который диффундирует от эпителия и мезодермы фарингеальных дуг направляется к NCC мезенхиме, где формируются специфические скелетные элементы вдоль DV оси100–103 (Рис. 5). Разные уровни сигнала интерпретируются NCCs так, что инструкции производят разные элементы — во второй дуге, высокая концентрация Et1 индуцирует образование вентральнs[ кожнs[ косточtr (branchiostegal rays), тогда как низкая концентрация Et1 специфицирует дорсальные косточки (the opercles). Градированное ингибирование экспрессии Et1 обусловливает разные эффекты, изменяющиеся от потери вентральных косточек и соответствующей экспаансии opercles, до полной потери или редукции всех косточек102.
Это указывает на то, что Et1 обеспечивает общими инструкциями дифференцировку косточек, а ранги его концентрации переводятся в морфогенетическую информацию, которая показывает, какая косточка будет сделана. Концентрационный градиент Et1 участвует также в спецификации хряща100 и в формировании суставав103 в висцеральном скелете. В промежуточных DV месторасположниях низкие уровни Et1 достаточны, чтобы активировать ген транскрипционного фактора bapx1, который регулирует экспрессию генов, специфицирующих суставы. Вентрально, высокие урони Et1 включают экспрессию гена BASIC HELIX–LOOP–HELIX (bHLH) транскрипционого фактора hand2, который репрессирует bapx1 и является необходимым для формирования фарингеального хряща. И как результат клетки, предназначенные для образования сустава (позитивные по bapx1) располагаются в промежуточной позиции, где должен сформироваться сустав103. Передача сигналов Et1 играет также ключевую роль в формировании вентрального паттерна первой и второй дуг млекопитающихи птиц104–107. Et1 и его рецептор Eta (a G-protein-coupled рецептор108) экспрессируются в фарингеальном эпителии и мезодерме, а также в NCC мезенхиме, соотв.105,106. Ген bHLH транскрипционого фактора dHand (ортолог hand2 рыбок данио) и родственный ген eHand являются нижестоящими эффекторами Et1 в NCCs109,110. dHand контролирует экспрессию HD транскрипционного фактора Msx1, a полное прерывание этого молекулярного пути вызывает неспособность к росту фарингеальных дуг в результате апоптоза111. Dlx6, как было показано, обеспечивает Et1-зависимую активацию dHand в вентральной половивне дуг110,112. это согласуется с предполагаемой вентрализующей активностью передачи сигналов Et1. Однако, мутации Et1 и Eta у мышей также обнаруживают слабые эффекты в дорсальной области фарингеальных дуг104,105, это указывает на то, что DV градиент endothelin м. индуцировать и дорсальные структуры при низких коанцентрациях и вентральные структуры при высоких концентрациях.

FGF signalling. Множество разных FGF молекул испускается лицевым эпителием113. Fgf8, который экспрессируется в специфических областях лицевой и фарингеальной эктодермы, а также в энтодерме фарингеальных карманов, является ключевым фактором жизнеспособности NCC88,114. Условная инактивация Fgf8 в эктодерме первой дуги ведет к апоптозу больших порций NCC мезенхимы и соответственно к неспособности развития лицевого скелета88. Однако, Fgf8 по-видимому, является не больше чем простым фактором выживания, т.к. он м. также индуцировать экспрессию генов, которые ответственны за ткане-специфическую дифференцировку NCC95,115,116. Эта функция ассоциирует со способностью детерминировать полярность фарингеальных дуг. В первой дуге, ростральный (ротовой) полюс, который формирует зубы, м.б. отличён от каудального (aboral) полюса, который будет формировать скелет челюсти. Передача сигналов Fgf8 от рострального эпителия, как было показано, отвечает за спецификацию oral–aboral полярности116, a его поляризующая активность сопровождается градиентом передаваемого сигнала вдоль AP оси, сразу после того как градиент Et1 специфицирует DV ось. Высокие концентрации Fgf8 индуцируют ростральную экспрессию генов Lhx транскрипционных факторов, а низкие концентрации индуцируют каудальную экспрессию гена транскрипционного фактора goosecoid (Gsc)116,117. Интересно, что Gsc также является нижестоящим в сигнальном пути Et1105,109. Целанаправленная инактивация Gsc у мышей показывает, что он необходим для черепнолицевого хорндрогенеза118,119.
Схродные мехнизмы, по-ви димому, устанавливают и AP полярность более задних дуг. Когда индуцируются forward и reverse гомеозисные трансформации с помощью Hoxa2 за счет потери- или избыточности-функции у мышей, кур и рыбок данио, то дуплицированные элементы затронутых дуг всегда выглядят как зеркальное отражение своих orthotopic дупликатов, указывая на инвертированную полярность первой и второй дуг. Это м. указывать на присутствие градированного паттерн-форимрующего сигнала, который возникает на границе между двумя дугами и оперирует двунаправленно47,50. Fgf8 является предполагаемым кандидатом, принмая во внимание его экспрессию в энтодерме глоточных карманов и в эктодерме фарингеальной щели между первой и второй фарингеальной дугой120,121(Рис. 5). Датальное исследование развития второй дуги у мутантных мышей, несущих CRE RECOMBINASE-обусловленные делеции Fgf8 в эпителии дуг, м. предоставить больше информации.
Fgf8 маркирует область проспективной оральной эктодермы пержде, чем будет вычлена ротовая полость и прежде чем мезэнцефалический поток NCC достигнет оральной мезенхимы121. Fgf8 домен вычленяется с помощью др. гена сигнального фактора, Bmp4, который экспрессируется по обеим сторонам в соседней эктодерме (Рис. 5). Fgf8 и Bmp4 характеризуют входящую мезенхиму за счёт индукции экспрессии специфических паттерн-формирующих генов. NCCs обладают широкой пластичностью в ответ на этого типа позиционные сигналы; напр., расширениеe Fgf8-позитивнвой эктодермы перед миграцией NCC увеличивает область рта за счёт премандибулярной области. Напротив, ингибирование ранней эктодермальной экспрессии Fgf8 за счёт эктопического действия Bmp4 вызывает потерю структур челюстей121,122. Роль эктодермального Fgf8, по-видимому, органичена инициальной индукцией генов-мишеней — их поддержание не зависит от Fgf8, и, по-видимому. внутренне присуще NCCs95,123.
Члены семейства FGF также вовлекаются в передачу сигналов от фарингеальной энтодермы. У рыбок данио потеря экспрессии fgf3 в глоточных карманах дает в результате раннюю апоптическую элиминацию NCCs задних частей дуг90 , а неспособность поддерживать экспрессию fgf3 на поздних стадиях ведёт к тяжелой гипоплазии хрящевых элементов задних частей дуг124. Временная регуляция активности Fgf3 м. представлять собой механизм для создания полярности структур внутри дуг124. Продолжительность сигнала м. непосредственно влиять на размер определенного элемента. Затем взаимодействие между FGF и паттернирующей активностью молекул FGF антогонистов, подобно членам семейств sef или sprouty125, м. влиять на форму хрящей путём управления выживаемости специфических субпопуляций NCC в ответ на FGF, или путём запуска сигналов гибели через элиминацию активности FGF. Передача сигналов FGF м. также влиять на судьбу краниальных NCC путём проведения сигналов к их host среде. У мутантных FGF receptor 1 (Fgfr1) мышей просаективные NCCs второй дуги неспособны вступать в дугу во время миграции и они накапливаются в области проксимальнее дуги126.
Этот дефект не устраняется селективной экспрессией Fgfr1 в NCCs, это указывает на то, что Fgfr1 влияет на вхождение NCCs во вторую дугу путём создания пермиссивных условий для их миграции. Существенно, что дефект миграции селективно затрагивает NCCs второй дуги. Итак, специфические комбинации FGF и/или FGFR молекул м.б. использованы в организации совместимости данной дуги с позиционно направляемым потоком NCCs, возможно на базе их Hox кода.
Помимо их роли в качестве факторов виживаемости, установлено, что FGF молекулы м. регулировать дифференцировку NCCs дозово-зависимым образом. Напр., низкие концентрации Fgf2 добавленные к культивируемым краниальным NCCs поддерживают жизнеспособность клеток, тогда как высокие концентрации индуцируют дифференцировку хрящей и костей82,127. М. предположить, что сходные зависимые от концентрации реакции NCCs происходят и в фарингеальных дугах, где пространственно-временной градиент сигналов FGF от эпителия м.вносить вклад в сайт-специфическое образование хрящевых агрегатов. В самом деле, было показано. что Fgf2 и Fgf4 м. способствовать образованию хрящевых элементов в эктопических местах128.

Other signals. FGFs оперируют в комбинации с др. сигнальными молекулами. Во фронтоназальной эктодерме FEZ идентифицируется с помощью находящихся рядом областей dorsal Fgf8 и ventral Shh экспрессии89, a в месте взаимодействия между этими двумя сигнальными факторами, мезенхима нейрального гребня получает паттерн-формирующие инструкции для вырастания FNP. Устранение Shh-экспрессирующей эктодермы ведет к неспособности развития FNP, тогда как аппликация Shh-экспрессирующих фибробластов к FNP индуцирует эктопическую верхнюю часть клюва у кур129. Экспресссия Shh и Fgf8 поддерживается с помощью передачи сигналов эндогенных ретиноидов87. Ингибирование передачи сигналов ретиноидов с помощью синтетических антогонистов retinoic acid receptor (RAR)87, с помощью нокаута RA-синтезирующего энзима Raldh2 (REF. 130) или с помощью соединений, нацеленных на инактивацию Rar β(и Rar γ )131 ведет к полной или частичной потере структур, происходящих из FNP.
BMPs также играет важную роль в спецификации лицевых структур15,132,133. Максиллярные отростки, которые распространяются вентролатерально с обоих сторон от FNP и сливаются по срединной линии, чтобы сформировать половинки нёба, специфицируются с помощью экспрессии BMP. Если действие BMP блокировано воздействием специфического ингибитора Noggin то при последующем воздействии RA максиллярные отростки трансформируются в дополнительные FNPs133. Скелетные структуры, происходящие из др. лицевых выпячиваний не удваиваются, так что молекулы BMP м. оказыватьt регион- и стадио-зависимые эффекты на морфогенез верхней и нижней челюсти15,134, частично благодаря антогонистическим взаимодействиям с молекулами FGF122,134,135. Рано в развитии мандибулярная мезенхима, по-видимому, находится под балансирующим влиянием сигналов к гибели и выживанию, продуцируемых в результате экспрессии эктодермой BMPs и FGFs, соотв.134, Тогда как на более поздних стадиях, BMPs способствует дифференцировке мезенхимы в хрящи и кости135,136. BMPs, по-видимому, выполняют различные роли за счёт регулирования генов с оппозитными функциями, такие как Msx1, Msx2 и Sox9 (REFS 121,135,136). Sox9 является известным регулятором образования хряща137,138,тогда как Msx1 и Msx2 рассматриваются обычно как негативные регуляторы дифференцировки и участвуют в апоптозе139,140. Мутации в этих генах затрагивают нормальное развитие скелетных структур головы у мышей и людей141–144.

Conclusions and perspectives


The building of the vertebrate head is an example of a morphogenetic process that relies on a complex series of interactions between molecules and tissues. Some of these interactions have been conserved through millions of years of evolution, whereas others are peculiar to dis-tinct species, generating a fascinating variety of facial morphologies. Facial anomalies often correlate with brain malformations (BOX 3) and, in some cases, disrup-tion of common signalling pathways is involved 87 .So, craniofacial development is of considerable interest from both neurobiological and clinical perspectives. What are the next important questions to be addressed by research into craniofacial development? Full comprehension of this process will rely on a com-plete dissection of the underlying molecular processes. Several important issues are still unexplored with respect to the molecular mechanisms of patterning and specification of skeletogenic NCCs. For instance, very little is known about the temporal requirement for key HD transcription factors (for example, Hox and Dlx) in the regulation of pharyngeal arch morphogenesis. Their expression is maintained up to late stages of cranio-facial development 50,64,145 ,indicating that they might be involved in regulating the size and shape of skeletal structures. By using available knockout technologies in the mouse, temporally regulated inactivation will allow us to define the critical time window of HD factor function that is necessary for cranial NCC patterning. In addition, the analysis of conditional tissue-specific HD factor mutants will allow us to dissect their specific roles in the distinct tissues where they are expressed, includ-ing the NCCs, the neuroectoderm and the surface ectoderm of the pharyngeal arches. Analysis of com-pound mutants might reveal a requirement for genetic interaction of HD factors in NCC patterning. Another important question is how NCCs interpret and integrate the multiple extracellular signals that are present in the arch environment, so that they are specified in the correct proportions. It will be necessary to define the control elements that direct the spatiotemporal regulation of HD factors in NCCs in response to specific signalling molecules. This approach will provide insights into the regulatory cascade that is required for spatially and temporally restricted HD factor activity. In addition, recent work has drawn attention to the importance of searching for target genes and under-standing how they integrate into functional networks, so that we can reconstitute the signalling mechanisms that underlie epithelial–mesenchymal interactions during cellular differentiation and morphogenesis. Integration of the molecular data will provide impor-tant insights into the morphogenetic programme for skeletogenic NCCs. Eventually, this research should reveal how the structural organization of the NCCs at the protein level changes at each stage of development, until the cells finally settle to form a definite structure. Large-scale mutant analysis in zebrafish and targeted mutagenesis in the mouse are proving to be valuable approaches for identifying new genes and elucidating the regulatory relationships between them 6 .Grafting and recombination experiments that take advantage of the accessibility of other embryonic systems will also continue to be instrumental in unravelling the cell and tissue interactions that are involved in craniofacial development. We anticipate that future research into this matter will be an exceptionally demanding but ultimately rewarding task.
Сайт создан в системе uCoz