Посещений:
DNA Repair
Повреждения ДНК: Клеточный Ответ

Who's on first in the cellular Response to DNA damage?
S.D. Cline and P.C Hanawalt
Nature Reviews Mol. Cell Biol. V. 4, No 5, P. 361-372

Cellular DNA-repair pathways involve proteins that have roles in other DNA-metabolic processes, as well as those that are dedicated to damage removal. Several proteins, which have diverse functions and are not known to have roles in DNA repair, also associate with damaged DNA. These newly discovered interactions could either facilitate or hinder the recognition of DNA damage, and so they could have important effects on DNA repair and genetic integrity. The outcome for the cell, and ultimately for the organism, might depend on which proteins arrive first at siyes of DNA damage.

EXCISION REPAIR
A process for repairing chemical damage, mismatches or small loops in DNA, in which a single-stranded section containing the aberrant structure is removed and the resulting gap is filled by DNA replication that is templated from the complementary strand.

BASE EXCISION REPAIR (BER)
The replacement of DNA bases that are altered by small chemical modifications through the excision of only the damaged nucleotide (short-patch BER) or through the removal of 2-13 nucleotides containing the damaged nucleotide (long-patch BER).

NUCLEOTIDE EXCISION REPAIR (NER)
The replacement of DNA bases that are altered by large chemical additions or cross-links through the excision of a short, single-stranded segment cintaining the demage.

MISMATCH REPAIR (MMR)
An excision repair pathway that identifies and corrects mispaired bases and 1-3 nucleotide loops that result from DNA polymerase errors during replication.

DNA GLYCOSYLASE
An enzyme that binds selectively to a demaged DNA base and hydrolyses the N-glycisylic bond to release the altered base from the sugar-phosphate backbone leaving an abasic site.

AP LYASE
A nicking activity that is associated with some DNA glycosylases, which cuts the DNA strand on the 3'-side of an abasic site leaving a 5'-phosphate and a 3'-fragmented deoxyribose.

AP ENDONUCLEASE
An enzyme that binds an abasic site and creates a nick on the 5'-side, yielding a 3'-hydroxyl and a 5'-abasic suger phosphate. AP endoucleases also have a 3'-diesterase activity, which can nick 5' of the abasic deoxyribose remaining after AP lyase activity.

DNA POLYMERASE
An enzyme that replicates a DNA strand using the complementary DNA strand as a template. DNA polymerase β replaces the nucleotide removed in short-patch BER. Several DNA polymerases, including α, β δ and ε might be involved in long-patch BER.

XERODERMA PIGMENTOSUM (XP). An hereditary disorder arising from defects in genes from seven complementation groups (XPA-XPG), which are involved in the early steps of the nucleotide excision repair pathway, and an eighth group, XPV, with mutations in the translesion DNA polymerase η.

COCKAYNE'S SYNDROME (CS)
An autosomal-recessive disease that is characterized by neural and skeletal-development abnormalities and severe photosensitivity, but with no cancer-predisposition phenotype. Cell Lines derived from these patients are defective in transcription-coupled DNA repair.

REPLICATION PROTEIN A (RPA)
A three-suunit complex that binds single-stranded DNA and is required for initiation from origins of replication and nascent DNA synthesis. RPA also functions in NER.

TFIIH
A basal transcription factor complex of nine subunits that includes the XPB and XPD helicases, which are necessary for its function in DNA repair.

TRANCRIPTION-COUPLED REPAIR (TCR)
A dedicated pathway for the excision repair of DNA damage in the arrests the translocating RNA polymerase

DNA PRIMASE
An enzyme that synthesizes short RNA sequences used as primers for lagging-strand DNA synthesis by the DNA polymerase.

CISPLATIN
A platinum-containing drug that is used in cancer therapy and forms intra- and interstrand cross-lincs between DNA bases, of which the primary adducts are intrastrand-1,2-d(GpG) and 1,2-d(ApG).

HIGH-MOBILITY-GROUP (HMG) BOX
A minir-groove DNA-binding dimain that is found in proteins with various cellular functions.

TATA-BINDING PROTEIN (ЕИЗ)Бик .Ю A protein that binds to the minir groove of the TATA-box sequence of gebe promoters to initiate transcription.

Y-BOX-BINDING PROTEIN-1 (YB-1)
A transcription factor that binds inverted CCAAT-box sequences that are found in the promoter regions of many genes.

TFTC
A complex of transcription-iniation factors for RNA polymerase II that lacks TBP and can mediate transcription from both TATA-containong and TATA-less promoters.

HISTONE H1
A protein that binds to linker regions of DNA between nucleosome core particles to facilitate the folding of these particles into a 30-nm chromatin fibre and to stabilize higher-order chromosomal structure.

FANCONI ANAEMIA (FA)
A chromosomal-instability syndrome that is characterized by bone-marrow failure congenital defects, increased cancer susceptibility and cellular sensitivity to various DNA-damaging agents.

FUROCOUMARINS
Photosensitive tricyclic compounds that can intercalate into DNA and, on activation by UVA (320-400-nm) light, can react with thymine to form monoadducts and interstrand cross-links. Primary examples are the psoralens.

SPECTRIN
A tetrameric-membrane protein that assotiates with actin, ankyrin and calmodulin for cytoskeletal formation and secretory-vesicle transport in the cytoplasm.

SWI/SNF COMPLEX
ATP-dependet chromatin-remodelling complex, which changes the superhelical torsion of DNA in nucleosomes to regulate the transcription of genes.

ATAXIA-TELANGIECTASIA (AT)
An autosomal-recessive chromosomal instability disease that is characterized by clinical and cellular sensitivity to ionizing radiation and abnormalities in the nervous, endocrine and immune systems as well as in the skin.

CHK1 AND CHK2
Serine/threonine kinases that are believed to function downstream of ATM and ATR and tp phosphorilate p53 in the cellular DNA-damage response.

PROLIFERATING CELL NUCLEAR ANTIGEN (PCNA)
A protein complex that forms a clamp on DNA and assotiates with DNA polymerases to increase their processivity during DNA synthesis. It also assotiates with RPA and DNA polymerase β during DNA repair.

DNA TOPOISOMERASES
A group of enzymes that control the superhelical density of DNA and resolve DNA topological structures thriugh rotational and DNA-strand-passage mechanisms involving the formation of transient protein-linked DNA breaks.


(Рис.1.)  |  Excision repair pathways for DNA damage.


(Рис.2.)  |  Consequences of 'who's on first' in DNA-damage recognition.


(Рис.3.)  |  Consequence 1 - facilitation of repair.


(Рис.4.)  |  Consequence 2 - interference with repair.


(Рис.5.)  |  Consequence 3 - redirection of damage processing.

(Табл.1) DNA-damage recognition proteins in human cells

(Табл.2) Eucariotic proteins that interact with DNA damage

Геном находится под постоянным воздействием эндогенных метаболических побочных продуктов и средовых факторов, которые м. нарушать химическую структуру и повреждать кодируемые ею сообщения. Окисление и алкилирование оснований, образование громоздких химических добавлений (adducts) и поперечные связи с соседними нуклеотидами происходят тысячи раз за день в ДНК клеток человека. Такие формы повреждений м.б. устранены, чтобы обеспечить полную и аккуратную репликацию и транскрипцию ДНК.
Различные белки участвуют в распознавании модификаций ДНК и или репарируют их за счет непосредственных обратных химических изменений или находят их, чтобы удалить с помощью путей эксцизионной репарации (Рис. 1)/ Однако, белкр, которые участвуют в др. клеточных процессах, также м. б. связаны с измененными структурами ДНК. Эти взаимодействия м. менять ход репарации ДНК треимя способами: за счет интерференции с удалением повреждений с помощью энзимов репарации; за счет помощи в распознавании повреждений, если связанный белок функционирует как "антенна", привлекающая репаративные энзимы к месту повреждения; или за счет направления повреждения на путь альтернативного процессинага (Рис. 2-5).

DNA-repair proteins that recognize damage


В клетках реактивные типы хим. соединений, которые продуцируются во время дыхания, метаболизма и биосинтеза, бомбардируют генетический материал и создают эндогенные повреждения ДНК благодаря окислению ит алкилированию оснований. Спонтенное деаминирование цитозина и гидролитическое высвобождение пуринов из сахар-фосфатного остова также происходят со занчительными скоростями при нормальных физиологических условиях1. Многие др. формы посреждений ДНК - включая разрывы нити дНК и большие химические добавления - возникают при средовом или клиническом воздействии канцерогенов, облучения и химиотерапевтических лекарств.
Многие клеточные пути участвуют в поддержании интегральности генома. Сюда входят и прямые химические реверсии, соединение разорванных нитей ДНК и эксцизия поврежденных оснований ДНК.

Excision repair


Большинство модификаций оснований в клеточном геноме устраняется за счет путей эксцизионной репарации - эксцизионной репарации оснований (BER) и эксцизионной репарации нуклеотидов (NER). Третий путь эксцизионной репарации, который также м. оперировать с поврежденной ДНК, - это репарация неправильно спаренных оснований и нуклеотидов (mismatch repair, MMR), возникающих в результате странствующей (errant) репликации ДНК.
Все эти пути веключают распознавание повреждений ДНК (Табл. 1), удаление части одиночной нити ДНК, которая содержит повреждение, репаративная репликация вдоль пробела и восстановление непрерывности ДНК за счет лигации отрепарированной нити. После распознавания, ступени этого репаративного механизма продуцируют новые структурные промежуточные образования ДНК, которые также представляют собой формы повреждений, которые м.б. связаны с клеточными белками и д.б. подвергнуты преобразованию с помощью последующей ферментативной активности в данном пути (Рис. 1).
Единственным существенным отличием между тремя путями эксцизионной репарации является MMR, использующая экзонуклеазы для эксцизии длинных, однонитчатыхй областей, содержащих повреждение, стратующая с одной инцизии в поврежденной нити. Напротив BER и NER используют эндонуклеазы, чтобы разрезать (incise) нить очень близко от повреждения для эксцизии поврежденного фрагмента.

Base excision repair. Относительно небольшие модификации оснований ДНК удаляются с помощью BER или коротких или длинных участков.4 В BER DNA glycosylase - которая обладает высоким сродством к некоторым формам повреждений оснований - соединяется избирательно с измененными нуклеотидами и расщепляют N-glycosylic связь между основанием и сахаром 4,5(Табл. 1). Возникающиай в результате abasic deoxyribose (dR) сахар (без пиримидина или без пурина (АР) сайт) подвергается процессингу за счет активностей AP лиазы, AP эндонуклеазы и ДНК полимеразы, чтобы сгенерировать промежуточные образования, содержащие пробел в одно основание, надрез (nick) одиночной нити и или из одного или нескольких нуклеотидов навес (overhang) (который известен как клапан (flap)) над nick 4 (Рис. 1).
Тесная координация BER энзимов необходима, чтобы предупредить прерывание репарации за счет присоединения др. клеточных факторов к этой структуре ДНК. Хотя нет синдромов у человека, связанных с наследуемой дисфункцией BER, но полиморфизмы по одиночному нуклеотиду в MYH - который кодирует гликозилазу, которая распознает A opposite 8-oxoguanine (8-oxoG) - связаны с повышенной чувствительностью к colorectal раку 6,7. Такое отсутствие болезненного фенотипа м. указывать на то, что имеется существенная роль для пути BER во взаимодействии с повреждениями ДНК, которые происходят во время развития.

Nucleotide excision repair NER путь ответственен за удаление различных больших повреждений ДНК, таких как benzo(a)pyrene diol epoxide (BPDE) аддукты, которые возникают в результате средового воздействия бензо(а)пирена и димеризованных пиримидиновые оснований, которые индуцируются УФЛ из солнечного света8. Острая чувствительность е УФЛ является характерным признаком фенотипов двух наследственных синдромов, xeroderma pigmentosum (XP) и cocayne's syndrome, которые являются результатом дефектов ранних ступеней NER. Номенклатура генов и белков NER человека отражает комплементационные группы для этой болезни.
Бактерии распознают и вырезают крупные модификации ДНК, используя UvrABC комплекс. Эукариоты, однако, используют NER механизмы, представленные многочисленными белковыми комплексами с законсервированными функциями. В клетках людей комплекс XPC-HR23B (гомолог дрожжевого комплекса Rad4-Rad23) в сочетании с ХРА, фактором связывания однонитчатой ДНК replication protein A (RPA) и комплексом основных транскрипционных фактов TFIIH (который содержит геликазу ХРВ и XPD) ответственен за распознавание и верификацию повреждений ДНК и поставку остальных факторов NER9. Др. фактор ХРЕ, также ассистирует идентификации cyclobutane pyrimidine dimers (CPDs)10 (Табл. 1).
NER, которая происходит в молчащих областях генома и в нетранскрибируемых нитях активных генов известна как глобальная геномная репарация. Повреждения ДНК в транскрибируемой нити, которые блокируют элонгацию РНК полимеразы (RNAP), обнаруживаются для удаления с помощью второго пути, который известен как transcription-coupled repair (TCR11,12). Хотя существует меньше промежуточных образований при NER, чем при BER (Рис. 1), но NER выполняет структурно отличающийся репертуар модификаций ДНК, и т.обр., она м. завершаться др. белками. которые взаимодействуют со структурными аномалиями в ДНК.

Mismatch repair. Путь MMR удаляет неправильно спарившиеся нуклеотды и инсерционные/делеционные петли из синтезируемой ДНК13,14. У Е. coli нить-специфичность для MMR распознавания этих ошибок полимеразы управляется с помощью метилирования аденина родительской нити ДНК в последовательностях d(GATC14). Белок MutS соединяется в качестве гомодимера с неправильным спариванием или петлей. MutL взаимодействует с комплексом MutS-ДНК, который в присутствии АТФ активирует MutH-обусловленную инцизию дочерней нити в сайте d(GATC). Разрез (nick), который создается с помощью MutH, является сигналом для удаления содержащей ошибку нити с помощью ДНК геликазы II (UvrD/MutU) и последующей деградации нити с помощью одной из четырех экзонуклеаз - RecJ, ExoVII, Exol и ExoX - которые ассоциируют с MMR15,16.
Функция системы MMR законсервирована у эукариот. Однако, эукариоты не метилируют свою родительсую нить ДНК тем же способом и механиз распознавания нити у них несовсем понятен17. Это м. объяснить значительную сложность системы у эукариот, которая представлена несколькими гомологами MutS и MutL14,18. Эукариотические MutS гомологи, MSH2, MSH3 и MSH6, формируют гетеродимерные комплексы с разной специфичностью в отношении распознаваемых повреждений13. Комплекс MSH2-MSH6 (MutSα) распознает неправильно спарившиеся основания и небольшие петли инсерция/дупликация, тогда как MSH2-MSH3 комплекс (MutSβ) соединяется только с большими петлями. Было показано, что MutSα и MLH1, который является гомологом мактериального MutL, взаимодействуют с разными типами повреждений ДНК и влияют на репарацию этих повреждений за счет др. путей эксцизии.

Direct reversal of damage


Алкилирующие повреждения и индуцированные УФЛ пиримидиновые димеры м.б. репарированы путем непосредственной химической реверсии с помощью специализированных энзимов (Табл. 2). Однако у людей отсутствуют белки, которые катализируют фотореверсию.
У людей идентифицированы три белка, которые ревертируют алкилированные повреждения. O6-alkylguanine alkyltransferase катализирует эффективный перенос alkyl заменителей (substituens) - которые колеблются в размерах от метильной до бензильных групп - от О6 гуанина к своему собственному активному сайту цистеинового остатка19. АВН2 и АВН3 белки являются деоксигеназами, гомологичными AlkB E.coli, которая катализирует окисление и высвобождение метильной группы из 1-methyladenine (1-meA) и 3-methylcytosine (3-meC)20,21. Некоторые формы алкилированных повреждений м.б. репарированы с помощью механизмов NER у бактерий и эукариот, а NER O4methylthymidine (O4-meT) ингибируется в клетках млекопитающих за счет связывания метилтрансфераз, которые катализируют лишь только очень слабый перенос метила с тимина22. Вообще медленная репарация с помощзью метилтрансфераз достаточна для взаимодействия с O4-meT, а метилтрансферазой-обусловленное ингибирование NER концентрирует усилия NER пути на удаление более многочисленных и вредных форм повреждений, которые продуцируются после условий алкилирования23-25.
У дрожжей, растений и некоторых бактерий индуцированные УФЛ CPDs ( и в некоторых случаях 6-4photoproducts; 6-4PPs) также устраняются непосредственно с помощью ДНКфотолиаз посредством фотореактивации26. Фотолиазы соединяются тесно с CPDs и после возбуждения с помощью 340-400-нм светом катализируют расщепление циклобутановой связи между соседними пиримидинами в восстанавливают мономерные основания без разрезания фосфодиэфирного остова ДНК. Хотя это безусловно обладает преимуществом при солнечном облучении, однако некоторые фосфолиазы м. также способствовать NER CPDs в отсутствие фотореактивирующих длин волн27,28. В условиях фотореактивации и бактериальные и дрожжевые фотолиазы (Phr1) преимущественно ревертируют CPDs на нетранскрибируемой нити активных генов29,30/Phr1 удаляет CPDs с нетранскриьбируемой нити со скоростью, которая сходна со скоростью для TCR CPDs на транскрибируемой нити31. Т.к. Phr1 активируется у дрожжей с помощью нескольких ДНК-повреждающих агентов32 и м. усиливать NER CPDs, когда он неспособен разрывать циклобутановые связи непосредственно, то этот энзим функционирует как модель белков, которые взаимодейстуют с местами повреждений ДНК и обнаруживают потенциал облегчать распознавание ДНК-повреждений с помощью репаративных путей (Рис. 3).

Repair proteins with dual roles


Некоторые из белков, которые являются инструментальынми в распознавании и репарировании повреждений ДНК, были идентифицированы благодаря своим клеточным функциям. Напр., RNAPsI и II и их ассоциированный базовый транскрипционный фактор, TFIIH, необходимы для экпрессии генов33,34, тогда как RPA облегчает репликацию ДНК в результате его ассоциации с ДНК полимеразой-α PRIMASE35. Белки, которые вовлечены в один из путей репарации ДНК м. также участвовать и в др. путях удаления повреждений. В дополнение к примеру Phr1, MMR белки участвуют в TCR УФЛ повреждений и соединяются с некоторыми химически измененными основаниями ДНК.
Функциональная двойственность этих белков указывает на то, что и др. энзимы и энзимные комплексы, которые были хорошо охарактеризованы биохимически, м. играть и добавочные роли в репарации.

RNA polymerases. RNAPs функционируют как факторы распознавания тяжелых форм повреждений ДНК для TCR11. Т.к. ои транслоцируются вдоль ДНК во время транскрипционной элонгации, то они м.б. арестованы в присутствии повреждений на матричной нити. Некоторые крупные повреждения, CPDs, BPDE adducts и Cispalatin и psoralen поперечные связи арестовывают транслокацию RNAP II печени крыс. Однако, только CPDs и psoralen поперечные связи арестовывают RNAP E.coli11. Хотя арест любой одиночной RNAP с помощью определенной формы повреждения зависит от стереохимии и контекста ДНК последовательностей повреждений, наблюдение ареста RNAP в сайт-специфических CPD повреждениях in vitro коррелирует с TCR этой формы повреждений как у бактерий, так и в клетках человека11.
RNAPs I и III млекопитающих не обнаруживают TCR42,43, но RNAP1 Saccharomyces cerevisiae обеспечивают TCR индуцированный УФЛ повреждений ДНК в рибосомальных генах. Потребность в функции RNAP в качестве фактора распознавания повреждений ассоциирует только с арестом транскрипции. Арест комплексов RNAP в нерепарированных повреждениях пробуждает сильный сигнал к апоптозу в клетках человека44. Следовательно, инициация TCR с помощью RNAPsII молекул не только передает сигнал к репарации повреждений ДНК, но и предупреждает клеточную гибель путем высвобождения арестованных полимераз из места повреждения. Итак, RNAPsI и III, если не арестованы в повреждениях ДНК, то участвуют в альтернативном механизме по своему высвобождению из и в репарации арестованных повреждений, или, если они арестованы, то не подают сигнала к апопотозу.

RPA. RPA - наиболее многочисленный фактор, связывающийся с ssDNA, в клетках человека - необходим для сборки комплекса ДНК полимераза-α/primase в источнике репликации и инициации репликации, а также для синтеза формируемой ДНК45 . Из-за своего высочайшего сродства к ssDNA RPA соединяется также легко с некоторыми типами повреждений ДНК, включая поперечные связи cisplatin47-49 и psoralen и индуцированные УФЛ повреждения51-53 (Табл.2). RPA участвует в NER благодаря взаимодействиям с ХРА, XPG и XPF-ERCC1 комплексу. В ассоциации с ХРА, RPA необхдим для полного открытия спирали ДНК вокруг места повреждения с помощью TFIIH54,55. RPA комплекс необходим также для позиционирования репарационных эндонуклеаз для разреза поврежденной нити благодаря взаимодействиям с XPG на 3'-ориентированной стороне и с XPF-ERCC1 на его 5'-обращенном конце56.
Если RPA связывается сначала с сайтом повреждения в клетке, то он не взаимодействует с последующими ступенями пути? Или, если RPA необходим на этих последующих ступенях, то является ли его "предварительное связывание" в местом повреждения условием большей эффективности репарации? RPA имеет многочисленные ассоциации с белками и является ключевым компонентом многих ДНК-метаболических путей, то как он действует, координируя свое участие во многих различных, но одновременных событиях? Фосфорилирование субъединиц RPA в ответ на повреждения ДНК, по-вивдимому. управляет переходом от клеточнго роста к функции репарации ДНК. Однако, RPA ассоциирует с несколькими репарационными факторами в разных путях репарации посредством своей в 32-кДа белковой субъединицы57. Находятся ли специфичные к повреждениям места фосфорилирования на этой субъединице, которые контролируют взаимодействия с определенными репаративными белками? Усли RPA сначала связывается с сайтом повреждения ДНК, то он м. взаимодействовать специфически с репаративными факторами, которые являются соотвестсвующими для репарации этого повреждения? Эти вопросы требуют своего разрешения.

Mismatch-repair proteins. Помимо распознавания неправильно спаренных оснований и структур петель при MMR, MSH2 (как часть комплекса MutSα) и MLH1 также взаимодействуют с некоторыми повреждениями ДНК, которые обычно репарируются прямой реверсией или направлением на BER или NER путь (табл.2). Очищенные MUtSα эукарот соединяются с олигонуклеотидами, содержащми Т-Т цис-syn-CPDs и Т-Т 6-4PPs58, 8-oxoG59,O6meG, O4-meT, cisplatin intrastrand-1,1-d(GpG) adducts60,61 и S6-метилгуанином62.
В клетках человека распознавание O6-meG с помощью MutSα индуцирует апоптоз, а потеря MMR нарушает резистентность к алкилирующим агентам63. Это указывает на то, что MMR белки взаимодействуют с О6-алкилгуаниновой алкилтрансферазой и эксцизионной репарацией, т.к. алкилпурины подвергаются процессингу с помощью и NER и BER23,25,64 в клетках мелекопитающих, а бактериальный комплекс UvrABC м. вырезать O6-alkylG и O4-alkylT повреждения из ДНК65. Бактериальный MutS также взаимодействует с ДНК аддуктами, которые продуцируются малогдиальдегидом66, который являетс ко-продуктом пероксидации липидов. У Е. coli повреждения, которые генерируются малогдиальдегидом репарируются с помощью NER или метил управляемой MMR67.
Генетическая и биохимическая коопарация наблюдается между MutS гомологами и белками BER и NER путей. Человеческий MutSα взаимодействует с 8-oxoG гликозилазой OGG1 посредством MSH6, чтобы увеличить связывание OGG1 и удалять 8-oxoG повреждения из ДНК68. У мышей, msh2-/- нокаут нарушает предрасположенность к индукции УФЛ рака кожи, который использует MSH2 в репарации NER-обнаруживаемых фотопродуктов69. У дрожжей MSH2 ассоциирует с NER белками RAD1, RAD2, RAD10, RAD14 и RAD25 и взаимодействует непосредственно c RAD10 у msh3msh6 и mlh1pms1 двойных мутантов70 Разрушение MSH2 усиливает сувствительность к УФЛ NER-дефицитной линии, это указывает на о, что MSH2 м. облегчать репарацию индуцированных УФЛ повреждений ДНК через альтернативный путь, который использует и MMR и NER факторы.
Физиологическое значение взаимодействий MMR белков с NER белками и химическими альтерациями в ДНК впервые были предположены, когда и MutS и MutL, как было показано, необходимы для TCR CPDs в Lac опероне Е. coli37. Затем была установлена роль TCR для эукариотических гомологов MutS и MutL в результате обнаружения, что клетки человека, лишеные функциональных MSH2 или MLH1 дефектны по TCR индуцированных УФЛ повреждений36,38. Неясно, как MSH2 обеспечивает репарацию химических альтераций в ДНК. Вообще-то для TCR MutS или MutL белки, которые связаны с сайтом повреждения на транскрибируемой нити, создают строгий блок для RNAPs и облегчают репарацию благодаря аресту полимеразы. Это особенно успешно, когда повреждение ДНК само по себе не арестовывает транслокацию RNAP и м. б. репарировано менее эффективно, если оно не было сначала распознано MMR фактором. В любом случае ясно, что MMR белок, достигая первым места повреждения ДНК, м. увеличивать шансы репарации с помощью др. путей эксцизионной репарации несмотря на то, что повреждение на O6-alkylG24. Связывание этих повреждений с помощью MMR белков ингибирует репарацию и инициирует апоптоз.

Proteins with undefined roles in repair


Первой ступенью всех ДНК-репарирующих процессов является распознавание повреждения (Рис. 2). Следовательно, любой белок, который ассоциирует с поврежденной ДНКв клетке будет влиять на эффективность устранения повреждения. Еекоторые клеточные факторы, которые не охарактеризованы в отношении их роли в репарации, как было показано, взаимодействуют с разнвми формами повреждений ДНК in vitro и/или в клетках (Табл. 2). Т.к. большинство из этих белков играет роль в др. важных путях процессинга ДНК - таких как регуляция транскрипции или топологическое поддержание ДНК - их связывание с повреждениями ДНК м. указывать на неоткрытую еще функцию этих факторов в облегчении (Рис. 3), ингибировании (Рис. 4) или направлении (Рис. 5) распознавания повреждений ДНК.

Transcription factorsТранскрипционные факторы, такие как high mobility-group (HMG)-box белки и Н-box-binding protein 1 (YB1) соединяются селективно с поперечными связями между нитями ДНК, которые индуцируются cisplatin71(Табл.2). Поперечные связи 1,2-внутринитевых d(GpG) - которые являются основными cisplatin индуцированными аддуктами - искривляют ДНК спираль на 32-78о в направлении большой борозды. Т.к. оба HMG белка и ТВР изгибают ДНК примерно на 90о при связывании72,73, то сродство этих белков к цисплатиновым аддуктам в ДНК м. б. связаны с их общим свойством74. Спиральное искажение, которое индуцируется с помощью повреждения м. напоминать конформацию нормального ДНК-связывающего сайта для этих белков или переходное состояние к связующему взаимодействию74,75.
HMG белки HMG1, митохондриальный транскрипционный фактор (miTFA)76, специфичный для тестисов мышей HMG (tsHMg)77 и пол детерминирующий фактор SRY человека ингибируют NER 1,2-intrastrand cisplatin поперечных соединений in vitro , это указывает на то, что связывание цисплатиновых аддуктов любым из этих белков м. вность вклад в цитотоксичность лекарств в клетках. Доказательства этому получены на дрожжах, у которых HMG-содержащий фактор intrastrand cross-link recognition белок (ixr1) соединяется с цисплатиновыми ДНК аддуктами79 и ингибирует их репарацию80. Делеция гена IXR1 нарушает в 2-6 раз устойчивость к цисплатину81.
Напроив, др. факторы, которые распознают цисплатиновые аддукты. по-видмому. облегчают репарацию этих повреждений. Nhp6A и Nhp6B, которые являются дрожжевыми HMG1-подобными транскрипционными регуляторами и RNAPII и III82,83 и YB-1 ? который является RNAPII транскрипционным активатором у человека84-86б связывают цисплатиновые поперечные связи, но, по-видимому, усиливают репарацию индуцируемых цисплатином повреждений. Дрожжи с отсутсвием и Nhp6A и Nhp6B являются гиперчувствительными к цисплатину87. Линия опухолевых клеток человека, которая избыточно экспрессирует YB-1, является резистентной к цисплатину, а трансфекция этих клеток YB-1 антисмысловой РНК увеличивает их чувствительность к лекарству85. Следовательно, ассоциация транскрипционного фактора с повреждением ДНК м. иметь или позитивный или негативный эффект на репарацию ДНК.
Неясно, почему и как связывание этих белков - некоторые из которых имеют сходные ДНК-связывающие мотивы - влияет на репарацию разным образом. HMG-содержащие транскрипционные факторы м. оперировать сходными регуляторными последовательностями. Если место повреждения находится вблизи этих регуляторных последовательностей. то что предопределяет, какой из этих белков будет связан первым, учитывая, что клеточные последствия каждого взаимодействия м.б. различными? Сложность усиливается, если сродство этих транскрипционных факторов к повреждениям ДНК будет влиять на их "нормальную" функцию по экспрессии генов.
Связывание транскрипционных факторов с цисплатин-индуцированными аддуктами ДНК м. влиять на их репарацию, но это м. также и секвестрировать эти белки в отношении их нормальной функции. Напр., Рибосомальной РНК транскрипционный фактор (UBF) у человека содержит многочиссленные HMG домены и обнаруживает наивысшее сродство к любому известному белку для 1,2-intrastrand d(GpG) cisplatin adducts88. Воздействие на клетки цисплатином89 или присутствие цисплатин-модифицированной ДНК в восстановленной системе90, по-видимому, ингибирует активацию транскрипции RNAPI с помощью UBF. ДНК, содержащая 1,2-d(GpG) поперечные связи м. также отвлекать ТВР от связывания с ТАТА боксом промоторных последовательностей аденовирусов91. Это секвестрирование транскрипционных факторов, отвлекающее от исполнения ими своей роли по активации и инициации, названо 'transcription factor hijacking'88.
Этот насильственный захват белков повреждением ДНК не ограничивается цисплатиновыми аддуктами, т.к. УФЛ индуцированные фотопродукты также привлекают ТВР и свободный от ТВР TAF(II) комплекс, TFTC92,93/ У дрожжей потеря Nhp6A и Nhp6B нарушает слегка резистентность к перикиси водорода и УФЛ, это указывает на то, что HMG белки м. также взаимодействовать с оксидативными повреждениями и УФЛ фотопродуктами. Сходным образом насильственный захват м. не только на транскрипционные факторы, гистон Н1 связывается значительно сильнее, чем HMG1 с ДНК, содержащей внутринитевые цисплатиновые аддукты94. Это лишь один пример из нескольких белков с иными клеточными ролями - такими как формирование цитоскелета, передача сигналов checkpoint клеточного цикла и поддержание топологии ДНК - которые также взаимодействуют с сайтами повреждений ДНК.

Fanconi anaenia proteins and spectrins. Клетки от пациентов с Fanconi Anaemia (FA) гиперчувствительны к агентам, вызывающим поперечные сшивки ДНК, ионизирующей радиации и кислороду95. С помощью экспериментов по слиянию клеток идентифицировано 8 групп комплементации - A, B, C, D1, D2, E, F, G - для которых клонировано 7 генов: FANCA, BRACA2 (идентифицированы для групп комплементации В и D1) , FANCC, FANCD2, FANCE, FANCF и FANCG95). Все FA белки имеют своих гомологов у мышей, но только FANCD2 имеет гомолога у низших эукариот и бактерий. Получены доказательства, что эти белки участвуют в репарации химических intrastrand DNA cross-links (ICLs)95,96.
Механизм репарации ICLs у бактерий известен97, но способ репарации этих повреждений в клетках эукариот остается неизвестным. ICLs индуцируются химиотерапевтическими агентами (такими как цисплатин, митомицин С, азотистый mustards и нитрозомочевина), малондиальдегидом и многими furocoumarines, такими как psoralen, который синтезируется в некоторых растениях и используется в медицине96. Клеточные линии, полученные от Fanca, Fancc и Fancg нулевых мышей, являются гиперчувствительными к ICL-индуцирующим агентам и обнаруживают хромосомную нестабильность после воздействия этих хим. соединений98-100. Ядерный комплекс из FANCA, FANcc, FANCF белков м. участовать в распознавании ICLs101,102. Накопление в ядре и стабильность компонентов FA крмплекса зависит от экспрессии FANCA и FANCC белков103. Комплекс белков FA участвует также в репарации ДНК благодаря своей ассоциации с др. клеточными факторами.
Известно, что экстракты из клеток FA комплементационной группы А не несут двойных инцизий ДНК в psoralen ICLs, которые необходимы для эксцизионной репарации этих аддуктов104. FA клетки из А, В, С, D и G комплементационных групп дефицитны по цитоскелетному белку, который известен у человека как α-spectrin II (αSpIIS*, кодируется SPTAN1), который связывается непосредственно с ДНК, которая содержит ICLs и обладает значительно более высоким сродством к psoralen ICLs, чем к моно аддуктам в ДНК105. αSpIIS* найден в ассоциации с FANCA и FANCC106. Т.к. FANCA и FANCC не взаимодействуют непосредственно др. с др. в ядерном комплексе, то предполагается, что αSpIIS* функционирует как фактор распознавания ICLs и обеспечивает остов для сборки комплекса репарации ICLs106. Роль FA ядерного комплекса в репарации и функция спектрина в ассоциации с этим комплексом еще не определена. Однако, показано, что FA белки м. вовлекаться в открытие хроматина107 и в передачу сигналов на путях репарации108,109 после детекции повреждений ДНК.
Белок FANCA также обнаруживается в ассоциации с BRG1 в комплексе SWI/SNF, это указывает на то, что этот белок участвует в ремоделировании хроматина107. Подобное взаимодействие м. обеспечивать открытие хроматина ICLs? чтобы сделать их доступными для репаративных энзимов. И FANCA и FANCD2? которые не являются частью FA ядерного комплекса, ассоциируют с фактором чувствительности к раку груди BRCA1110,111. Клетки BRCA1 гиперчувствительны к агентам, поперечно связывающим ДНК, это м.б. связано с потерей BRCA1 ассоциации с FANCD2112.
Показано, что FANCE белки взаимодействуют с FANCC и FANCD2 и м. передавать сигнал оо обнаружении повреждения ДНК с помощью FA ядерного комплекса к нижестоящему пути эксцизионной репарации, который обеспечивает моноубиквитилирование FANCD2108,109.
Независимо от того, осуществляется ли это за счет прямого взаимодействия с повреждением ДНК или за счет их передачи сигналов для эксцизионной репарации, генные продукты, которые ассоциированы с FA? по-видимому, облегчают репарацию ICLs в ДНК и м. открывать уникальный путь для процессинга этого типа повреждений ДНК.

ATR. Ataxia-Telangiectasia mutated (ATM)-related protein , ATR, является членом семейства 3-kinase-related kinase (PIKK) и необходим для chechpoint реакции на некоторые формы повреждений ДНК у млекопитающих113. ATR фосфорилирует р53 и CHK1 и CHK2 киназы, чтобы инициировать checkpoint signalling. Потеря активности ATR киназы делает клетки чувствительными к ионизирующей радиации, MMS, hydroxyurea и УФЛ114. Фосфорилирование р53 с помощью ATR стимулируется ДНК, но еще в большей степени ДНК, облученной УФЛ115. Фактически присутствие одиночных 6-4РР в ДНК увеличивает шансы связывания с помощью ATR, указывая тем самым. что ATR v/ оперировать как чувствительный к УФЛ повреждениям сенсор, чтобы активировать checkpoint (КПП)113.
В экстрактах яиц Xenopus laevis привлечение ATR и Rad1 (который является субъединицей Proliferating-Cell Nuclear Antigen (PCNA)-like комплекса, который, как полагают, функционирует как сенсор повреждений ДНК) в хроматин, который поврежден УФЛ или MMS, и активация checkpoint (КПП) повреждений ДНК нуждаются в иницииации репликации ДНК116. Следовательно, нарушение репликации повреждениями ДНК м.б. необходимым для ATR, чтобы распознать повреждение и сигнализировать в КПП (checkpoint response). Гомолог ATR у S.cerevisiae, Mec1, фосфорилирует Dcd2 (белок, который сходен с Rfc5 субъединицей ЗСТФ-загрузочного комплекса RF-C) независимо от др ДНК-damage-checkpoint генов117. Кроме того, локализация Dcd2 на повреждениях ДНК зависит только от Mec1118. Это указывает на то. что в клетках человека ATR м. участвовать с PCNA-подобными комплексами в распознавании повреждений ДНК или измененных структур ДНК, блокирующих репликацию116.
Получены доказательства, что ATR м. функционировать не только как киназа в сигнальном каскаде для вызывания ответа ДНК-damage-checkpoint, но также как фактор распознавания повреждений ДНК, который вызывает транслокацию ДНК полимеразв. Пока нет доказательств. что ATR взаимодействует с белками эксцизионной репарации и маловероятно, что распознающие повреждения энзимы пердают сигналы, чтобы вызывать реакцию КПП на повреждения ДНК. Как инициируется ответ КПП, если tepair-recognition энзимы или др. белкт достигают места повреждения раньше ATR? Указывает ли это, что имеется конкуренция между путями репарации ДНК и ДНК-damage-checkpoint в отношении взаимодействия с поврежденной ДНК?
Уровень повреждения ДНК, который определяется клеткой, м.б. важным. При низких уровнях повреждений факторы репарации ДНК, которые высоко специфичны к повреждениям, м. распознавать и репарировать повреждения прежде их обнаружения белками checkpoint. Однако, если повреждения достигают более высокого порога, то checkpoint белки, такие как ATR, также смогут находить повреждения ДНК. Система репарации м.б. перенасыщена и нуждается или в дополнительном времени для работы или не м. восстанавливать интегральность генома. Если ATR сигнализирует, чтобы остановить клеточный цикл, то ATR м. или диссоциировать от ДНК, чтобы дать доступ репаративным энзимам к повреждению или м. участвовать в еще неустановленных взаимодействиях с факторами эксцизионной репарации, чтобы направить повреждение по пути репарации.

Topoisomerases. Xedcndbntkhyjcnm пролиферирующих клеток к потере интегральности ДНК является базой многих терапевтических вмешательств при раке. Локальное применение ионизирующего облучения или инфузия лекарств, чтобы вызвать обширные повреждения ДНК, м. превосходить репаративную способность опухолевых клеток и иногда устранчть опухоль. Если облучением и агентами, вызывающими сшивки, повреждения ДНК вызываются непосредственно, то антинеопластические агенты, которые нацелены на ДНК топоизомеразы используют обычный для этих энзимов механизм индукции разрывов нити ДНК119,120. За счет усиления расщепления фосфодиэфирного остова или ингибирования повторной лигации вырезанной ДНК, направленные на топоизомеразу противораковые агенты увеличивают уровни (временно) ковалентныных энзим-ДНК комплексов, которые содержат разрывы ДНК, связанные белками. Эти связки м.б. разрушены - конвертируя комплексы в разрывы нитей ДНК - если сталкиваются с транслоцирующей репликацией121-123 или транскрипционной кухней124,125.
Исследования топоизомераз I и II эукариот показали, что некоторые формы повреждений ДНК затрагивают активность топоизомераз способом, сходным со способом действия нацеленных на энзимы лекарств (Табл. 2). Список включает повреждения, которые репарируются всеми путями эксцизионной репарации, а также BER промежуточные образования и модификации деоксирибозных сахаров. Топоизомеразы, по-видимому, не 'ищут ' повреждений ДНК, т.к. сайты расщепления топоизомераза-ДНК не всегда совпадают с расположением повреждений ДНК на олигонуклеотидных сусбтратах in vitro. Однако, присутствие одиночного сайта повреждения ДНК вблизи позиуии энзимом-обуславлеиваемого расщепления ДНК, м. увеличивать формирование комплексов топоизомераза-ДНК более чем в 20 раз в зависимости от повреждения126.Облучение УФЛ фибробластов человека127 , BPDE обработка клеток V79 китайского хомячка и воздействие цитозин арабинозидом129 или gemcitabine130 лейкемичных клеток человека индуцируют повышенные уровни комплексов топоизомераза I-ДНК.
Факт, что топоизомеразы соединяются с ДНК, чтобы защитить 22 нуклеотида в месте повреждения ДНК внутри комплекса топоизомераза-ДНК, которые не распознаются репаративными энзимами131,132. Чтобы повреждение было репарированым топоизомераза д. облегчать распознавание повреждения и затем удаляться для последующей эксцизии повреждения. У дрожжей избыточная экспрессия топозизомеразы I (Top 1)133 или потеря топоизомеразы III (Top3)134 вызывает гиперчувствительность к MMS, УФЛ и ионизирующей радиации. Энзим Top3 изучался в отношении его взаимодействия с повреждениями ДНК. Однако Top3 формирует комплекс в Sgs1, дрожжевым гомологом RecQ геликазы дрожей, которая необходима для вызывания реакции intra-S-phase damage-checkpoint и м. вызывать аномальные структуры ДНК, возникающие в S фазе, обусловленные повреждениями134.Увеличение Top1, с др. стороны, м. сенсибилизировать дрожжи к повреждающим агентам за счет маскирования ДНК повреждений от факторов репарации.
Т. к. большинство топоизомераз в клетках людей являются существенными, то отклонение этих энзимов от своего первичного долга по поддержанию топологии ДНК м. оказаться вредным. Из-за своей ДНК-режущей активности топоизомеразы м. инициировать программы клеточной гибели, если клетка превосходит порог повреждений ДНК, что делает геном нерепарируемым. Фактически в клетках линии миэлоидной лейкемии Top2 м. обусловливать эксцизию хромосомальных петель после обработки перекисью водорода135. указывая тем самым, что Top2, локализуемая в местах ядерно-матричного присоединения, м. расщеплять ДНК во время гибели клетки после оксидативного инсульта. Такой 'suicide' механизм, связзанный с топоизомеразами м. эксплуатироваться агентами, вызывающими повреждения ДНК и нацеленными на топоизомеразы противораковыми лекарствами, для элиминации злокачественных клеток126. В настоящее время изучается взаимодействие топоизомераз с белками распознавания повреждений ДНК и взаимоотногения между активностью топоизомераз и NER повреждений ДНК, индуцированных УФЛ у дрожжей.

Concluding remarcs


Cellular DNA-repair mechanisms are not mutually exclusive/ And, just as repair enzymes can participate in different repair pathways, proteins with other functions in the cell can bind to DNA lesions and potencially influence repair. RPA, RNAPs and ATR contribute constructively towards repair through their recognition of damage, and the FA proteins seem to particio\pate in a novel repair pathways. The effects on repair of the transcroption factors, histones and topoisomerases, which also interact woth DNA damage, are still unclear. The DNA structural alterations that are induced by certain forms of damage might attract these proteins owing to their resemblance to modifications in DNA structure that are normally generated by the protein on DNA binding. DNA-distorting lesions could hijak proteins from their normal cellular functiond, resulting in the downregulation of gene product levels, alteration of chromatin structure and occlusion of damage from repair recognition.
The DNA-damage response of cells involves not only the elimination of DNA damage, but also the regulation of where, when and how genetic integrity is restored. As DNA-damage-binding proteins are observed to have different effects on repair and survival.'who's on first' at site of DNA damage could determine the pathway for damage processing, coordinate removal of damage or initiate signals for cell-cycle arrest or apoptosis after threats to genomic stability.
Сайт создан в системе uCoz