CHROMATIN MODIFICATION AND EPIGENETIC REPROGRAMMING IN
MAMMALIAN DEVELOPMENT
En Li (en@cvrc.mgh.harvard.edu) Nature Reviews Genetics 2002 Vol 3 No 9
The developmental programme of embryogenesis is controlled by both genetic and epigenetic mechanisms. An emerging theme from recent studies is that the regulation of higher-order chromatin structures by DNA methylation and histone modification is crucial for genome reprogramming during early embryogenesis and gametogenesis, and for tissue-specific gene expression and global gene silencing. Disruptions to chromatin modification can lead to the dysregulation of developmental processes, such as X-chromosome inactivation and genomic imprinting, and to various diseases. Understanding the process of epigenetic reprogramming in development is important for studies of cloning and the clinical application of stem-cell therapy.
(Рис.1.) | Links between DNA methylation, histone modification and chromatin remodelling.
(Рис.2.) | Epigenetic reprogramming during gametogenesis.
(Рис.3.) | DNA-methylation reprogramming during early mouse development.
(Табл.1) Knockout mice with defective chromatin modification
Box 1 | Components of the main chromatin-modification and -remodelling complexes
DNA cytosine methyltransferases
Three active DNA cytosine methyltransferases — Dnmt1, Dnmt3a and
Dnmt3b — have been identified in mammals. They contain
characteristic and highly conserved cytosine-methyltransferase
motifs in the catalytic domain. Dnmt1 is ubiquitously expressed and
is a maintenance methyltransferase, which restores DNA-methylation
patterns by methylating hemi-methylated CpG sites (Рис. 1) after DNA replication. Dnmt3a and Dnmt3b are regulated during development and are required
to initiate de novo methylation and establish new
DNA-methylation patterns.
The activity and function of a putative cytosine methyltransferase —
Dnmt2 — remain undefined.
Methyl-CpG-binding proteins
Six methyl-CpG-binding proteins, including MECP2, MBD1, MBD2, MBD3, MBD4 and Kaiso, have been identified in mammals. MECP2 binds
methylated DNA in vitro and in vivo. It contains a
methyl-CpG-binding domain (MBD) at its amino terminus and a
transcription repression domain (TRD) in its middle. MBD1–4 were
cloned on the basis of their sequence homology to MECP2 in the MBD,
and all except MBD3 bind methyl CpG preferentially.
Xenopus MBD3 can bind methyl CpG.
MBD3 is an integral component of the Mi-2–NuRD complex (see
below).
MECP2, MBD1 and MBD2 function as transcription repressors. MBD4 is a
DNA glycosylase and is involved in DNA mismatch repair.
Kaiso, which lacks an MBD domain, binds methylated CGCG through its
zinc-finger domain.
Different methyl-CpG-binding proteins might recruit different
chromatin-remodelling proteins and transcription-regulatory
complexes to methylated DNA targets in the genome.
Histone-modification enzymes
The modification of core histones at their amino-terminal tails
by acetylation, phosphorylation, methylation and ubiquitylation has
a fundamental role in gene regulation. The combined acetylation,
phosphorylation and methylation status of the histone tails
determines gene activity.
Several classes of histone methyltransferases have been
identified
and five H3-K9 methyltransferases, Suv39h1 and Suv39h2 ,
G9a,
ESET/SetDB1
and Eu-HMTase1 .
Several transcription co-activators, such as Gcn5, p300/CBP, PCAF, TAF250 and the p160 family nuclear receptor, that have intrinsic
histone acetyltransferase (HAT) activity, and several histone
deacetylases (HDACs), have also been identified in mammalian
cells.
ATP-dependent remodelling complexes
Three classes of chromatin-remodelling protein complexes —
SWI/SNF/Brm, ISWI and Mi-2/NuRD — which are present in
mammalian cells, contain different catalytic ATPase subunits and
associated proteins.
Chromatin-remodelling enzymes use the energy of ATP hydrolysis to
introduce superhelical torsion into nucleosomal DNA, which leads to
the formation of nucleosomes that contain exposed DNA bulges or
loops.
Such transient conformational changes in nucleosomal DNA can alter
the accessibility of chromatin to various chromatin proteins that
control transcription, DNA replication, recombination and other
biological processes.
Хорошо известно, что ДНК являются основными компонентами хромосом, в которых спираль ДНК обвивается вокруг . чтобы сформировать простые 'beads on a string' структуры, которые затем склаыдваются с хроматин высшего порядка. Хроматин также содержит различные белки, которые необходимы для его сборки и упаковки и для репликации ДНК, модификаци и транскрипции ДНК и гистонов и для репарации и репликации ДНК. Хроматин не униформен в отношении распределения генов и транскрипционной активности. Он организован в домены, такие как и , которые имеют разную хромосомную архитектуру, транскрипционную активность и время репликации.
маркирование с помощью ковалентных модификаций ДНК и стержневых гистонов создает молекулярные ориентиры, которые делают различимым активный и неактивный хроматин. Гистоновые модификации, по-видимоу, универсальный регуляторный механизм среди эукариотических организмов от дрожжей до человека. ДНК метилирование, однако, менее законсервировано.
Принципиальные эпигенетические механизмы, с помощью которых тканеспецифические паттерны экспрессии генов и глобальное молчание генов устанавливаются и поддерживаются, это и .
The interplay of epigenetic regulators
Ковалентные модификации ДНК и стержневых гистонов и АТФ-зависимое ремоделирование хроматина являются важными в регуляции экспресссии генов, ДНК репликации и многих др. биологических процессов. Белки, которые участвуют в таких модификациях и ремоделировании хроматина приведены в Box 1. Растут доказательства, что эти общие модификации хроматина и хроматин-ремоделирующие белки не действуют сами по себе, а взаимодействуют с др., часто формируя большие белковые комплексы, которые регулируют структуры хроматина высшего порядка и доступность хроматина для различных факторов (Рис. 1).Стабильное наследование хроматиновых структур и изменения их доступности важны для всех ассоциированных с хроматином биологических процессов.
ДНК метилирование и модификации гистонов служат в качестве эпитегенетичеких маркеров активного и неактивного хроматина и как эпигенетические маркеры они наследуемы. В клетках млекопитающих метилирование ДНК происходит преимущественно в CpG динуклеотидах и это катализируется двумя важными классами ДНК methyltransferases (Box
1). DNA methyltransferase 1 () является энзимом поддержания, который метилирует полу-метилированные CpG динуклеотиды в только что возникшей нити ДНК после репликации, ее функция существенна для поддержания паттернов метилирования ДНКв пролиферирующих клетках. and необходимы для инициации de novo метилиования in vivo и для установления новых паттернов метилирования ДНК во время развития. И Dnmt1 и Dnmt3a взаимодействуют с histone deacetylases (HDACs) и м. репрессировать транскрипцию.
ДНК метилирование регулирует экспрессию генов с помощью нескольких отличающихся механизмов. Метилирование ДНК м. непосредственно блокировать транскрипцию регуляторных факторов от связывания с их последовательностями-мишенями, хотя такой механизм регуляции in vivo относительно редок. Известно, что гены, которые кодируют glial fibrillary acidic protein () активируются во время дифференцировки астроцитов благодаря деметилированию CpG динуклеотидов, которые расположены в области их промотора для (signal transducer and activator of transcription 3)-связывающего элемента. Метилирование ДНК м. также репрессировать экспрессию генов посредством некоторых methyl-CpG-binding proteins (MECPs), которые 'считывают' паттерны метилирования ДНК (Box 1). Напр., образует комплекс с HDACs и ко-репрессорным белком, , чтобы репрессировать транскрипцию зависимым от метилирования образом. Др methyl-CpG-binding белок формирует комплекс с мультиединичным комплексом NuRD, который содержит ATФ-зависимый хроматин-ремодулирующий белок , и HDACs. Комплекс MBD2–NuRD (ранее известный как MeCP1) м. репрессировать метилированные промоторы и ремоделировать метилированный хроматин с высокой эффективностью. MECP2– Sin3a–HDAC и MBD2–NuRD комплексы обеспечивают механистическую связь между гиперметилированием ДНК и деацетилированием гистонов при транскрипциональной репрессии. Однако, известно, что метилирование ДНК не всегда ассоциирует с молчанием генов. Показано, что меилирование ДНК м. усиливать экспрессию insulin-like growth factor 2 (), блокируя связывание репрессорных белков с сайленсерным (silencer) элементом в гене.
Модификация стержневых гистонов по lysine, arginine и serine остаткам, которые расположены на их N-терминальных хвостах, еще более сложная с вовлечением многих гистон-модифицирующих энзимов (Box 1). Напр., Lys9, 14, 18 и 23 в H3 и Lys5, 8, 12 и 16 в H4, вместе с lysines в H2A и H2B, м.б. ацетилированы; тогда как Lys4, 9 и 27, Arg2, 17 и 26 в H3, и Lys20 и Arg3 в H4 м.б. метилированы. Ацетилирование и деацетилирование гистонов определяет транскрипционную активность хроматина. Выявляется носаф роль метилирования гистонов в эпигенетической регуляции и во взаимодействиях между метилированием ДНК и метилированием гистонов.
Метилирование Lys4 в H3 (H3-K4) ассоциирует с экспрессией активных генов, тогда как метилирование Lys9 в H3 (H3-K9) ассоциирует с транскрипционным молчанием. Связь между метилированием ДНК и метилированием гистонов впервые установлена уфиламентозного грибка Neurospora crassa, у которого было показано, что мутации
dim-5 (defective in methylation 5) гена, который кодирует -содержащую H3-K9 methyltransferase, вызывают полную потерю всех форм метилирования ДНК. Сходные наблюдения у Arabidoposis thaliana, у которой мутации по H3-K9 methyltransferase (кодируемой kryptonite) устраняют метилирование CpNpG сайтов, но не CpG сайтов. Показано, что метилирование гистонов м. регулировать метилирование ДНК у Arabidopsis посредством и рекрутирует ДНК метилтрансферазу Cmt3 к ее сайтам-мишеням CpNpG. Отается определить, зависит ли поддержание паттернов ДНК-метилирования от метилирования гистонов или vice versa в клетках млекопитающих.Т.к. растения и млекопитающие содержат несколько CpG methyltransferases и H3-K9 methyltransferases, то взаимодействие скорее всего будет более сложным, чем у Neurospora. Молекулы, которые наводят на мишени DNA methyltransferases и histone methyltransferases в специфических геномных локусах, также пока неизвестны.
Три класса ATФ-зависимых хроматин-ремоделирующих белков присутствует в клетках млекопитающих (Box 1), которые использую энергию гидролиза АТФ, чтобы вызвать временные изменения в нуклеосомальной ДНК, которая делает хроматин доступным для др. белков, таких как транскрипционные факторы. Помимо этого ремодулирование хроматина необходимо для метилирования ДНК и модификации гистонов. У Arabidopsis, DECREASE IN DNA METHYLATION 1 () ген, который кодирует SNF2-подобный белок (Box 1), необходим для поддержания ДНК метилирования. Мутации в DDM1 также вызывают снижение H3-K9 метилирования и увеличение H3-K4 метилирования в гетерохроматине. Изучение двух белков семейства SNF2 (α-thalassaemia/mental retardation syndrome, X-linked) и (lymphoid-specific helicase; гомологов DDM1 у млекопитающих), выявило, что белки с хроматин-ремодулирующей и DNA-helicase активностью м. также модулировать метилирование ДНК в клетках млекопитающих. Как хроматин-ремодулирующие белки взаимодействуют с DNA methyltransferases и histone methyltransferases, чтобы вызвать метилирование ДНК и метилирование гистонов, соотв., область будущих исследований.
Показано, что энзимы модифицирующие хроматин и хроматин-ремоделирующие белки у мышей играют центральную роль в развитии млекопитающих. Функции некоторых из этих белков в развитии суммированы в . Некоторые гены, такие как ), , и , необходимы для пери-имплантационного или раннего пост-имплантационного развития, др., такие как Eed, Dnmt1, Dnmt3a/3b и , необходимы для эмбрионального роста во время или после . Неожиданно, гены, которые кодируют и являются несущественными для эмбрионаьного развития мышей. Однако, оба необходимы для собственно функционировния головного мозга после рождения, а мутации MECP2 у людей вызывают нейрологические и поведенческие нарушения, известные как . Перекрывающиеся функции methyl-CpG-связывающих белков, таких как , MBD2 и MECP2, м. объяснить отсутствие ранних онтогенетических фенотипов. Целенаправленная инактивация генов гистоновых метилтрансфераз и у мышей вызывает гибель некоторых. но не всех двойных мутантных эмбрионов, тогда как инактивация , которая кодирует histone H3-K9 methyltransferase, ведет к ранней эмбриональной летальности. HP1 связывается с высоким сродством с метилированной H3-K9 и такие взаимодействия являются критическими для формирования гетерохроматина путем олигомеризации HP1 белков. Однако, функция белков семейства HP1 в развитии млекопитающих не установлена.
Взаимодействия между разаличными хроматин-модифицирующими и хроматин-ремоделирующими белками устанавливают и поддерживают структуру хроматина. Многие важные компоненты этого процесса, включая в частности РНК и белковые факторы, которые направляют хроматин-модифицирующие энзимы на специфические геномные локусы, еще не обнаружены. Хорошо изученные онтогенетические процессы, такие как геномный импринтинг, инактивация Х и дифференцировка тканей, являются предметом для изучения эпигенетической регуляции эксрессии генов во время развития млекопитающих.
Epigenetic reprogramming in gametes
Гаметы окончательно дифференцированные и высоко специализированные клетки. которые несут всю информацию, необходимую для инициации нового цикла жизни после оплодотворения. Известно, что и материнский и отцовский геном необходимы для эмбионального развития, т.к. они запрограммированы по-разному и функционально не эксивалентны. Функциональные различия между отцовским и материнским геномом связаны с дифференциальной экспрессией отцовского и материнского генома, отцовских и материнских аллелей нескольких десятков импринтированных генов, во время развития. Эти различия возникают из-за дифференциальных модификаций генома (или геномного импринтинга) в гаметах самок и самцов. Отцовские аллели и генов метилированы по своим 5' upstream областям в зародышевых клетках самцов, тогда как др. известные импринтируемые гены, такие как Igfr2 и Snprn, приобретают свои метилированные imprints в ооцитах; делеция таких ведет к потере импринтинга. Определяемые гаметами паттерны импринтинга генов подерживаются в соматических тканях в течение эмбрионального развития, но стираются в примордиальных зародышевых клетках; следовательно, геномный импринтинг м.б. обратимым в зародышевой линии.
Imprinting in oocytes.
Генетические доказательства того, что метилирование ДНК является существенным эпигенетическим маркером для установления геномного импринтинга получены в исследованиях Dnmt3-like (Dnmt3l) гена. Dnmt3l кодирует белок, который обладает гомологией с Dnmt3a и Dnmt3b в PHD домене с цинковым пальчиком, но в нем отсутствует высоко законсервированные methyltransferase мотивы и отсутствует ферментативная активность. Хотя Dnmt3l-дефицитные самки и продуцируют зредые и функциональные ооциты, однако эмбрионы, которые получаются из этих ооцитов, имеют аномалии нервной трубки и плаценты и погибают в средине беременности. Анализ паттернов ДНК метилирования в некоторых матерински метилированных генах из разных хромосом, таких как Igf2r, Peg1 и , и некоторых импринтированных генов в Snrpn локусе показал, что Dnmt3l-дефицитные ооциты неспособны устанавливать maternal-специфические methylation imprints. Важно, что неспособность создавать материнские импринты метилирования у Dnmt3l-дефицитных ооцитов вызывает потерю моно-аллельной экспресии всех матерински импринтируемых генов. Эти результаты показывают, что methylation imprints, которые приобретаются во время созревания ооцитов, служат как материнские геномные импринты.
Dnmt3l, по-видимому, действует на импринтируемые гены через свое взаимодействие с Dnmt3 семейством DNA methyltransferases. Dnmt3l связывается с и ко-локализуется с Dnmt3a и Dnmt3b в ядрах клеток, в которых оба эти белка экспресируются. Эти результаты указывают на то, что Dnmt3l м. кооперировать с Dnmt3a или Dnmt3b, чтобы регулировать гамет-специфическое метилирование импринтируемых генов в ооците (Рис. 2). Установлено, что Dnmt3a/Dnmt3b-дефицитные самки также неспособны устанавливать maternal methylation imprints. Напротив, инактивация Dnmt1 в ооцитах не нарушает создания импринтов метилирования, но влияет на поддержание импринтига у преимплантационных эмбрионов.
Methylation in spermatogenesis.
Помимо его роли в геномном импринтинге в гаметах самок, метилирование ДНК необходимо и для сперматогенеза. У Dnmt3a-нокаутных мышей, тестисы содержат много аномальных сперматоцитов в профазе мейоза, но мало зрелых спермиев. У Dnmt3l-нокаутных мышей сперматогенез останавливается в то время, когда сперматогонии вступают в мейоз, в результате полностью отсутствуют зрелые спермии.
Интересно, что модификации гистонов также являются критическими для сперматогенеза. Мыш, у которых обе histone methyltransferases Suv39h1и Suv39h2 подвергнуты нокауту, стерильны. У Suv39h двойных нокаутных мышей, спаривание гомологичных хромосом нарушено, это обусловливает мейотический арест на ст. пахитены. Время, необходимое для приобретения метилирования ДНК и метилирования гистона H3-K9 во время сперматогенеза, по-видимому, коррелирует с деацетилированием гистонов (Рис. 2). Стержневые гистоны гиперацетилированы в сперматогониях в пре-лептотенных сперматоцитах, но ацетилированные гистоны не обнаруживаются в ходе мейоза в лептотенных и пахитенных сперматоцитах, ни в большинстве округлых сперматид. Эти находки указывают на то, что метилирование ДНК и модификации гистонов м. супрессировать глобальную экспрессию генов, когда сперматоциты подвергаются мейозу. Напротив, эти эпигенетические изменения м. играть роль в регулировании хромосомной архитектуры, которая изменяется динамически во время сперматогенеза.
Epigenetic regulation of embryogenesis
Demethylation and remethylation.
И материнский и отцовски геномы подвергаются быстрому репрограммированию после оплодотворения (Рис. 3). Во-первых, деметилирование происходит самцов, которое, по-видимому, не зависит от репликации ДНК. После образования зиготы, и материнские и отцовские хромосомы подвергаются прогрессивному деметилированию с помощью пассивного механизма, который стирает — на стадии — большинство, но не все маркеры метилирования, которые наследуются от гамет. Маркеры (marks) метилирования на импринтированных генах, однако, защищены от деметилирования и , следовательно, родительские импринты сохраняются. Является ли важным экстенсивное деметилирование генома во время преимплантационного развития, неизвесно. Паттерны эмбрионального метилирования ДНК устанавливаются после имплантации во время клон-специфического de
novo метилирования, которе начинается в бластоциста (Рис. 3). Уровни метилирования ДНК быстро повышаются в примитивной эктодерме, которая дает начало всему эмбриону, тогда как метилирование или ингибировно или не поддерживается в и клоне , которые дают плаценту и мембрану, соотв.
Генетические исследования зиготических функций DNA methyltransferases показали. что установление паттернов эмбрионального метилирования нуждается как в de novo, так и в поддержании имеющейся метилтрансферазной активности и что поддержание геномного метилирования выше порогового уровня существенно для эмбрионального развития. Инактивация Dnmt3a и Dnmt3b блокирует de novo метилирование у ранних пост-имплантационных эмбюрионов мышей и вызвает эмбриональную летальность, но оказывает незначительный эффект на поддержание предсущестующих паттернов метлирования. Dnmt1-нулевые эмбрионы прекращают развитие на ст. поздней гаструлы и погибают на ст. примерно (E)9.5. Анализ метилирования определенных последовательностей ДНК, включая повторяющиеся элементы (minor satellite repeats, endogenous C-type retrovirus и interstitial A particle (IAP) retrotransposons) и импринтированные гены (H19, Igf2r и ), показал. что эти последовательности все экстенсивно деметилированы у Dnmt1-нокаутных эмбрионов.
Одной из предпочтительных моделей является та, согласно которой захватывающее весь геном деметилирование во время пре-имплантационного развития стирает паттерны метилирования (за исключением тех, что в импринтировнных генах), которые унаследованы от гамет. Это деметилирование м. приводить к деконденсации хроматина и транскрипционой активаации зикогических генов, которые существенны для раннего развития; это м. также облегчать последующеее геномное репрограммирование за счет модификаций гистонов и ремоделирования хроматина. De novo метилирование м. кооррелировать с модификацией гистонов, чтобы репрессировать ретротранспозоны и установить глобальное состояние молчания (silencing). Такая модель согласуется с данными, что большинство регулирующих хроматин факторов — включая хроматин ремоделирующие белки семейства SWI/SNF, такие как Brg1, транскрипционные факторы, такие как и Ezh2, и DNA/histone-модифицирующие энзимы, такие как HDAC1, Dnmts и G9a — необходимо для эмбрионального развития от пери-имплантации до поздней гаструляции (Табл.1).
Maintaining DNA methylation.
Поддержание паттерна метелирования ДНК у пост-имплантационнных эмбрионов существенно для эмбрионального развития. Dnmt1 поддерживает паттерны эмбрионального метилирования DNA-replication-зависимым способом. Полная инактивация Dnmt1 вызывает 90% редукцию всех methyl CpG iв геноме после нескольких раундов репликации ДНК. Интересно, что Dnmt3a и Dnmt3b также необходимы для стабильного наследования паттернов метилирования ДНК в embryonic stem (ES) клетках мышей. Инактивация и Dnmt3a и Dnmt3b ведет к быстрому деметилированию 5' области Xistи дифференциально метилированной области Dmr2 в Igf2, и к постепенному деметилированию повторяющихся последовательностей. Детальный анализ повторяющихся последовательностей в Dnmt1- и в Dnmt3-нокаутных ES клетках доказывает. что Dnmt1 и Dnmt3 м. кооперировать, чтобы поддерживать метилирования ДНК после репликации ДНК. В линиях опухолевых клеток человека, HCT116, и выполняют перекрывающиеся функции по поддержанию паттернов метилирования по всему геному. Необходимы ли Dnmt3a и Dnmt3b для поддержания паттернов ДНК метилирования в соматиыеских тканях, неизвестно.
Чтобы DNA methyltransferases поддерживали уровни плотного метилирования после репликации ДНК, энзимы должны эффективно проходить через нуклеосомную ДНК и метилировать цитозиновые основания, которые встроены в спираль ДНК. Белки с хроматин-ремоделирующей и ДНК-helicase активностью необходимы для увеличения доступности ДНК к DNA methyltransferases. В самом деле, два белка семейства SNF2/helicase, Lsh и ATRX, м. модулировать метилирование ДНК в клетках млекопитающих. У
Lsh-нокаутных мышей, повторяющиеся последовательности ДНК, такие как IAP, minor
satellite, L1 и B1 повторы, почти целиком деметилированы на ст. E13.5 у мутантных эмбрионов и в некоторых тканях новорожденных мышат. Некоторые уникальные последовательности, такие как α-globin и импринтированный H19 ген, лишь частично деметилированы у этих мутантов. Неожиданно, несмотря на тяжелое уменьшение метилирования ДНК, сравнимое с Dnmt1-/- эмбрионами (особенно вповторяющихся ДНК элемнтах), Lsh-/- мутантные мыши развиваются до ождения, но умирают вскоре после рождения. Это возможно потому, что паттерны эмбрионального метилирования собственно устанавлиающиеся у Lsh-/-эмбрионов во время раннего развития и , следовательно, существенные для онтогенетических процессов, таких как инактивация Х, не изменены.
ATRX содержит PHD-подобный домен с цинковыи пальчиками, который является общим для белков семейства Dnmt3, и SNF-подобный геликазный домен. ATRX ассоциирован с ядерным матриксом в интерфазных ядрах и с акроцентрическими рибосомальными ДНК (рДНК) метафазных хромосом. У людей, ATRX мутации вызывают синдром умственной задержки, и некоторые затронутые индивиды обнаруживают пониженную экспрессию α-globin (который обусловливает ), гипометилированные рДНК и гиперметилированныеповторы Y-хромосомы. Эти находки укзывают на то, что ATRX, подобно Lsh, м. модулировать метилирование ДНК, через неё предполагаемое ремодулирование хроматина и активности DNA-helicase. Ремодулирование хроматина и геликазная активность, которые необходимы для de novo метилирования ДНК во время раннего эмбриогенеза, неизвесны.
Метилирование гистонов (в особенности H3-K9) м.б. необходимым для стабильного поддержания паттернов DNA-methylation во время развития млекопитающих, т.к. такие механизмы опереируют и у грибов у растений. Однако, идентификация нескольких семейств гистоновых H3-K9 methyltransferases, таких как Suv39h1, Suv39h2, G9a, и Eu-HMT1 в клетках млекопитающих, указывает на то, что различные гистоновые methyltransferases м.б. направлены к разным областям генома, чтобы регулировать структуру хроматина и экспрессию генов. Suv39h специфически метилирует гистон H3 в периценромерном гетерохроматине, тогда как G9a метилирует гистон H3-K9 в эухроматине. Вазно установить, нужны ли Suv39 и G9a для метилирования ДНК в этих двух доменах хроматина.
Maintaining genomic imprinting.
Изучение Dnmt1-нокаутных мышей показало, что метилирование ДНК необходимо для поддержания моно-аллельной экспрессии инмпринтируемых генов. Напр., у Dnmt1-дефицитных эмбрионов мыши аллели и Igf2 и Igf2r, которые обычно экспрессируются paternally и maternally, соотв., молчат, тогда как H19 ген, обычно с материнской экспрессией, обнаруживает би-аллельную транскрипцию. Значит, в отсутствие метилирования ДНК, др. эпигенетические механизмы, такие как модификация гистонов, оказываются или нестабильными или неспособны поддерживать моно-аллельную экспрессию импринтируемых генов в развивающихся эмбрионах мыши. Показано также, что транскрибируемые аллели импринтированных генов, таких как H19, Snrpn и , ассоцированы с гиперацетилированием гистонов H3 и H4, тогда как молчащие аллели этих генов ассоциированы с гипоацетилированием гистонов. Это указывает на то, что статус ацетилирования гистонов также вносит вклад в дифференциальную экспрессию родительских аллелей импринтируемых генов. Возможно, что метилирование гистонов также м. играть роль в поддержании метилирования ДНК и геномного импринтинга.
итак, метилирование ДНК служит в качестве существенного эпигенетического признака для установления геномного импринтинга во время развития зародышевых клеток и оно необходимо также для поддержания моно-мллельной экспресии импринтированных генов во время эмбриогенеза. Регуляция импринтированных генов вовлекает также ацетилирование гистонов и возможно метилирование гистонов. В некоторых импринтированных локусах, таких как Igf2r, H19 и , идентифицированы антисмысловые РНК. Экспрессия антисмысловой РНК (Air) of Igf2r, как было показано, необходимо для молчания отцовского аллеля Igf2r.
Regulating X inactivation
Дозовая компенсация у самок млекопитающих связана с инактивацией Х хромосомы во время раннего эмбриогенеза. Процесс X-инактивации превращает X хромосому из активного эухроматина в транскрипционно молчащий, сильно конденсированный гетерохроматин в результате серии событий, которые включают и покрытие Х хромосомы Xist РНК, метилирование ДНК и модификации гистонов (Рис. 4).
X инактивация происходит вскоре после имплантации эмбионов самок или при индукции дифференцировки ES клеток самок. Это сопровождается заметным увеличением экспрессии и накопления Xist РНК. Транскрипты Xist затем покрывают неактивную Х хромосому, ступень, которая необходима и достаточна для инициации инактивации Х. Целенаправленное разрушение гена Xist отменяет инактивацию Х. Индуцибельная экспрессия Xist кДНК трансгена в ES клетках самцов достаточна, чтобы запустить инактивацию аутосомы, в которые Xist трансген интегрируется,это ведет к гипоацетилированию гистона H4 и к поздней репликации этой хромосомы. Однако, детальный механизм, с помощью которого Xist РНК оркестрирует сборку неактивной Х хромосомы, остается в основном неизвестным.
У мышей X инактивация впервые появляется в клетках трофобласта плаценты и инактивируется преимущественно отцовская Х хромосома. Открыта , антисмысловой РНК Xist, которая подобно Xist, является некодирующей РНК. Транскрипты Tsix впервые обнаруживаются в бластоцисте и экспрессируется только материнский аллель Tsix, остается неясным экспрессия Tsix ограничена ли клетками на этой стадии. Tsix репрессирует экспрессию Xistin cis, возможно спомощью механизма RNA-interference, который дестабилизирует Xist РНК или заставляет молчать промотор Xist. У мышей делеция, главного Tsix промотора или разрушение транскриптов Tsixс материнского аллеляTsix, вызывают экспрессию материнского Xist. Это ведет также к инактивации и отцовской и материнской Х хромосом в клетках трофобласта, что вдет к эмбриональной летальности. Эти экспреименты показывают, что экспрессия материнсого Tsixна ст. бластоцисты ведет к исключительной экспрессии отцовских аллелей Xist и инактиваии отцовской Х хромосомы в клетках трофобласта плаценты. Выбор того, какая Х хромосома будет инактивирована случаен в клоне примитивной энтодермы, которая дает собственно эмбрион. Случайная Х инактивация в тканях эмбриона обусловлена, по-видимому, стиранием признаков импринтинга, которые контролируют импринтируемую экспрессию Xist и Tsix. Является ли метилирование ДНК признаком импринтинга, который стирается в эмбиональном клоне, чтобы сделасть возможной случайную инактивацию Х, неизвестно. Делеция Tsix ведет к неслучайной инактивации X в эмбриональных тканях, указывая тем самым, что случайная экспрессия Tsix в эмбриональных клетках вносит свой вклад в случайную экспрессию двух аллелей Xist.
Важным свойством X инактивации является ее распросранение из X inactivation centre (XIC), где этот процесс инициируется, на всю Х хромосому. Это ведет к транскрипционному молчанию всех Х хромосомы, ее конденсации и поздней репликации неактивной Х. Обнаружение молекул, которые вовлекаются в этот процесс, цель будущих исследований. Недавнее исследование Xist кДНК полной длины и различных делеционных форм Xist показало, что 5' область Xist необходима для долговременного молчания неактивной X, тогда как некоторые др. области Xist РНК необходимы для покрытия Xist X хромосомы.
Изучение метилирования гистонов показало, что дифференциальное метилирование H3-K4 и H3-K9 также играет критическую роль в инактивации Х. Метилирование гистона H3-K9 ассоциирует с неактивной Х хромосомой, тогда как метилирование H3-K4 ассоциировано с активной Х. Особый интерес представляет обнаружение, что метилирование гистона H3-K9 происходит сначала в 5' области Xist, сразу после того, как Xist РНК покрывает Х хромосому, чтобы инактивировать ее, но прежде наступления транскрипционного молчания X-сцепленных генов.
Это подтверждает модель, в которой Xist РНК рекуртирует и гистоновую H3-K9 methyltransferases и гистоновую deacetylases, чтобы инактивировать X, покрывая ее и затем направляя распространение инактивации вдоль Х хромосомы за счет образования гетерохроматина.
Изучение Dnmt1-нокаутных мышей покзало, что зиготическая функция Dnmt1 м.б. нсущественной для установления инактивации Х в эмбриональных и внеэмбриональных тканях. Однако, присутствие материнской Dnmt1, Dnmt3a и Dnmt3b м.б. достаточным, чтобы позволить инициацию и распространение инактивации Х. De novo метилирование CpG островков и посторов на инактивированной Х с помощью Dnmt3a и Dnmt3b энзимов м. облегчать распространение инактивирующего сигнала или м. стабилизировать инактиврованную порцию Х. Гиперметилирование м. рекрутировать methyl-CpG-связывающий белок, такой как Mecp2 и Mbd2, которые в свою очередь будут рекрутировать хроматин-ремодулирующие и гистон-деацетилазные комплексы.
Поддержание инактивированной Х и транскрипционное молчание Х-сцепленных генов использует несколько факторов. Хотя Xist РНК несущественна для поддержания неактивной Х, в культивируемых клетках человека и мыши, метилирование ДНК и деацетилирование гистонов являются критическими для стабильного молчания инактиврованной Х в соматических клетках. У Dnmt1-нокутных эмбрионов Х-сцепленный трансген реактивируется, если уровень метилирования ДНК снижается ниже определенного порога у Dnmt1-нокаутных эмбрионов. У пациентов (immunodeficiency, centromeric instability and facial anomaly), с мутациями DNMT3B, некоторые гены на неактивной Х гипометилированы и реактивируются. Известно также, что инактиврованная X гипоацетилирована, а активная Х гиперацетилирована. На эмбриорнальных фибробластах мышей показано, что поддержание стабильной инактивации Х нуждается в синергичном действии Xist РНК, метилировании ДНК и деацетилировании гистонов. Метилирование гистона H3-K9 необходимо также для распространения гетерохроматина и для стабильного молчания генов неактивной Х (Рис. 4). Установлено, что белок группы Polycomb , существенен для стабильного молчания Х-сцепленного GFP (green fluorescent protein) трансгена в клетках трофобласта. Все это указывает на то, что молчание генов по всей хромосоме нуждается в синергичном действии нескольких эпигенетических механизмов.
Reprogramming the somatic nucleus
Известно, что ядра соматических клеток взрослых тканей м. инициировать эмбриональное развитие, будучи трансплантированными в энуклеированный ооцит (Рис. 5). Способность цитоплазмы ооцита запускать 'de-differentiation' взрослого ядра указывает на то, что детерминация судьбы дифференцированных клеток обратима с помощью эпигенетического репрограммирования. Однако, клонирование неэффективно, т.к. большинство клонированных эмбрионов погибает вскоре после имплантации и лишь немногие доживают до рождения, имея онтогенетические аномалии и короткий период жизни. Это указывает на то, что репрограммирование трансплантированных ядер неполное.
Очевидно, что длина теломер, которые со временем укорачиваются в соматических клетках, м.б. восстановлена у клонированных эмбрионов телят. Изучение метилирования показало, что деметилирование всего генома перед имплантацией менее эффективно у клонируемых эмбрионов телят и что de novo метилирование происходит на более ранних стадиях развития по сравнению с нормальными эмбрионами. Аномальное репрограммирование метилирования ДНК м. давать в результате нарушенную реактивацию генов, которые существенны для эмбрионального развития. Показано, что в клонируемых бластоцистах мыши экспрессия редуцирована во внутренней клеточной массе клеток и эктопически экспрессируется в клетках трофобласта. Т.к. Oct4 является транскрипционным фактором, который специфически экспрессируется в стволовых клетках и примордиальных зародышевых клетках и необходим для поддержания и способности само-обновления стволовых клеток, его аномальная экспрессия у клонируемых эмбрионов м. приводить к аномальной экспрессии др. нижестоящих генов, которые необходимы для раннего эмбриогенеза. Анализ импринтированных генов у клонируемых эмбрионов мыши также показал, что хотя паттерны их родитель-специфической экспрессии чудесным образом сохраняются у клонируемых эмбрионов, но уровни их экспрессии ниже нормального в плаценте. Аберрантная экспрессия импринтированных генов и Oct4 м. вносить свой вклад в дефекты плаценты, которые часто возникают у клонируемых эмбрионов.
Плюрипотентные ES клетки м.б. выделены из клонируемых эмбрионов, которые были получены из окончательно дифференцированных ядер. Показано, что эпигенетическое репрограммирование трансплантированных соматических ядер в ооците и в пре-имплантационных эмбрионах достаточно для превращения окончательрно дифференцированных взрослых ядер в плюрипотентные стволовые клетки. У мышей генный таргетинг в ES клетках, полученных от клонированных эмбрионов показывает, что они прибежище генетических мутаций и м.б. использоаны для коррекции таких мутаций. Эта процедурам.б. использоана для терапевтических целей. Могут ли окончательно дифференцированные клетки, такие как клетки кожи, быть репрограммированы in vitro, чтобы дасть плюрипотентные стволовые клетки? Если процесс дедифференцировки соматических ядер в клонируемых эмбрионах будет рекапитулирован in vitro, то м.б. обойдены осложнения процедуры клонирования и получения плюрипотентных или мультипотентных стволовых клеток из неограниченного числа тканей взрослых. Частичное репрограммирование соматических ядер м.б. достигнуто in vitro при слиянии соматических клеток c клетками ES. Пока не решен вопрос. могут ли ткане-специфические стволовые клетки, выделенные из взрослых тканей трансдифференцироваться в др. ткани и м. ли они приобретать новую способность при слиянии с дифференцированными клетками. Хотя нет прямых доказательств, что слияние происходит in vivo, показано, что одиночные мезенхимные стволовые клетки, выделенные из костного мозга взрослых, м. вность вклад в некоторые ткани после инъекции в бластоцист. Изучение молекулярных механизмов ядерного репрограммирования на уровне ДНК и хроматина м. сделеть возможным превращение дифференцированных соматических клеток в плюрипотентные стволовые клетки in vitro.
