WMZ: Z191701361450 WMR: R209318204033 |
INTRAFLAGELLAR TRANSPORT Nature Reviews Molecular Cell Biology 3, No 11, 813-825 (2002) | ||
Eukaryotic cilia and flagella, including primary cilia and sensory cilia, are highly conserved organelles that project from the surfaces of many cells. The assembly and maintenance of these nearly ubiquitous
structures are dependent on a transport system — known as 'intraflagellar
transport' (IFT) — which moves non-membrane-bound particles from the cell
body out to the tip of the cilium or flagellum, and then returns them to
the cell body. Recent results indicate that defects in IFT might be a
primary cause of some human diseases.
(Рис.1.) | The structure of intraflagellar transport particles. (Рис.2) | The intraflagellar transport machinery. (Рис.3) | Localization of intraflagellar transport particles in Chlamydomonas. (Рис.4) | Postulated roles of intraflagellar-transport-particle proteins in targeting proteins to the flagellar compartment. (Рис.5) | A defect in an intraflagellar-transport-particle protein prevents assembly of kidney primary cilia. (Рис.6) | The connecting cilium of the vertebrate photoreceptor cell. (Табл.1) Intraflagellar-transport-particle polypepetides (Табл.2) Boxes(Box 1) | Cilia and flagella Box 2 | Intraflagellar-transport-particle polypeptides in Caenorhabditis elegans In the nematode Caenorhabditis elegans, there are known mutations in many of the genes encoding the putative homologues of intraflagellar-transport (IFT)-particle polypeptides and motors. Interestingly, the mutations are in the che, daf, and osm genes, the products of which are required for the formation and function of the sensory cilia. For example, osm-1, osm-5, and osm-6 encode homologues of the Chlamydomonas IFT172, IFT88 and IFT52 IFT-particle proteins, daf-10 encodes a homologue of Chlamydomonas IFT122 and che-11 encodes a homologue of Chlamydomonas IFT140. In addition, che-3 encodes the homologue of the Chlamydomonas retrograde IFT motor subunit DHC1b . Therefore, IFT is essential for the assembly of non-motile sensory cilia in C. elegans. It was presumed that, like the Chlamydomonas IFT
particles, the IFT polypeptides that are localized in C.
elegans sensory cilia move anterogradely and retrogradely in the
cilia. This has now been elegantly shown by fusing sequences that
encode green fluorescent protein (GFP) to either the kinesin-II
non-motor subunit (KAP) gene or the IFT-particle-polypeptide genes,
transforming these constructs into C. elegans and observing
the motility of their products in vivo
(see Online link to the
(Box 3) | A flagellar pore complex? (Box 4) | Defects in intraflagellar transport reveal a role for nodal cilia
|
Cilia и flagella (Box 1) содержат длинные микротрубочковые аксонемы, окруженные наружной мембраной, которая является продолжением плазматической мембраны клетки. На своем проксимальном конце аксонема продолжается с базальное тело, которое закреплено в клетке. Во время роста ресничек и жгутиков аксонема собирается за счет дополнительных новых аксонемных субъединиц на дистальном кончике. Т.к. в ресничках и флагеллах отсутствует кухня (machinery), необходимая для синтеза белка, а место сборки аксонемы довольно удалено от места синтеза аксонемных белков, поэтому необходжима их транспортировка.
Клетки решают эту проблему посредством intraflagellar transport (IFT). Во время IFT не связанные с мембраной частицы движутся постоянно вдоль аксонемного дублета микротрубочек, непосредственно позади флагеллярной мембираны от основания к кончику органеллы. IFT частицы движутся в этом антероградном направлении, как полагают, перенося материалы для сборки и поддержания флагеллярной аксонемы и мембраны. На кончике flagellum, IFT частицы меняют направление и транспортируются назад к основанию flagellum, где они возвращаются в большой пул IFT компонентов в области, окружающей базальное тело. Движение в этом ретроградном направлении ведет к рециклингу IFT частиц и моторов. Этот IFT процесс существенен для образования ресничек и флагелл — дефекты в IFT ведут к нарушениям сборки подвижных жгутиков у Chlamydomonas reinhardtii, моских ежей и Tetrahymena thermophila, реснитчатых сенсорных нейронов у Caenorhabditis elegans и Особый интерес имел фенотипический анализ дефектов IFT моторов и в частности белков у мышей, показавший участие IFT и ресничек в поликистозе почек (polycystic kidney disease), First sightings of intraflagellar transport Большинство исследований проводится на biflagellate водоросли Chlamydomonas reinhardtii. IFT впервые был выявлен у Chlamydomonas с помощью differential interference contrast (DIC) микроскопии, где были видны частицы, перемещающиеся антероградно вдоль флагеллума ~2.5 μm s-1 без перерыва, тогда как меньшие на вид частицы двигались ретроградно ~4 μm s-1 (для Quick-Time video, кликни ссылку Motors that power intraflagellar transport Все базирующиеся на микротрубочках моторы движутся вдоль микротрубочек в одном направлении, в направлении или The anterograde motor. Изучение flagellar assembly (fla) мутантов у Chlamydomonas впервые выявило ген Fla10 затем был распознан как член семейства kinesin-II гетеротиримерных, microtubule-plus-end-направленных кинезинов. Более того, было показано, что в бластуле морского ежа, инъекции антител против моторной субъединицы kinesin-II ведут к формированию коротких, парализованный ресничек, которые лишены центральной пары микротрубочек, и что у эмбрионов мыши узелковые реснички (nodal cilia) не собираются, когда любой из генов моторных субъединиц kinesin-II в нокауте. Следовательно, kinesin-II является скорее всего антероградным мотором IFT и в ресничках и жгутиках.
Флагеллярный Fla10 kinesin-II был очищен до гомогенности и было показано, что он является типичным гетеротримерным kinesin-II, который состоит из моторных субъединиц в 85 и 95 kDa, известных как The retrograde motor. Цитоплазматический dynein участвует также в IFT, были найдены мутации в гене, кодирующем у Chlamydomonas Более определенные результаты получены при делеции гена, который кодирует у Chlamydomonas изоформу тяжелой цепи динеина (dynein heavy chain isoform Все это делает DHC1b наиболее вероятным кандидатом на роль моторной субъединицы ретроградного IFT. Если ген DHC1b делетирован у Chlamydomonas,то мутанты растут и делятся нормально, но имеют очень короткие жгутики, которые накапливают даже больше IFT частиц, чем мутанты LC8. Эти результаты указывают на то, что DHC1b является фактически субъединицей специализированного цитоплазматического динеина, который действует как ретроградный мотор для IFT. Очевидно, что IFT частицы перемещаются в мутантных жгутиках за счет действия kinesin-II, но они не м.б. возвращены к основанию жгутика из-за отсутствия ретроградного мотора.
Если ts мутация DHC1b позволяет сформироваться жгутикам при пермиссивной температуре, а затем происходит сдвиг к рестриктивной температуре, то жгутики укорачиваются. Следовательно, ретроградный IFT необходим для поддержания послностью сформированных жгутиков, хотя его роль м. просто заключаться в рециклинге компонентов, необходимых для антероградного IFT.
У C. elegans, гомологом DHC1b является CHE-3, а мутации в Делеционные мутанты Chlamydomonas DHC1b обнаруживают также, что IFT частицы рециклируют после того, как они возвращаются из жгутика в тело клетки. У Chlamydomonas дикого типа бльшинство IFT частиц расположено вокруг базальных тел. Но у dynein 1b ретроградных мутантов частицы полностью перераспределены из области базальных телец в жгутики, из которых они, по-видимому, не м. вернуться. IFT в жгутиках Chlamydomonas неослабно продолжался несмотря на почти полное ингибирование синтеза белка с помощью anisomycin.
Control of intraflagellar transport. Control of intraflagellar transport. Kinesin-II переносится как IFT груз от кончиков жгутиков к основанию. Напротив, т.к. dyneins являются моторами, которые активно движутся в направлении минус-концов микротрубочек, то это м. указывать на то, что цитоплазматический динеин 1b переносится как IFT груз к кончику. Имеются доказательства того, что, по крайней мере некоторые паредшественники жгутиков — напр., внутренние плечи динеина — также транспортируются с помощью IFT частиц к месту сборки аксонем на кончике жгутика и там высвобождаются. На кончике видимый размер частиц уменьшается (возможно в результате, частично, освобождения от аксонемных предшественников). Кинезиновый мотор становится грузом, а цитоплазматический динеинеиновый 1b мотор принимается за транспорт частиц назад в область базальных тел. Более того, хотя IFT частицы перемещаются антероградно более медленно, чем ретроградно, но ретроградные частицы более многочисленны, это указывает на то, частицы ремоделируются на каждом из концов жгутика.
Механизмы, с помощью которых IFT-частицы оборачиваются, загружают груз и разгружают, меняют моторы, неизвестны, но по аналогии с системой двунаправленного перемещения частиц (напр., перемещения IFT particles and particle proteins Когда Chlamydomonas fla10ts-мутантные клетки сдвигаются к рестриктивной температуре, то количество IFT частиц в жгутике снижается ~ на 70%, прежде чем жгутик будет резорбирован. Сравнение экстрактов этих fla10-мутантных жгутиков с таковыми дикого типа позволяет определить, какие жгутиковые полипептиды создают IFT частицы. IFT частицы седиментируют при ~16 S в градиенте сахарозы и состоят, по крайней мере, из 16 полипептидов, которые появляются в виде двух комплексов: complex A и complex B (Табл. 1). CКлмплекс A содержит, по крайней мере, 4 полипептида с относительно высоким мол. в. (Mr = 122–144K), тогда как комплекс B содержит, по крайней мере, 12 полипептидов в основном с низким мол. в. (Mr < 100K). LC8-мутантные жгутики накапливают и IFT частицы и полипептиды IFT-частиц.
Аминокислотные последовательности большинства белков Chlamydomonas IFT-частиц предсказаны на базе их кДНК последовательностей. Показано, что действительно все эти белки обнаруживают гомологию с большинством подобных белков др. реснитчатых организмов, включая нематод C. elegans (Табл. 1; Box 2), Drosophila melanogaster, мыши и человек, но они отсутствуют у организмов, лишенных ресничек, таких как дрожжи и Arabidopsis thaliana. Следовательно, IFT является, по-видимому, законсервированным процессом, который необходим для поддержания и сборки всех эукариотических ворсинок и жгутиков. Единственное возможное исключение то, что полностью сформированные жгутики спермиев млекопитающих, белки которых вряд ли подвергаются обмену. В самом деле, хотя белки IFT-частиц необходимы для формирования жгутиков спермиев мыши, они не обнаруживаются в зрелых жгутиках.
Некоторые из предсказанных аминокислотных последовательностей являются новыми, это указывает на их специфические функции белков индивидуальных IFT частиц. Однако, имеются исключения. IFT88 является гомологом мышиного белка Важность специфических полипептидов IFT-частиц для сборки жгутиков подтверждена идентификацией Chlamydomonas инсерционных мутаций, лишенных генов, кодирующих IFT88, IFT57 и IFT52. Эти мутантны растут и делятся нормально, это указывает на то, что эти белки IFT-частиц не участвуют в каком-либо важном процессе у Chlamydomonas. Однако, мутанты IFT88 и IFT52 не способны собирать жгутики, тогда как мутанты IFT57 собирают только очень коротки жгутики. Итак, эти специфические белки IFT-частиц необходимы для формирования жгутиков, хотя различия в фенотипах мутантов указывают на то, что белки отличаются по своей важности. В противоположность DHC1b мутантам, мутанты белков IFT частиц, которые формируют короткие жгутики не накапливают IFT частицы на своих жгутиках. Дефекты C. elegans гомологов IFT88 и IFT52 сходным образом затрагивают сборку сенсорных ворсинок (cilia) (Табл. 1; Box 2).
Выделение IFT частиц позволяет получить моноклональные и поликлональные антитела, которые распознаыют специфические белки IFT-частиц. Иммунофлюоресцентная микроскопия, использующая эти антитела, и те, что получены против IFT моторов, обнаруживает точечное окрашивание вдоль жгутиков (Рис. 3a), IFT частицы in transit. Однако, принципиальная локализация полипептидов IFT-частиц и кинезиновых и динеиновых моторов образует циркулярный паттерн вокруг базальных телец (Рис. 3b). Это довольно неожиданно, т.к. мобильные IFT частицы обнаруживаются только в жгутиках при DIC микроскопии и линейные совокупности IFT частиц наблюдаются только в жгутиках при EM.
Использовали меченные золотом антитела и ультратонкие срезы материала, это показало, что IFT белки локализуются на 'flagellar' концебазальных телец, особенно на ассоциированных с мембранами концах переходных волокон, которые соединяют базальные тельца с клеточной мембраной (Рис. 3c). Эти волокна демаркируют границы между цитоплазматическим и жгутиковым 'компартментами', и м. представлять собой и зону загрузки, где груз связывается с IFT частицами, и местом, где targeting последовательности белков, которые предназначены для жгутикового компартмента распознаются (Box 3).
Targeting to the flagellar compartment Мембраны ресничек и жгутиков содержат белки, которые локализованы специфически. Должен существовать механизм для сортировки и направления этих белков в мембраны ресничек и жгутиков. В самом деле, жгутиковые 'targeting' сигналы, которые необходимы для перемещения белков с места их синтеза в цитоплазматических рибосомах в мембраны жгутиков теперь установлены у Trypanosoma и Leishmania. Специфические мембраныые жгутиковые формы транспортера глюкозы у Leishmania нуждаются в N-терминальных лидерных последовательностях в 30 аминокислот, чтобы достичь своего места на жгутиках. Если получить химерный полипептид N-терминальной части этого транспортера глюкозы с не-жгутиковым мембранным транспортером hexose, то последний будет направляться в мембрану жгутиков. Сходным образом, в исследованиях по таргеттингу Предполагается, что жгутиковые интегральные мембранные белки синтезируются в грубом endoplasmic reticulum, проходят через аппарат Golgiи затем транспортируются с помощью post-Golgi пузырьков в сайты докирования пузырьков, которые находятся вблизи переходной зоны между базальными тельцами и флагеллумом (Рис. 4). Это место экзоцитоза пузырьков, где mastigonemes — филаментозные структуры, которые выпячиваются с поверхности жгутиков некоторых Молекулярной основой направления мембранных и аксонемных белков в жгутиковый компартмент является зависимой от targeting последовательностей или на самих полипептидах жгутиков (как это показано для trypanosomes), или на тех белках с которыми полипептиды ассоциируют в качестве pre-assembly комплексов в цитоплазме. Ясно, что части аксонемы — напр., наружные dynein плечи и радиальные spokes предварительно собираются в цитоплазме. Итак, только один полипептид из pre-assembly комплекса д.б. необходим для направления к цели всего комплекса; жгутиковые белки, у которых отсутствуют flagellar targeting последовательности, должны переноситься в флагеллум путем ассоциации с белками, которые имеют такие последовательности.
Intraflagellar transport in physiology and disease Polycystic kidney disease. У млекопитающих гомолог Chlamydomonas белка IFT-частиц IFT88, известный как Tg737 у мышей и людей, интересен, т.к. инсерционная мутация кодирующего гена вызывает Хотя в почках отсутствуют подвижные реснички, многие эпителиальные клетки собирающих протоков почек и канальцев имеют одиночные, неподвижные '9+0' реснички, называемые, первичными ресничками (primary cilium) (Рис. 5a; Box 1). Первичные реснички фактически присутствуют в большинстве клеток тела (см Online link ADPKD затрагивает 1 на 500 индивидов и подобно ARPKD вызывает образование почечных кист, хотя симптомы м. клинически не проявляться вплоть до достижения пациентом среднего возраста. Первичные дефекты в наиболее распространенной форме ADPKD связаны с генами, кодирующими Обратимся к C. elegans гомологам позвоночных polycystins, которые оказываются локализованными в сенсорных ресничках червя, где они, по-видимому, участвуют в передаче сигналов. Показано, что скорее всего polycystin-1 и polycystin-2 млекопитающих располагаются принципиально в мембране ресничек. Следовательно, местом действия polycystin-1 и polycystin-2 в почках д.б. первичные реснички, а их мутации повреждают реснички — или в результате нарушения ciliary polycystins или нарушения сборки ресничек — что ведет к поликистозу почек.
Локализация polycystins строго указывает на то, что первичные почечные реснички являются сенсорными органеллами, которые инициируют пути сигнальной трансдукции, которые контролируют дифференцировку и пролиферацию клеток. Кроме того, показано, что когда почечные первичные реснички искривлены, то они инициируют Ca2+ сигнал, который распространяется по клетке, это подтверждает гипотезу, что эти реснички являются механорецепторами, которые отслеживают скорость тока жидкости через собирающие протоки и канальцы. Было бы интересно определить, может ли polycystin Ca2+ каналы генерировать этот механически индуцируемый Ca2+ сигнал. Во всяком случае, эти результаты, вместе с предыдущими данными, что Retinal degenerative disease. Реснички или структуры из них происходящие, также участвуют в развитии и функции некоторых сенсорных структур в теле позвоночных — напр., в сетчатке, эпителии внутреннего уха и носа. Т.к. IFT по-видимому, имеет место во всех ресничках и жгутиках, то он д.б. важен для сборки и поддержания этих сенсорных структур и тканей. Роль IFT изучалась наиболее детально в наружных сегментах палочек и колбочек сетчатки (Рис. 6). Эта чувствительная к свету дендритная структура, содержащая фотопигменты и свет-передающую кухню (machinery), формируется из первичной реснички; короткая '9+0' 'connecting cilium' остается и у взрослых в виде единственного пути общения между наружным сегментом и внутренним сегментом, в последнем происходит синтез белков. После своего образования, палочковидный наружный сегмент постоянно обновляется с высокой скоростью; подсчитано, что ~ 2,000 молекул opsin в мин. необходимо для поддержания rod наружного сегмента, и все эти вновь синтезируемые белки, по-видимому, транспортируются в наружный сегмент через проводящую (connecting) ресничку.
На возможную роль IFT в этом процессе впервые указало открытие, что IFT motor kinesin-II присутствет в connecting cilia палочек и колбочек рыб. Затем с помощью Cre-loxP мутагенеза удаляли kinesin-II motor субъединицу KIF3A из фоторецепторных клеток мышей. В отсутствие KIF3A, накапливались большие количества opsin, arrestin и мембран во внутреннем сегменте, а фоторецепторные клетки в конце концов подвергались апоптической гибели. Эти результаты указывают на то, что kinesin-II обеспечивает IFT в connecting cilium и необходим для сборки и постоянной поддержки палочкового наружного сегмента. Однако, т.к. kinesin-II м. участвовать и в др. процессах транспорта в этих клетках, тогда косвенные эффекты нокаута гена на поддержание фоторецепторных клеток исключить нельзя.
C помощью иммунофлюоресцентной микроскопии было показано, что некоторые белки IFT-частиц концентрируются на проксимальтных концах и в меньшей степени на дистальных концах connecting cilia палочек у мышей — распределение очень сходное с таковым для белков IFT-частиц у
Chlamydomonas. Более того, у мышей, гомозиготных по инсерционой мутации в гене, кодирующем белок IFT-частиц Tg737, палочковидные наружные сегменты развивались аномально и в конце концов дегенерировали, это приводило к полному исчезновению клеток-палочек. Следовательно, IFT имеет место в connecting cilium и он важен для сборки и поддержания палочковидного наружного сегмента за счет транспорта необходимых белков из внутреннего сегмента в наружный сегмент. Дегенерация палочек, возникающая в результате дефектов IFT-motor и -particle белков очень сходна с той, что наблюдается при retinitis pigmentosa и др. заболеваний человека, вызывающих прогрессивную слепоту.
Embryogenesis: left–right-axis determination. Как отмечалось выше, делеция гена IFT88 у Chlamydomonas полностью блокирует сборку жгутиков. Почему же тогда connecting cilia образуются в клетках-палочках у мышей, гомозиготных по инсерционной мутации гомолога IFT88, Tg737? Инсерционный аллель Tg737, известный как Tg737orpk, является гипоморфным — т.е. он экспрессирует значительно сниженные количества нормальной длины Tg737 мРНК и Tg737 белка. Он экспрессирует также в повышенные количества короткой изоформы Tg737 белка. Оказалдось, что относительно небольшших количеств нормальной длины продукта и/или коротких изоформ достаточно для поддержания сборки connecting cilium, но недостаочно для полного развития долго-временого поддержания наружного сегмента. Интересно, что полный нокаут гена Tg737 мышей ведет к гибели эмбрионов; у эмбрионов отсутствуют узелковые (nodal) реснички и нарушено предопределние лево-правосторонней оси, это является характерным признаком дефектов nodal cilia (Box 4). Следовательно, Tg737 у мышей как и его гомолог IFT88 у Chlamydomonas, существенен для формирования ресничек. Т.к. в случае connecting cilium, небольшие количества нормального Tg737 белка (или короткой изоформы) экспрессируемого у инсерционных мутантов мыши достаточны для формирования нодальных ресничек, то эмбриогенез не нарушен. Респираторные реснички слабо изменены у оригинальных Tg737 инсерционных мутантов мышей. Предполагается, что некоторые реснички или структуры из них происходящие — напр., почечные первичные реснички и палочковидные наружные сегменты — более чувствительны к снижению или изменению IFT, чем др. реснички, такие как нодальные реснички и респираторные реснички.
Human-disease syndromes. Сходным образом, дефекты IFT м. затрагивать несколько систем органов — включая почки и глаза — у людей. В этом отношении интеречны некоторые синдромы у людей — напр., Maintenance and control of flagellar length Как обсуждалось выше, IFT необходим и для сборки и для поддержания флагеллума. Аксонемы жгутиков, как полагают, очень стабильны, тогда почему необходим IFT для поддержания полностьюсформированных жгутиков? Роказано, что на самом деле аксонемы подвергаются дособно интенсивному обмену белков. В самом деле, плюс (дистальные) концы микротрубочек жгутиков постоянно обмениваются и нуждаются в постоянном притоке жгутиковых предшественников для поддержания длины жгутиков. IFT поставляет эти предшественникм — если же IFT ингибирован сдвигом у Chlamydomonas fla10ts мутантных клеток к рестриктивной температуре, то жгутики укорачиваются со скоростью оборота Открытие, что аксонемы подвергаются постоянному обмену указывает на то, что длина полностью сформированных жгутиков м. предопределяться балансом между скоростью разборки на кончике жгутика и скоростью, с которой замещаются аксонемные предшественники на кончике с помощью IFT. Так было показано, что Chlamydomonas fla10ts клетки, которые поддерживаются при промежуточной температуре, при которой антероградный IFT motor kinesin-II частично активен, имеют жгутики промежуточной длины. Возможно, что IFT выполняет непосредственную роль по контролю длины жгутиков.
Carrying signals to and from the flagellum IFT v/ также выполнять роль по транспорту сигналов из флагеллума в тело клетки и обратно. Во время спаривания, клетки Chlamydomonas противоположных типов спаривания снаачала касаются др. др. своими жгутиками. В результате этого сигнал посылается от жгутика к телу клетки о инициации 'gamete activation' — сложной серии событий, которые ведут к слдиянию клеток и формированию зиготы. После слияния клеток сигнал отсылается от тела клетки к жгутику, чтобы инактивровать слипание жгутиков. Некоторые из этих сигналов м. транспортироваться с помощью IFT. В самом деле, сдвиг fla10ts клеток к рестриктивной температуре блокирует активацию гамет. Более того, вновь открытая протеин киназа, которая движется к флагеллуму во время активации гамет является грузом kinesin-II. Возможно, что IFT м. выполнять сходную роль в передаче polycystin-generated сигналов из первичных ресничек в тело клетки в почечных канальцах и в передаче somatostatin-generated сигналов из первичных ресничек в головном мозге млекопитающих. Такие сигналы м. переноситься или как белки, которые станут IFT грузом, когда активируются, или как пост-трансляционные модификации , которые происходят непосредственно в белками IFT-частиц как одна из ступеней на пути передачи сигналов.
Conclusion and perspective IFT was discovered originally as a result of basic research on the
flagella of the biflagellated green alga Chlamydomonas reinhardtii.
As the specific genes and proteins involved in IFT were identified, it
became possible, for the first time, to control the assembly of flagella
and cilia, by manipulating IFT in Chlamydomonas, C. elegans
and mice. This has led to a host of new insights into the roles of cilia
and flagella, including the possible functions of the nearly ubiquitous
primary cilium, the mechanism for the development of left–right asymmetry
in mammals, and the aetiology of some important human diseases. The
continuing investigation of the dynamic process of IFT in cilia and
flagella promises to reveal more secrets that are hidden in these
important, but often overlooked, cell organelles.
|