CELL ADHESIONS
Фокальные Сайты Адгезии
March 2002 Vol 3 No 3 V-SRC'S HOLD OVER ACTIN AND CELL ADHESIONS Margaret C. Frame, Valerie J. Fincham, Neil O. Carragher, John A. Wyke Nature Reviews Molecular Cell Biology 3, 233-245 (2002)
The oncoprotein v-Src and its cellular homologue (c-Src) are tyrosine kinases that modulate the actin cytoskeleton and cell adhesions. Through the concerted action of their protein-interaction and kinase domains, they are targeted to cell–matrix integrin adhesions or cadherin-dependent junctions between epithelial cells, where they phosphorylate substrates that induce adhesion turnover and actin re-modelling. Recent experiments have defined some of the key targets and effector pathways that mediate the pleiotropic oncogenic effects of v-Src. (Рис.1.) \| v-Src transformation. (Рис.2.) \| Adhesion stabilization by kinase-defective v-Src. (Рис.3.) \| Calpain and cell migration. (Рис.4.) \| Calpain proteolysis of FAK. (Рис.5.) \| EGFR and calpain. (Рис.6.) \| Calpain mediates Src-induced growth and de-adhesion. Boxes Box 1 \| Structural domains of c-Src and mutations in ts LA29 v-Src Box 2 \| The calpain protease family Box 3 \| Summary of mammalian cell-cycle regulation Progression through the G1–S phase transition of the cell cycle represents a key point of control in cell growth. Once cells have entered S phase, they are committed to completion of the remaining S, G2 and M phases of the cell cycle. Specifically, passage through G1 is dependent on the activity of members of the cyclin-dependent-kinase family (Cdk4, Cdk6 and Cdk2). CDK activity requires physical association with specific members of the cyclin protein family and the CDK–cyclin complex can be inactivated by interaction with a family of CDK inhibitors (CKIs) that include p21^Cip1 and p27^Kip1. Cdk4 and Cdk6 that are associated with cyclin D, and Cdk2 that is associated with cyclin E, promote progression through G1 by inducing hyperphosphorylation of the retinoblastoma gene product, Rb. Non-phosphorylated or weakly phosphorylated Rb binds to the E2F FAMILY OF TRANSCRIPTION FACTORS and thereby suppresses E2F-mediated transcription of proliferation-associated genes. Cdk4–Cdk6–cyclin D- or Cdk2–cyclin-E-induced hyperphosphorylation of Rb impairs its ability to sequester E2F, thereby releasing E2F to activate the transcription of genes, such as cyclin A and cyclin E, that are required for progression into S phase. Links Interpro: SH2 \| SH3 LocusLink: FAK Saccharomyces Genome Database: VPS34 Swiss-Prot: E-cadherin \| calpain 1 \| calpain 2 \| calpain 4 \| calpain 6 \| calpastatin \| β-catenin \| Cdk2 \| Cdk4 \| Cdk6 \| c-Src \| EGF \| EGFR \| Fyn \| GFP \| Grb2 \| myosin light chain kinase \| N-WASP \| paxillin \| p27^Kip1 \| p85 regulatory subunit of PI3K \| p190 RhoGAP \| Rac1 \| RhoA \| R-Ras \| Yes	Вирусный src ген, кодируемый Rous sarcoma virus (RSV) впервые определен как онкоген и показано, что это тирозин киназа. История v-Src и его клеточного аналога c-Src (прототип Src family kinase (SFK)), а также их маркеры позаолили понять внутриклеточную передачу сигналов и онкогенную трансформацию. Генерация мутантов RSV, не были условно дефектными или температуро-чувствительными (ts) в отношении трансформации, впервые показали, чо белок v-Src м. инициировать и поддерживать трансформацию клеток даже целиком независимо от репликации вирусов. Эти мутанты предоставили информацию о биологии ретровирусов и использованы в качестве маркеров в ранних исследованиях ретровирусной генетической рекомбинации и эпигенетической регуляции интегрированных провирусов. Однако, основное использование ts мутантов было в исследованиях неопластической трансформации при отсутствии вторичных генетических изменений, пут ем сравнения клеток, поддерживаемых при рестриктивной и пермиссивной температуре. Клетки, которые трансформированы с помощью RSV, теряют связанные в пучки актиновые филаменты и у них уменьшается число и размеры адгезий клетка-субстрат (называемых FOCAL ADHESIONS), к которым актиновые филаменты прикреплены (Рис.1). В результате происходит превращение клеток с довольно распростертой морфологией (Рис. 1a) в более изменчивую, удлинненую клеточную форму (известную как fusiform morphology), особенно в сложившихся клеточных линиях или в крайних случаях клетки округляются и отсоединяются от субстрата в культуре первичных фибробластов (Рис. 1b). Большинство адгезивных и ассоциированных с цитоскелетом субстратов v-Src идентифицировано в таких исследованиях. Сначала в фокусе был винкулин (vinculin), структурный белок, который обнаруживается в соединениях между клеточной актиновой сетью и рецепторами интегринового матрикса; и особенно занимал вопрос, является ли vinculin главным или критическим v-Src субстратом во время трансформации. Однако, не было установлено какой-либо очевидной корреляции между фосфорилированием винкулина и степенью трансформации, поэтому внимание было перенесено на др. субстраты, обеспечивающие адгезию и замену цитоскелета. Задействована быстрая обратимость ts v-Src функции. Рассмотрим доказательства, что v-Src транспортируется на периферию клетки, где и выполняет критическую функцию по регуляции актинового цитосклета и клеточным adhesions. Эффекты v-Src на эти клеточные структуры ультимативно приводят к округлой морфологии и уменьшению слипчивости трансформированных клеток. Параллельно c-Src также транспортируется в эквивалентные сайты, в которых его активность необходима для миграции клеток. Ожнако нельзя утверждать, что v-Src просто воспроизводит крайние и неконтролируемые фенокопии биологической функции c-Src в нормальном гомеостазе. Даже при избыточной экспрессии c-Src не м. трансформировать клетки, т.к. его киназная активность является предметом тонкой негатиной регуляции. Однако, постоянно активируемый c-Src м. индуцировть онкогенную трансформацию, это указывает на то, что v-Src и c-Src имеют общие, по крайней мере, эффекторы, которые детерминируют трансформированный феноип и пригодны для анализа м помощью ts мутантов v-Src. Обсуждается механизм направления v-Src к периферическим сайтам адгезии, функция этих адгезий как мест возникновения Src-обусловленной внутриклеточной передачи сигналов и эффекты v-Src's каталитической активности на интегриновые адгезии и ассоциированный цитоскелет — эффекты, обеспечиваемые эффекторами, такими как GTPase-activating protein p190 RhoGAP и focal adhesion kinase (FAK). В исследованиях, которые использовали ts v-Src, и MOTOGENIC симулы, включая epidermal growth factor (EGF), установлено участие calpain protease в de-adhesion, а также в др. аспектах трансформации. Наконец, обсуждается специальная роль v-Src и активного c-Src в CADHERIN-обеспечиваемой адгезии эпителиальных клеток. Peripheral targeting of v-Src and c-Src Установлено, что существенные количества v-Src расположены в плазматических мембранах. Однако, v-Src присутствует также в околоядерной области трансформированных клеток, будучи ассоциированы с актиновым цитосклетом и с residual focal adhesions. Локализация v-Src в клетках теперь м.б. исследована с помощью строго трансформирующих v-Src мутантов, ts LA29 (Box 1). При рестриктивной температуре — когда он неактивен — v-Src располагается в околоядерной области клетки. При сдвиге к пермиссивной температуре v-Src высвобождается из зависимой от микротрубочек околоядерной локализации и транслоцируется в периферические фокальные адгезии на концах RhoA-индуцированных actin STRESS FIBRES. Это направление на периферию не нуждается в киназном домене Src, но ингибируется с помощью точковой мутации в Src-homology-3 (SH3) домене взаимодействия с белком (Box 1). Более того, этот v-Src мутант не м. ассоциировать с полимеризованным актином, это указывает на то, что SH3 домен функционирует, обеспечивая связь v-Src с клеточными актиновыми филаментами. Используя эту SH3 точковую мутацию было показано, что связываение p85 регуляторной субъединицы phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) с v-Src SH3 доменом и последующее увеличение PI3K активности необходимы для направления v-Src в фокальные адгезии путем ассоцииации с актином. Это объясняет, каим образом SH3 мутанты v-Src обладают пониженной связываемостью с PI3K и если они вообще трансформируются, то клети принимают веретенообразную морфологию (fusiform). Этот промежуточный фенотип между нормальными и полностью округлившимися клетками, следовательно, является результатом неэффективной транслокации v-Src в соответствующие места действия на периферии клетки. Особая роль PI3K в направлении на периферию v-Src, по-видимому, заключается в поддержании интегральности actin stress-fibre, хотя это не исключает возможности того, что PI3K вносит свой вклад иным способом. В противоположность PI3K, heat-shock protein (HSP)-90, молекулярный хаперон, который связывается с v-Src во время его биогенеза, ассоциирует как с targeting так и non-targeting v-Src мутантами. Исследования с помощью ts LA29 v-Src не установили, что FAK играет ключевую роль в механизме периферического таргетинга v-Src's, однако недаво было показно, что мутация с избыточной функцией v-Src SH3 домена стабилизирует комплекс Src и FAK и его локализацию в ассоциированных с интегрином invadopodia. Следует иметь ввиду, что существенная пропорция экзогенно экспрессируемого c-Src дикого типа концентрируется вокруг ядра в фибробластах, ко-локализуясь с микротрубочками и с маркерами эндосом и с trans-Golgi network. Более того, постоянно активный c-Src направляется в фокальные адгезии на периферии клетки с помощью механизма, который нуждается только в N-терминальной половине молекулы, которая содержит SH2 и SH3 домены. В дополнение, укороченный Src fusion protein (amino acids 1–251), в котором киназный домен замещен на green fluorescent protein (Src251–GFP), обнаруживает постоянное периферическое местонахождения, хотя это все еще зависимт от активности малой GTPase RhoA. Это указывает на то, что комбинированное действие SH2 и SH3 доменов в Src и актиновые stress fibres позволяют Src251–GFP перемещаться от околоядерной области к фокальным адгезиям. Кроме того, усатановлено, что оказавшись на периферии клетки Src направляется к специфическим сайтам адгезии с помощью индивидуальных членов семейства Rho. Это, в свою очередь, зависит от эффектов этих GTPases на моделирование цитосакелета: RhoA направляет Src к фокальным адгезиям, Rac1 направляет к фокальным комплексам вдоль LAMELLIPODIA, а Cdc42 направлет его к фокальным комплексам вдоль FILOPODIA. Итак, оба v-Src и c-Src направляются к клеточным адгезиям из зависимого от микротрубочек околоядерного положения. Для транзита обоих требуется функция домена SH3 — в общем-то мдулированного с помощью SH2 домена — помимо актиновых филамент, которые пееспекают поперек нижнюю часть клетки. Однако, прямое связывание, и, следовательно, роль, p85 и PI3K в направлении c-Src не обнаружена, хотя c-Src, как известно, асоциирует с PI3K посредством вируса полиомы, кодируемого middle-T антигена. Учитывая ассоциацию v-Src и c-Src с PI3K — по крайней мере, при некоторых условиях — и вовлечение VPS34 дрожжевого гомолога p110 каталитической субъединицы PI3K млекопитающих в везикулярный транспорт, м. предположить, что vesicle-зависимый компонент м. участовать в процессе доставки в места адгезии. Известно, что c-Src ко-локализуется с эндосомными маркерами (которые указывают на появление мембранного транспорта) в околоядерной области. Однако, если имеется vesicle-зависимый компонент направления на периферию v-Src или c-Src, то не совсем ясно, как это скоординировано с регуляцией необходимых цитоскелетных событий. Показано, что c-Src ассоциирует с GAP (GTPase-activating protein), специфичным для Arf GTPases, которая хорошо известна своим конролем мембранного транспорта. Более того, Src SH3-связывающая ArfGAP, ASAP1, индуцирует также ремоделирование цитосклета в клетках. Focal adhesions as intracellular signalling sites Установлена роль фокальных адгезий (focal adhesions) как мест накопления сигнальных белков, таких как SFKs (Src, Fyn и Yes), их эффекторной киназы FAK и p85 регуляторной субъединицы PI3K. Связываение лигандов внеклеточного матрикса с их интегриновыми рецепторами необходимо для доставки на периферию v-Src, т.к. v-Src остаются в нижней части клеток, когда клетки распластаны на матриксе, который не использует интегрины для прикрепления. Это неожиданно, т.к. часто v-Src функционирует, как полагают, независимо от нормальных средовых сигналов. Это указывает на то, что индуцированная интегринами передача внутриклеточных сигналов необходима не только для сборки структур фокальных адгезий, но и для включения сигнальных молекул, таких как сама v-Src. Новые фокальные адгезии, которые стимулируются активацией ts v-Src содержат также некоторые extracellular-signal regulated kinase (ERK)/mitogen-activated protein kinase (MAPK). Фосфорилирование myosin light chain kinase, которая зависит от пути ERK/MAPK и усиливает активность миозина, необходимо для направления ERK/MAPK к фокальным адгезиям. Потребность в активности миозина согласуется с необходимостью контрактильных актиновых филамент для направления ERK/MAPK к периферии клетки. В клетках рака толстой кишки активность ERK/MAPK индуцирует образование коротких контрактильных актиновых структур на периферии клетки, которые необходимы для полного развития интегрин-зависимых адгезий. Мультидоменовый адапторный белок фокальных адгезий paxillin идентифицирован в качестве субстрата для пути ERK/MAPK после активации v-Src (Online Figure) и ERK/MAPK непосредственно фосфорилируют paxillin in vitro и в клетках thymoma в ответ на воздействие PHORBOL ESTERS (который активирует ERK/MAPK). Реципрокные влияния ERK/MAPK и paxillin на локализацию и/или активность др. др. еще неясны. Взаимоотношения между цитоплазматической ERK/MAPK, которая рекрутируется в фокальные адгезии, и ERK/MAPK, которая транслоцируется в ядро после активации, также не известны, хотя направление в ядро ERK/MAPK связано с реорганизацией актина, который появляется ниже интегриновых скоплений (engagement). Итак, хотя фокальные адгезии и обеспечивают физическую связь между внеклеточным матриксом и клеточным актиновым цитосклетеом, они кроме того действуют как клеточные опоры, предоставляющие кров для сигнальных белков, таких как ERK/MAPK и PI3K, хотя их ассоциации м.б. лишь временными. v-Src activity at peripheral adhesions Быстрым следствием активации v-Src является замещение фокальных адгезий малыми богатыми актином структурами, известными как podosomes. Это аналоги динамических сайтов прикрепления матрикса, обнаруженных в аклетках клона моноцитов, таких как др. др. MACROPHAGES и OSTEOCLASTS. Хотя они также являются организованными структурами, которые содержат белки, сходные с теми, что обнаружены в фокальных адгезиях, их архитектура другая. В частности, podosomes не содержат прикрепленных к ним актиновых стрессовых волокон, но м. формировать временные прикрепления к матриксу, необходимые при быстром перемещени клеток и для инвазивности трансформированных клеток. Так, когда v-Src-трансформированные 3Y1 фибробласты крыс помещены на фибронектин, то они они обнаруживают деградацию матрикса под подосомами, благодаря присутствию METALLOPROTEINASES в этих местах. Одним из важных субстратов для v-Src является cortactin, белок, связывающий в пучки F-актины, который локализуется в podosomes и lamellipodia. Установлено, что cortactin ассоциирует с и активирует Arp2/3, белковый комплекс, который необходим для nucleate образования сети актиновых филамент. Это взаимодействие происходит благодаря N-терминальной кислой области cortactin, к функционирует аналогично со сходной областью семейства Wiskott Aldrich Syndrome protein (WASP). Сortactin стабилизирует сборку актиновых филамент, индуцированную Arp2/3 на периферии клетки и м., следовательно, участовать в формировании подосом. Помимо cortactin, v-Src субстрат p110AFAP (actin-filament-associated protein) и N-WASP (neuronal WASP) также накапливаются в v-Src-индуцированных подосомах, а ингибирующий мутант N-WASP ингибирует формирование подосом и деградацию матрикса, индуцируемую v-Src. Следовательно, регуляторы актина выполняют критическую функцию в обеспечении сборки динамически регулируемых подосом, которая индуцируется v-Src, и это обусловливает миграторный и инвазивный фенотип. Будучи локализованными в периферических сайтах, каталитические активности v-Src ведукт к разрушению адгезий и разборке ассоциированных с ними актиновых кабелей (Рис.1). По аналогии, каталитическая активность v-Src м.б.также ответственна за смену динамически регулируемых подосом на периферии трансформированных клеток, однако это не подтверждено экспериментально. Напротив, если белок v-Src лишен каталитической активности(Lys-to-Arg мутация в акивном сайте; Box 1), то он транслоцируется в предсуществующие фокальные адгезии, где он стабилизирует актиновые кабели и увеличивает фокальные адгезии в результате нарушения в них обмена (Рис.2). Редукция обмена фокальных адгезий нарушает миграцию клеток, тогда как клетки с малыми адгезиями оказываются более подвижными. Накапливаютс доказательтва того, что эндогенные SFKs играют важную роль в миграции клеток, т.к. интегрин-зависимая миграция клеток нарушена у эмбрионов мыши, лишенных c-Src, Fyn и Yes. Кроме того, потеря c-Src обусловливает усиление связи между интегринами — продемонстрировано для vitronectin рецепторов — и силой сгенерированным цитоскелетом, это указывает на то, что нормальная роль c-Src ослаблять или разрушать такие связи. Клетки, в которых отсутствует FAK также обнаруживают увеличенные фокальные адгезии и нарушенную миграцию,это указывает на критическую роль связанных активностей Src и FAK в индукции смены адгезий или их ремоделировании, что облегчает движение клеток. С этим согласуется то, что экспрессия kinase-deficient Src251–GFP fusion белка супрессирует ремоделирование адгезий, которая превращает RhoA-зависимые фокальные адгезии в малые фокальные комплексы вдоль Rac1-индуцированных lamellipodia ли Cdc42-индуцированных filopodia. Соответственно, клетки, в которых Src251–GFP занимает перифереические сайты адгезии, обнаруживают нарушение поляризации в направлении миграторных стимулов и снижение подвижности, что сопровождается снижением FAK фосфорилирования. Bnfr, v-Src рекрутируется в периферические сайты активности зависимым от актиновых филамент способом и затем исползуется для разрушения актиновых филамент в результате ее несдерживаемой киназной активности. Кроме того, Src SH2 и SH3 домены важны для сбоки адгезивного комплекса, тогда как каталитическая активность v-Src на периферии клетки м. индуцировать разрушение и смену адгезий. Предполагается, что Src белок участвует в контроле не только сборки периферических адгезий и ассоциированных актиновых структур — посредством SH2 и SH3 доменов — но также и в разборке этих структур — посредством обычно высоко регулируемой киназной активности. В результате чрезвычайно тонкого контроля динамики актина и адгезий обеспечивается регулируемая подвижность клеток. Недавно установлен др. механизм, с помощью которого v-Src влияет на адгезию клеток. Специфически, R-Ras является мишенью для v-Src-индуцированного фосфорилирования в Tyr66, что супресирует интегриновую активность. Это м. вносить вклад в снижение адгезии в Src-трансформированных клетках и, в свою очередь, в инвазию опухолевых клеток. Рассматрим два эффекторных пути ниже активности v-Src, p190 RhoGAP и FAK–calpain, которые м. участвовать в этих эффектах. Disruption of actin stress fibres: p190 RhoGAP Имеются доказательства того, что p190 RhoGAP играет важную оль. p190 RhoGAP является p120 RasGAP-ассоциированным белком, который фосфорилирован по тирозину в v-Src-трансформированных клетках, и имеет GAP домен на своем С-конце, который специфичен для Rho белков — особенно RhoA. Микроинъекции изолированного GAP домена в клетки блокирует RhoA-обусловленное образование stress-fibre, это указывает на то, что RhoGAP м противодействоывать функции RhoA in vivo. Кроме того, когда SH2 и SH3 домены p120 RasGAP экспрессируются. то они связываются постоянно с p190 RhoGAP и разрушают актиновые стрессовые волокна, это указывает на то, что p120 RasGAP–p190 комплекс негативно модулирует актиновый цитосклет. Активация ts v-Src индуцирует связывание фосфорилированного по тирозину p190 RhoGAP с p120 RasGAP и стимуляцию p120-RasGAP-ассоциированной RhoGAP активности. Эти события необходимы для каталитической активности v-Src и связаны с разрушением стрессовых волокон во время трансформации. В активированной форме RhoA, VRhoA, которая нечувствительна к активности RhoGAP, супрессирует v-Src-индуцированную потерю стрессовых волокон и трансформацию, это показывает, что v-Src м. противодействовать функции RhoA, чтобы индуцировать разрушение актина и эта p190 RhoGAP является прекрасным кандидатом на роль супрессирующей активности RhoA. Т.к. антогонизм RhoA, по-видимому, ключевое событие в v-Src-индуцированной трансформации клеток, то c-Src также должен регулировать p190 RhoGAP и если это так, то каковы биологические последствия? Установлено, что хотя продолжительное ангажировние интегринов активирует RhoA, но оно, по-видимому, происходит как результат c-Src-зависимой фосфорилияции тирозина p190 RhoGAP. Это было предположено для локальных контрактильных сил в местах скоплений интегринов, которые облегчают выпячивание ведущего края мигрирующих клеток. В соответствии с этим, интегрином-индуцированное ингибирование RhoA с помощью p190 RhoGAP облегчает распластывание и миграцию за счет регуляции выпячивания и полярности мембраны. Было также предположено, что p190 RhoGAP является предпочтительным субстратом для c-Src во время EGF рецептором (EGFR)-опосредованного EPITHELIAL–MESENCHYMAL TRANSITION. Избыточная экспрессия c-Src в 10T1/2 фибробластах усиливает фосфорилирование основного тирозина p190 RhoGA и это обеспечивает биологически важные изменения цитоскелета эпителиальных клеток. p190 RhoGAP , как полагают, является важным Src субстратом в нервной системе, p190 RhoGAP индуцирует Src-зависимый адгезивный сигнал, который важен для нейрогенеза. Итак, p190 RhoGAP является критическим медиатором c-Src- и v-Src-индуцируемой модуляции клеточной функции RhoA и актинового цитоскелета. Показано, что v-Src индуцирует нарушения цитосклетеа за счет противодействующей способности RhoA поддерживать контрактильные пучки актиновых стрессовых волокон, это согласуется с тем, что v-Src индуцирует изменения актина, которые обусловлены скорее разборкой микрофиламент, чем деполимеризацией актина. Однако, взаимоотношения между Src и p190 RhoGAP сложные и некоторые аспекты функции Src м. негативно регулировать p190 RhoGAP у Drosophila melanogaster нейральную пластичность. Focal adhesion turnover: FAK and calpain Установлено, что FAK м.б. нижестоящей мишенью активности Src, которая разрушает фокальные адгезии. Согласуется с этим и киназная активность ts v-Src, индуцирующая фосфорилирование FAK в специфических осттатках тирозина, диссоциацию FAK–v-Src комплекса, протеолиз FAK и нарушения или обмен фокальных адгезий, которые ассоциируют с трансформацией и подвижностью. Однако, ts v-Src-индуцированная деградация и потеря FAK из строго трансформированных первичных клеток представляет собой крайний фенотип, который связан с потерей способности клеток прикрепляться. v-Src-индуцированный FAK протеолиз м.б. все еще важным в усилении обмена во время регуляции динамической адгезии и подосом в стабильно трансформированных клетках, однако при этих условиях скорость FAK протеолиза м.б. сбалансирована с помощью компенсаторного увеличения скорости синтеза FAK. Тем не менее, крайнее разрушение фокальных адгезий, индуцированное сильно трансформированными ts v-Src в первичных эмбриональных фибробластах (Рис. 1), не позволяют изучать механизм разборки адгезий и указывает тем самым на calpain-зависимое протеолитическое расщепление FAK в этом процессе. Calpains высоко законсервированное семейство внутриклеточных нелизосомных кальций-зависимых цистеин протеаз. Имеется две повсеместно распространенные изоформы — μ-calpain (calpain 1) и m-calpain (calpain 2) — некоторые тканеспецифичные изоформы и малая в 28-kDa регуляторная субъединица (calpain 4)(Box 2). In vivoактивность calpain тонко регулируется его высоко специфичным эндогенным ингибитором, calpastatin. Роль активности calpain в подвижности клеток выявлена в исследованиях с использованием ингибиторов calpain, которые супрессируют миграцию клеток по фибронектину. В частности, ингибирование calpain вызывает нарушение ретракции задней части клетки, увеличение длины хвоста подтягиваемого края — что отражает супрессию де-адгезии и уменьшение подвижноси клетки. Итак, это связывает calpain с процессом отсоединения клетки. Более того, колокализация calpain 2 со структурами локальных адгезий и идентификация некоторых предположительно calpain субстратов — включая Src, paxillin, talin и α-actinin — которые располагаются в клеточных адгезиях, все это говорит о ом, что calpain функционально активен в фокальных адгезиях и м способствовать их разборке, что ведет к уменьшению силы интегрин-обусловленных адгезий между клетками и матриксом и к усилению клеточной миграции (Рис. 3). Если активирован ts v-Src, то calpain способствует протеолитическому расщеплению FAK, еоторое происходит прежде, чем произойдет потеря фокальных адгезий и трансформация клетки. Ингибирование calpain, избыточная экспрессия calpastatin, или генетический нокаут регуляторной субъединицы calpain 4 супрессируют индуцированное v-Src разрушение фокальных адгезий, потерю субстрата адгезии и миграцию трансформированных клеток, это указывает на то, что calpain-зависимый протеолиз причинно связан с трансформацией и подвижностью клеток. Calpain-зависимый протеолиз, который индуцируется после активации v-Src, по-видимому, каким-то образом избирателен для FAK. Показано, что FAK первоначально расщепляется с помощью калпаина на Т-терминальный фрагмент в 95-kDa и С-терминальный фрагмент в 30-kDa. Первый высвобождается из цитоскелетной фракции в цитоплазму, где он в дальнейшем расщепляется на фрагменты в 40–50 kDa (Рис. 4). Итак, вызываемое калпаином расщепление FAK вызывает диссоциацию focal-adhesion-targeting (FAT) последовательностей от N-терминальных киназных доменов и потерю каталитической активности FAK в фокальных адгезиях. Это указывает на то, что протеолитическое расщепление м. представлять собой важный механизм супрессии адапторной и каталитической функций FAK в фокальных адгезиях и тем самым негативно регулировать как интегральнойсть фокальных адгезий, так и клеточные реакции, вызываемые FAK (Рис. 4). Это подтверждает предположение, что разрушение transmembrane–cytoskeletal связей, которое индуцируется v-Src м. "возникать в результате отсутствия одного из компонентов, из-за расщепления с помощью литических энзимов, таких как протеаза". Calpain as a general regulator of cell de-adhesion. EGF-индуциованная клеточная подвижность опосредуется, частично, через уменьшение клеточной адгезии с субстратом внеклеточного матрикса.Показано, что обработка EGF линии клеток фибробластов вызывает быструю стимуляцию активности calpain 2, тогда как ингибирование calpain предупреждает EGF-индуцируемую клеточную де-адгезию и миграцию. Нарушение ERK/MAPK сигнального пути ингибированием MAPK/ERK kinase (MEK) предупреждает активацию калпаина в ответ на EGF, тогда как экспрессия постоянно активной MEK активирует calpain в отсутствие EGF. Все это говорит о том, что ERK/MAPK путь связывает передачу сигналов EGFR с активацией калпаина и клеточной де-адгезией, необходимыми для подвижности (Рис. 5). Главные calpain субстраты, которые запускают EGF-индуцируемую де-адгезию, не идентифицированы, но FAK участвует в интеграции EGFR- и integrin-зависимых сигналов, которые способствуют миграции клеток. Мледовательно, активность c-Src необходима как для MITOGENIC так и мотогенных эффектов EGF в разных типах клеток, это позволяет предполагать, что одна из ролей c-Src, стоящего ниже EGFR, - это индукция калпаин-обусловленного протеолиза FAK, который стимулирует смену адгезий и клеточную миграцию. Возможно, что и v-Src и EGFR стимулируют передачу сигналов ERK/MAPK, а последние необходимы для EGF-индуцируемой активации калпаина, активность ERK/MAPK необходима также для активации калпаина в ответ на v-Src. Известно, что некоторые ERK/MAPK локализуютс в фокальных адгезиях после активации ts v-Src. Вообще adhesion-associated ERK/MAPK необходимы для полной активации калпаина, который, в свою очередь, расщепляет FAK и запускает разборку фокальных адгезий. Calpain protease and cell-cycle regulation. Идентифицирована позитивная петля обратной связи, с помощью которой активация v-Src вызывает увеличение трансляции calpain 2, который, в свою очередь, ведет к деградации его физиологического ингибитора, calpastatin. Восстановление уровня calpastatin супрессирует протеолиз FAK и морфологическую трансформацию, это указывает на то, что v-Src-индуцированная стимуляция активности калпаина необходима для трансформации. Избыточная экспрессия calpastatin также ингибирует прохождение v-Src-трансформированных клеток через G1 фазу клеточного цикла (Box 3). Aктивация v-Src обычно способствует повышенной экспрессии cyclin A, cyclin D и CYCLIN-DEPENDENT KINASE 2 (Cdk2) и гиперфосфорилированию retinoblastoma protein (Rb), который стимулирует прохождение через G1 и усиливает пролиферацию v-Src-трансформированных клеток. Однако, избыточная экспрессия calpastatin ингибирует эти эффекты (Рис. 6). Это указывает на роль активности калпаина в обеспечении, по крайней мере, некоторых эффектов v-Src на ход клеточного цикла. Точный механизм, с помощью которого обеспечивается фосфорилирование Rb и уровни cyclin A, cyclin D и Cdk2 во время Src-индуцированной трансформации, остается неизвестным. Однако, показано, что калпаин расщепляет p27^Kip1, указывая тем самым, что калпаином обусловленный обмен cyclin-dependent-kinase inhibitors (CKIs) м. способствовать течению клеточного цикла. Напротив, транслокация calpastatin в клеточное ядро во время Src трансформации м. ингибировать обмен ядерного субстрата калпаина, такого как cyclin D, который затем влияет на фосфорилирование Rb. Calpain расщепляет многочисленные факторы транскрипции. Итак, calpain м. косвенно влиять на течение клеточного цикла путем регуляции обмена транскрипционных факторов, которые активируют экспрессию генов, контролирующих клеточный цикл. Кроме того, ингибиторы калпаина, избыточная экспрессия calpastatin или нокаут calpain 4 обусловливают супрессию v-Src-индуцированного якорь (anchorage)-независимого роста — классического признака онкогенной трансформации.Это указывает на то, что регуляция активности калпаина после активации ts v-Src обладает многочисленными эффектами: облегчает оборот фокальных адгезий и влияет на кухню (machinery) клеточного цикла, которая осуществляет прохождение через G1. Итак, протеолитическая активность калпаина м. служить как общая связка между динамической регуляцией адгезии и пролифераци клеток. В контексте ts v-Src-трансформированных клеток, способность калпаина влиять на некоторые реакции, которые инициируют клеточные адгезии, вносит свой вклад в anchorage-независимый рост. Механизмы, с помощью которых калпаин дерегулирует v-Src-индуцированную экспрессию циклинов, активность CDK и фосфорилирование Rb, неизвестны. Не известно и то, калпаин или другие протеазы вызывают c-Src-зависимые эффекты на передачу митогенных сигналов, которые индуцируются с помощью рецепторов ростовых факторов, таких как platelet-derived growth factor receptor (PDGFR). Src activity at cadherin-dependent adhesions v-Src aи эндогенный SFKs присутствуют в ADHERENS JUNCTIONS между эпителиоидными клетками почек крыс, а также в фокальных адгезиях. Имеются доказательства, что фосфорилирование тирозинов, обеспечиваемое SFKs играет роль в разрушении адгезий между эпителиальными клетками.Напр., экспрессия v-Src в клетках крыс и кур нарушает кадхерин зависимые межклеточные адгезии. Кроме того, Madin–Darby canine kidney (MDCK) эпителиальные клетки, которые трансформированы с помощью ts v-Src имеют эпителиальный фенотип при непермиссивной температуре, но быстро теряют межклеточные контакты и приобретают фибробласт подобную морфологию при пермиссивной температуре. В этих клетках активность v-Src, ассоциированая с повышенной фосфориляцией тирозина E-cadherin, β-catenin и др. белков слипчивых соединений, пробуждает кадхерин-зависимые межклеточные адгезии и вызывает дедифференцировку и инвазивность. Идентифицирован медиатор v-Src-индуцируемых нарушений межклеточных адгезий, который функционирует, регуллируя эндоцитоз E-cadherin. Идентифицирована новая E3 UBIQUITIN PROTEIN LIGASE,названная Hakai, которая ассоциирует с E-cadherin зависимым от фосфорилирования тирозина способом и контролирует ubiquitylation и эндоцитоз E-cadherin–β-catenin комплекса. Hakai м. функционировать как посттрансляционный регулятор стабильности E-cadherin, которая чувствительна к активности v-Src. Более того, Ras-трансформированные эпителиальные клетки груди также плохо формируют межклеточные соединения и ассоцированное увеличение фосфорилирования тирозинов белков слипчивых соединений. Все это указывает на то, что фосфорилирование тирозинов обычно ассциирует с разрушением адгезий между эпителиальными клетками. Имеются доказательства, что фосфорилирование тирозинов, обеспечиваемое эндогенными SFKs, вносит вклад в дестабилизацию эпителиальных адгезий. Напр., факторы миграторного роста, такие как hepatocyte growth factor (известный также как scatter factor) или EGF, индуцируют дисперсию нормальных и злокачественных эпителиальных клеток, возможно, индуцируя фосфорилирование тирозинов адгезивных белков. Кроме того, EGF-индуцированная дисперсия клеток карциномы мочевого пузыря крыс нуждается в активности c-Src. В одном исследовании KERATINOCYTES Fyn-дефицитных мышей выявлены пониженные уровни tyrosine-phosphorylated β- и γ-catenin белков, что сопровождается структурными и функциональными аномалиями клеточной адгезии. В том же исследовании кожи мышей с нарушением как Fyn так и c-Src генов выявлено снижение фосфорилирования тирозинов β-catenin и структурные изменения, которые связаны с нарушениями межклеточной адгезии кератиноцитов. Следовательно, фосфорилирование тирозинов м. играть и позитивную роль в сборке межклеточных адгезий между нормальными кератиноцитами. Однако, в др. исследовании, все три SFKs ко-рекрутировались вместе с E-cadherin в кальцием индуцированные межклеточные адгезии кератиноцитов. Фармакологическое и молекулярное ингибирование активности Src-tyrosine-kinase в первичных кератиноцитах человека способствует стабилизации межклеточных контактов и поставке E-cadherin в области контактов, даже при относительно низких концентрациях кальция, которые обычно не поддерживают сильную кадхерином-обеспечиваемую адгезию. Подтверждено, что ингибирование каталитической активности эндогенных SFKs усиливает кадхерином обеспечиваемые межклеточные контакты, которые указывают на то, что SFK-зависимое фосфорилирование обычно необходимо для ослабления или разрушения этих структур. Кажущиеся противоречивыми заключения м.б. примерены мультидоменовой природой Src киназ и различиями в экспериментальных подходах. Показано, что белковые продукты c-Src и Fyn генов необходимы для собственно сборки контактов между кератиноцитами in vitro и in vivo. Напротив, киназная активность необходима для разборки кадхерин-зависимых межклеточных адгезий. По-видимому, Src SH2 и SH3 домены необходимы для сборки межклеточных адгезий, тогда как каталитическая активность в сайтах адгезии запускает их последующую разборку. Это похоже на потребность в функции v-Src SH3-домена во время сборки фокальных адгезий, которые содержат онкобелок, и на роль ее киназной активности в последующем обороте фокальных адгезий во время трансформации и миграции клеток. Предполагается, что калпаин регулирует оборот кадхерин-катениновых комплексов. Src-индуцированная регуляция калпаина м. влиять на интегральность кадхерином обеспечиваемых межклеточных адгезий и передачу внутриклеточных сигналов, исходящих из этих мест. Future directions Остаются нерешенными вопросы о природе SH3 связываемых партнерах и последовательности событий, ведущих к v-Src переключению между микротрубочковыми и актиновыми сетями и к изменению положения из околоядерной области (вообще из эндосом в области Гольджи) через нижнюю часть клетки к адгезивным комплексам плазматических мембран. Хотя SH3-доменом обеспечиваемое связывание PI3K необходимо, оно не единственное. Существует последовательное связывание нескольких Src SH3-взаимодействующих белков, которые обеспечивают перенос между субклеточными компартментами, а порядок связывания предопределяется и доступностью (близостью к Src) и относительным сродством связывания партнеров. Известтно несколько потенциальных SH3-домен-связывающих партнеров. Напр., Src SH3 domain-binding Arf-GTPase-activating protein (ASAP1, известный также как centaurin β4) v/ осуществлять связь между направлением Src и скоординированной регуляцией мембранного транспорта и моделирование цитоскелета. А Src SH3 domain-binding mDia белки (гомологи у млекопитающих Diaphanous-related formin белков, которые связывают RhoA со сборкой актиновых филамент), м. обеспечивать связь между актин-зависимым транзиом Src через нижнюю часть клетки и сборкой актиновых филамент. Возникает также вопрос, может ли активность ERK/MAPK вносить вклад в цикл сборки-разборки или она выполняет чисто сигнальные функции. Неясно значение MEK-зависимого фосфорилирования paxillin. Не выяснена связь между Src-зависимой фосфориляцией тирозина в FAK и стабильностью FAK белка. Получены предварительные данные, что фосфорилирование регулирует способность FAK действовать в качестве субстрата для calpain. Кроме того, т.к. FAK не является единственной мишенью для calpain в местах адгезии, необходимо идентифицировать и др. v-Src-индуцируемые протеолитические мишени и установить порядок событий расщеплния. Интересно установить, вносит ли вклад Src-индуцируемая модуляция calpain–calpastatin системы или индуцируемый протеолиз в межклеточных адгезияхв фенотип эпителиальных опухолевых клеток с повышенной активностью Src. Чтобы понять онкогенные эффекты надо знать молекулярные механизмы, контролирующие внутриклеточные перемещения v-Src и c-Src в интегриновые адгезии, контролирующие сборку интегрин-связанных мультипротеиновых комплексов после того как клетка прикрепляется к внеклеточному матриксу.

Вирусный src ген, кодируемый Rous sarcoma virus (RSV) впервые определен как онкоген и показано, что это тирозин киназа. История v-Src и его клеточного аналога c-Src (прототип Src family kinase (SFK)), а также их маркеры позаолили понять внутриклеточную передачу сигналов и онкогенную трансформацию. Генерация мутантов RSV, не были условно дефектными или температуро-чувствительными (ts) в отношении трансформации, впервые показали, чо белок v-Src м. инициировать и поддерживать трансформацию клеток даже целиком независимо от репликации вирусов. Эти мутанты предоставили информацию о биологии ретровирусов и использованы в качестве маркеров в ранних исследованиях ретровирусной генетической рекомбинации и эпигенетической регуляции интегрированных провирусов. Однако, основное использование ts мутантов было в исследованиях неопластической трансформации при отсутствии вторичных генетических изменений, пут ем сравнения клеток, поддерживаемых при рестриктивной и пермиссивной температуре.

Клетки, которые трансформированы с помощью RSV, теряют связанные в пучки актиновые филаменты и у них уменьшается число и размеры адгезий клетка-субстрат (называемых FOCAL ADHESIONS), к которым актиновые филаменты прикреплены (Рис.1). В результате происходит превращение клеток с довольно распростертой морфологией (Рис. 1a) в более изменчивую, удлинненую клеточную форму (известную как fusiform morphology), особенно в сложившихся клеточных линиях или в крайних случаях клетки округляются и отсоединяются от субстрата в культуре первичных фибробластов (Рис. 1b). Большинство адгезивных и ассоциированных с цитоскелетом субстратов v-Src идентифицировано в таких исследованиях. Сначала в фокусе был винкулин (vinculin), структурный белок, который обнаруживается в соединениях между клеточной актиновой сетью и рецепторами интегринового матрикса; и особенно занимал вопрос, является ли vinculin главным или критическим v-Src субстратом во время трансформации. Однако, не было установлено какой-либо очевидной корреляции между фосфорилированием винкулина и степенью трансформации, поэтому внимание было перенесено на др. субстраты, обеспечивающие адгезию и замену цитоскелета. Задействована быстрая обратимость ts v-Src функции.

Рассмотрим доказательства, что v-Src транспортируется на периферию клетки, где и выполняет критическую функцию по регуляции актинового цитосклета и клеточным adhesions. Эффекты v-Src на эти клеточные структуры ультимативно приводят к округлой морфологии и уменьшению слипчивости трансформированных клеток. Параллельно c-Src также транспортируется в эквивалентные сайты, в которых его активность необходима для миграции клеток. Ожнако нельзя утверждать, что v-Src просто воспроизводит крайние и неконтролируемые фенокопии биологической функции c-Src в нормальном гомеостазе. Даже при избыточной экспрессии c-Src не м. трансформировать клетки, т.к. его киназная активность является предметом тонкой негатиной регуляции. Однако, постоянно активируемый c-Src м. индуцировть онкогенную трансформацию, это указывает на то, что v-Src и c-Src имеют общие, по крайней мере, эффекторы, которые детерминируют трансформированный феноип и пригодны для анализа м помощью ts мутантов v-Src.

Обсуждается механизм направления v-Src к периферическим сайтам адгезии, функция этих адгезий как мест возникновения Src-обусловленной внутриклеточной передачи сигналов и эффекты v-Src's каталитической активности на интегриновые адгезии и ассоциированный цитоскелет — эффекты, обеспечиваемые эффекторами, такими как GTPase-activating protein p190 RhoGAP и focal adhesion kinase (FAK). В исследованиях, которые использовали ts v-Src, и MOTOGENIC симулы, включая epidermal growth factor (EGF), установлено участие calpain protease в de-adhesion, а также в др. аспектах трансформации. Наконец, обсуждается специальная роль v-Src и активного c-Src в CADHERIN-обеспечиваемой адгезии эпителиальных клеток.

Peripheral targeting of v-Src and c-Src

Установлено, что существенные количества v-Src расположены в плазматических мембранах. Однако, v-Src присутствует также в околоядерной области трансформированных клеток, будучи ассоциированы с актиновым цитосклетом и с residual focal adhesions. Локализация v-Src в клетках теперь м.б. исследована с помощью строго трансформирующих v-Src мутантов, ts LA29 (Box 1). При рестриктивной температуре — когда он неактивен — v-Src располагается в околоядерной области клетки. При сдвиге к пермиссивной температуре v-Src высвобождается из зависимой от микротрубочек околоядерной локализации и транслоцируется в периферические фокальные адгезии на концах RhoA-индуцированных actin STRESS FIBRES. Это направление на периферию не нуждается в киназном домене Src, но ингибируется с помощью точковой мутации в Src-homology-3 (SH3) домене взаимодействия с белком (Box 1). Более того, этот v-Src мутант не м. ассоциировать с полимеризованным актином, это указывает на то, что SH3 домен функционирует, обеспечивая связь v-Src с клеточными актиновыми филаментами.

Используя эту SH3 точковую мутацию было показано, что связываение p85 регуляторной субъединицы phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) с v-Src SH3 доменом и последующее увеличение PI3K активности необходимы для направления v-Src в фокальные адгезии путем ассоцииации с актином. Это объясняет, каим образом SH3 мутанты v-Src обладают пониженной связываемостью с PI3K и если они вообще трансформируются, то клети принимают веретенообразную морфологию (fusiform). Этот промежуточный фенотип между нормальными и полностью округлившимися клетками, следовательно, является результатом неэффективной транслокации v-Src в соответствующие места действия на периферии клетки. Особая роль PI3K в направлении на периферию v-Src, по-видимому, заключается в поддержании интегральности actin stress-fibre, хотя это не исключает возможности того, что PI3K вносит свой вклад иным способом. В противоположность PI3K, heat-shock protein (HSP)-90, молекулярный хаперон, который связывается с v-Src во время его биогенеза, ассоциирует как с targeting так и non-targeting v-Src мутантами. Исследования с помощью ts LA29 v-Src не установили, что FAK играет ключевую роль в механизме периферического таргетинга v-Src's, однако недаво было показно, что мутация с избыточной функцией v-Src SH3 домена стабилизирует комплекс Src и FAK и его локализацию в ассоциированных с интегрином invadopodia.

Следует иметь ввиду, что существенная пропорция экзогенно экспрессируемого c-Src дикого типа концентрируется вокруг ядра в фибробластах, ко-локализуясь с микротрубочками и с маркерами эндосом и с trans-Golgi network. Более того, постоянно активный c-Src направляется в фокальные адгезии на периферии клетки с помощью механизма, который нуждается только в N-терминальной половине молекулы, которая содержит SH2 и SH3 домены. В дополнение, укороченный Src fusion protein (amino acids 1–251), в котором киназный домен замещен на green fluorescent protein (Src251–GFP), обнаруживает постоянное периферическое местонахождения, хотя это все еще зависимт от активности малой GTPase RhoA. Это указывает на то, что комбинированное действие SH2 и SH3 доменов в Src и актиновые stress fibres позволяют Src251–GFP перемещаться от околоядерной области к фокальным адгезиям. Кроме того, усатановлено, что оказавшись на периферии клетки Src направляется к специфическим сайтам адгезии с помощью индивидуальных членов семейства Rho. Это, в свою очередь, зависит от эффектов этих GTPases на моделирование цитосакелета: RhoA направляет Src к фокальным адгезиям, Rac1 направляет к фокальным комплексам вдоль LAMELLIPODIA, а Cdc42 направлет его к фокальным комплексам вдоль FILOPODIA.

Итак, оба v-Src и c-Src направляются к клеточным адгезиям из зависимого от микротрубочек околоядерного положения. Для транзита обоих требуется функция домена SH3 — в общем-то мдулированного с помощью SH2 домена — помимо актиновых филамент, которые пееспекают поперек нижнюю часть клетки. Однако, прямое связывание, и, следовательно, роль, p85 и PI3K в направлении c-Src не обнаружена, хотя c-Src, как известно, асоциирует с PI3K посредством вируса полиомы, кодируемого middle-T антигена. Учитывая ассоциацию v-Src и c-Src с PI3K — по крайней мере, при некоторых условиях — и вовлечение VPS34 дрожжевого гомолога p110 каталитической субъединицы PI3K млекопитающих в везикулярный транспорт, м. предположить, что vesicle-зависимый компонент м. участовать в процессе доставки в места адгезии. Известно, что c-Src ко-локализуется с эндосомными маркерами (которые указывают на появление мембранного транспорта) в околоядерной области. Однако, если имеется vesicle-зависимый компонент направления на периферию v-Src или c-Src, то не совсем ясно, как это скоординировано с регуляцией необходимых цитоскелетных событий. Показано, что c-Src ассоциирует с GAP (GTPase-activating protein), специфичным для Arf GTPases, которая хорошо известна своим конролем мембранного транспорта. Более того, Src SH3-связывающая ArfGAP, ASAP1, индуцирует также ремоделирование цитосклета в клетках.

Focal adhesions as intracellular signalling sites

Установлена роль фокальных адгезий (focal adhesions) как мест накопления сигнальных белков, таких как SFKs (Src, Fyn и Yes), их эффекторной киназы FAK и p85 регуляторной субъединицы PI3K. Связываение лигандов внеклеточного матрикса с их интегриновыми рецепторами необходимо для доставки на периферию v-Src, т.к. v-Src остаются в нижней части клеток, когда клетки распластаны на матриксе, который не использует интегрины для прикрепления. Это неожиданно, т.к. часто v-Src функционирует, как полагают, независимо от нормальных средовых сигналов. Это указывает на то, что индуцированная интегринами передача внутриклеточных сигналов необходима не только для сборки структур фокальных адгезий, но и для включения сигнальных молекул, таких как сама v-Src.

Новые фокальные адгезии, которые стимулируются активацией ts v-Src содержат также некоторые extracellular-signal regulated kinase (ERK)/mitogen-activated protein kinase (MAPK). Фосфорилирование myosin light chain kinase, которая зависит от пути ERK/MAPK и усиливает активность миозина, необходимо для направления ERK/MAPK к фокальным адгезиям. Потребность в активности миозина согласуется с необходимостью контрактильных актиновых филамент для направления ERK/MAPK к периферии клетки. В клетках рака толстой кишки активность ERK/MAPK индуцирует образование коротких контрактильных актиновых структур на периферии клетки, которые необходимы для полного развития интегрин-зависимых адгезий. Мультидоменовый адапторный белок фокальных адгезий paxillin идентифицирован в качестве субстрата для пути ERK/MAPK после активации v-Src (Online Figure) и ERK/MAPK непосредственно фосфорилируют paxillin in vitro и в клетках thymoma в ответ на воздействие PHORBOL ESTERS (который активирует ERK/MAPK). Реципрокные влияния ERK/MAPK и paxillin на локализацию и/или активность др. др. еще неясны. Взаимоотношения между цитоплазматической ERK/MAPK, которая рекрутируется в фокальные адгезии, и ERK/MAPK, которая транслоцируется в ядро после активации, также не известны, хотя направление в ядро ERK/MAPK связано с реорганизацией актина, который появляется ниже интегриновых скоплений (engagement). Итак, хотя фокальные адгезии и обеспечивают физическую связь между внеклеточным матриксом и клеточным актиновым цитосклетеом, они кроме того действуют как клеточные опоры, предоставляющие кров для сигнальных белков, таких как ERK/MAPK и PI3K, хотя их ассоциации м.б. лишь временными.

v-Src activity at peripheral adhesions

Быстрым следствием активации v-Src является замещение фокальных адгезий малыми богатыми актином структурами, известными как podosomes. Это аналоги динамических сайтов прикрепления матрикса, обнаруженных в аклетках клона моноцитов, таких как др. др. MACROPHAGES и OSTEOCLASTS. Хотя они также являются организованными структурами, которые содержат белки, сходные с теми, что обнаружены в фокальных адгезиях, их архитектура другая. В частности, podosomes не содержат прикрепленных к ним актиновых стрессовых волокон, но м. формировать временные прикрепления к матриксу, необходимые при быстром перемещени клеток и для инвазивности трансформированных клеток. Так, когда v-Src-трансформированные 3Y1 фибробласты крыс помещены на фибронектин, то они они обнаруживают деградацию матрикса под подосомами, благодаря присутствию METALLOPROTEINASES в этих местах.

Одним из важных субстратов для v-Src является cortactin, белок, связывающий в пучки F-актины, который локализуется в podosomes и lamellipodia. Установлено, что cortactin ассоциирует с и активирует Arp2/3, белковый комплекс, который необходим для nucleate образования сети актиновых филамент. Это взаимодействие происходит благодаря N-терминальной кислой области cortactin, к функционирует аналогично со сходной областью семейства Wiskott Aldrich Syndrome protein (WASP). Сortactin стабилизирует сборку актиновых филамент, индуцированную Arp2/3 на периферии клетки и м., следовательно, участовать в формировании подосом. Помимо cortactin, v-Src субстрат p110AFAP (actin-filament-associated protein) и N-WASP (neuronal WASP) также накапливаются в v-Src-индуцированных подосомах, а ингибирующий мутант N-WASP ингибирует формирование подосом и деградацию матрикса, индуцируемую v-Src. Следовательно, регуляторы актина выполняют критическую функцию в обеспечении сборки динамически регулируемых подосом, которая индуцируется v-Src, и это обусловливает миграторный и инвазивный фенотип.

Будучи локализованными в периферических сайтах, каталитические активности v-Src ведукт к разрушению адгезий и разборке ассоциированных с ними актиновых кабелей (Рис.1). По аналогии, каталитическая активность v-Src м.б.также ответственна за смену динамически регулируемых подосом на периферии трансформированных клеток, однако это не подтверждено экспериментально. Напротив, если белок v-Src лишен каталитической активности(Lys-to-Arg мутация в акивном сайте; Box 1), то он транслоцируется в предсуществующие фокальные адгезии, где он стабилизирует актиновые кабели и увеличивает фокальные адгезии в результате нарушения в них обмена (Рис.2). Редукция обмена фокальных адгезий нарушает миграцию клеток, тогда как клетки с малыми адгезиями оказываются более подвижными. Накапливаютс доказательтва того, что эндогенные SFKs играют важную роль в миграции клеток, т.к. интегрин-зависимая миграция клеток нарушена у эмбрионов мыши, лишенных c-Src, Fyn и Yes. Кроме того, потеря c-Src обусловливает усиление связи между интегринами — продемонстрировано для vitronectin рецепторов — и силой сгенерированным цитоскелетом, это указывает на то, что нормальная роль c-Src ослаблять или разрушать такие связи. Клетки, в которых отсутствует FAK также обнаруживают увеличенные фокальные адгезии и нарушенную миграцию,это указывает на критическую роль связанных активностей Src и FAK в индукции смены адгезий или их ремоделировании, что облегчает движение клеток. С этим согласуется то, что экспрессия kinase-deficient Src251–GFP fusion белка супрессирует ремоделирование адгезий, которая превращает RhoA-зависимые фокальные адгезии в малые фокальные комплексы вдоль Rac1-индуцированных lamellipodia ли Cdc42-индуцированных filopodia. Соответственно, клетки, в которых Src251–GFP занимает перифереические сайты адгезии, обнаруживают нарушение поляризации в направлении миграторных стимулов и снижение подвижности, что сопровождается снижением FAK фосфорилирования.

Bnfr, v-Src рекрутируется в периферические сайты активности зависимым от актиновых филамент способом и затем исползуется для разрушения актиновых филамент в результате ее несдерживаемой киназной активности. Кроме того, Src SH2 и SH3 домены важны для сбоки адгезивного комплекса, тогда как каталитическая активность v-Src на периферии клетки м. индуцировать разрушение и смену адгезий. Предполагается, что Src белок участвует в контроле не только сборки периферических адгезий и ассоциированных актиновых структур — посредством SH2 и SH3 доменов — но также и в разборке этих структур — посредством обычно высоко регулируемой киназной активности. В результате чрезвычайно тонкого контроля динамики актина и адгезий обеспечивается регулируемая подвижность клеток. Недавно установлен др. механизм, с помощью которого v-Src влияет на адгезию клеток. Специфически, R-Ras является мишенью для v-Src-индуцированного фосфорилирования в Tyr66, что супресирует интегриновую активность. Это м. вносить вклад в снижение адгезии в Src-трансформированных клетках и, в свою очередь, в инвазию опухолевых клеток.

Рассматрим два эффекторных пути ниже активности v-Src, p190 RhoGAP и FAK–calpain, которые м. участвовать в этих эффектах.

Disruption of actin stress fibres: p190 RhoGAP

Имеются доказательства того, что p190 RhoGAP играет важную оль. p190 RhoGAP является p120 RasGAP-ассоциированным белком, который фосфорилирован по тирозину в v-Src-трансформированных клетках, и имеет GAP домен на своем С-конце, который специфичен для Rho белков — особенно RhoA. Микроинъекции изолированного GAP домена в клетки блокирует RhoA-обусловленное образование stress-fibre, это указывает на то, что RhoGAP м противодействоывать функции RhoA in vivo. Кроме того, когда SH2 и SH3 домены p120 RasGAP экспрессируются. то они связываются постоянно с p190 RhoGAP и разрушают актиновые стрессовые волокна, это указывает на то, что p120 RasGAP–p190 комплекс негативно модулирует актиновый цитосклет. Активация ts v-Src индуцирует связывание фосфорилированного по тирозину p190 RhoGAP с p120 RasGAP и стимуляцию p120-RasGAP-ассоциированной RhoGAP активности. Эти события необходимы для каталитической активности v-Src и связаны с разрушением стрессовых волокон во время трансформации. В активированной форме RhoA, VRhoA, которая нечувствительна к активности RhoGAP, супрессирует v-Src-индуцированную потерю стрессовых волокон и трансформацию, это показывает, что v-Src м. противодействовать функции RhoA, чтобы индуцировать разрушение актина и эта p190 RhoGAP является прекрасным кандидатом на роль супрессирующей активности RhoA.

Т.к. антогонизм RhoA, по-видимому, ключевое событие в v-Src-индуцированной трансформации клеток, то c-Src также должен регулировать p190 RhoGAP и если это так, то каковы биологические последствия? Установлено, что хотя продолжительное ангажировние интегринов активирует RhoA, но оно, по-видимому, происходит как результат c-Src-зависимой фосфорилияции тирозина p190 RhoGAP. Это было предположено для локальных контрактильных сил в местах скоплений интегринов, которые облегчают выпячивание ведущего края мигрирующих клеток. В соответствии с этим, интегрином-индуцированное ингибирование RhoA с помощью p190 RhoGAP облегчает распластывание и миграцию за счет регуляции выпячивания и полярности мембраны. Было также предположено, что p190 RhoGAP является предпочтительным субстратом для c-Src во время EGF рецептором (EGFR)-опосредованного EPITHELIAL–MESENCHYMAL TRANSITION. Избыточная экспрессия c-Src в 10T1/2 фибробластах усиливает фосфорилирование основного тирозина p190 RhoGA и это обеспечивает биологически важные изменения цитоскелета эпителиальных клеток. p190 RhoGAP , как полагают, является важным Src субстратом в нервной системе, p190 RhoGAP индуцирует Src-зависимый адгезивный сигнал, который важен для нейрогенеза. Итак, p190 RhoGAP является критическим медиатором c-Src- и v-Src-индуцируемой модуляции клеточной функции RhoA и актинового цитоскелета. Показано, что v-Src индуцирует нарушения цитосклетеа за счет противодействующей способности RhoA поддерживать контрактильные пучки актиновых стрессовых волокон, это согласуется с тем, что v-Src индуцирует изменения актина, которые обусловлены скорее разборкой микрофиламент, чем деполимеризацией актина. Однако, взаимоотношения между Src и p190 RhoGAP сложные и некоторые аспекты функции Src м. негативно регулировать p190 RhoGAP у Drosophila melanogaster нейральную пластичность.

Focal adhesion turnover: FAK and calpain

Установлено, что FAK м.б. нижестоящей мишенью активности Src, которая разрушает фокальные адгезии. Согласуется с этим и киназная активность ts v-Src, индуцирующая фосфорилирование FAK в специфических осттатках тирозина, диссоциацию FAK–v-Src комплекса, протеолиз FAK и нарушения или обмен фокальных адгезий, которые ассоциируют с трансформацией и подвижностью. Однако, ts v-Src-индуцированная деградация и потеря FAK из строго трансформированных первичных клеток представляет собой крайний фенотип, который связан с потерей способности клеток прикрепляться. v-Src-индуцированный FAK протеолиз м.б. все еще важным в усилении обмена во время регуляции динамической адгезии и подосом в стабильно трансформированных клетках, однако при этих условиях скорость FAK протеолиза м.б. сбалансирована с помощью компенсаторного увеличения скорости синтеза FAK. Тем не менее, крайнее разрушение фокальных адгезий, индуцированное сильно трансформированными ts v-Src в первичных эмбриональных фибробластах (Рис. 1), не позволяют изучать механизм разборки адгезий и указывает тем самым на calpain-зависимое протеолитическое расщепление FAK в этом процессе.

Calpains высоко законсервированное семейство внутриклеточных нелизосомных кальций-зависимых цистеин протеаз. Имеется две повсеместно распространенные изоформы — μ-calpain (calpain 1) и m-calpain (calpain 2) — некоторые тканеспецифичные изоформы и малая в 28-kDa регуляторная субъединица (calpain 4)(Box 2). In vivoактивность calpain тонко регулируется его высоко специфичным эндогенным ингибитором, calpastatin. Роль активности calpain в подвижности клеток выявлена в исследованиях с использованием ингибиторов calpain, которые супрессируют миграцию клеток по фибронектину. В частности, ингибирование calpain вызывает нарушение ретракции задней части клетки, увеличение длины хвоста подтягиваемого края — что отражает супрессию де-адгезии и уменьшение подвижноси клетки. Итак, это связывает calpain с процессом отсоединения клетки. Более того, колокализация calpain 2 со структурами локальных адгезий и идентификация некоторых предположительно calpain субстратов — включая Src, paxillin, talin и α-actinin — которые располагаются в клеточных адгезиях, все это говорит о ом, что calpain функционально активен в фокальных адгезиях и м способствовать их разборке, что ведет к уменьшению силы интегрин-обусловленных адгезий между клетками и матриксом и к усилению клеточной миграции (Рис. 3).

Если активирован ts v-Src, то calpain способствует протеолитическому расщеплению FAK, еоторое происходит прежде, чем произойдет потеря фокальных адгезий и трансформация клетки. Ингибирование calpain, избыточная экспрессия calpastatin, или генетический нокаут регуляторной субъединицы calpain 4 супрессируют индуцированное v-Src разрушение фокальных адгезий, потерю субстрата адгезии и миграцию трансформированных клеток, это указывает на то, что calpain-зависимый протеолиз причинно связан с трансформацией и подвижностью клеток. Calpain-зависимый протеолиз, который индуцируется после активации v-Src, по-видимому, каким-то образом избирателен для FAK. Показано, что FAK первоначально расщепляется с помощью калпаина на Т-терминальный фрагмент в 95-kDa и С-терминальный фрагмент в 30-kDa. Первый высвобождается из цитоскелетной фракции в цитоплазму, где он в дальнейшем расщепляется на фрагменты в 40–50 kDa (Рис. 4). Итак, вызываемое калпаином расщепление FAK вызывает диссоциацию focal-adhesion-targeting (FAT) последовательностей от N-терминальных киназных доменов и потерю каталитической активности FAK в фокальных адгезиях. Это указывает на то, что протеолитическое расщепление м. представлять собой важный механизм супрессии адапторной и каталитической функций FAK в фокальных адгезиях и тем самым негативно регулировать как интегральнойсть фокальных адгезий, так и клеточные реакции, вызываемые FAK (Рис. 4). Это подтверждает предположение, что разрушение transmembrane–cytoskeletal связей, которое индуцируется v-Src м. "возникать в результате отсутствия одного из компонентов, из-за расщепления с помощью литических энзимов, таких как протеаза".

Calpain as a general regulator of cell de-adhesion.

EGF-индуциованная клеточная подвижность опосредуется, частично, через уменьшение клеточной адгезии с субстратом внеклеточного матрикса.Показано, что обработка EGF линии клеток фибробластов вызывает быструю стимуляцию активности calpain 2, тогда как ингибирование calpain предупреждает EGF-индуцируемую клеточную де-адгезию и миграцию. Нарушение ERK/MAPK сигнального пути ингибированием MAPK/ERK kinase (MEK) предупреждает активацию калпаина в ответ на EGF, тогда как экспрессия постоянно активной MEK активирует calpain в отсутствие EGF. Все это говорит о том, что ERK/MAPK путь связывает передачу сигналов EGFR с активацией калпаина и клеточной де-адгезией, необходимыми для подвижности (Рис. 5).

Главные calpain субстраты, которые запускают EGF-индуцируемую де-адгезию, не идентифицированы, но FAK участвует в интеграции EGFR- и integrin-зависимых сигналов, которые способствуют миграции клеток. Мледовательно, активность c-Src необходима как для MITOGENIC так и мотогенных эффектов EGF в разных типах клеток, это позволяет предполагать, что одна из ролей c-Src, стоящего ниже EGFR, - это индукция калпаин-обусловленного протеолиза FAK, который стимулирует смену адгезий и клеточную миграцию. Возможно, что и v-Src и EGFR стимулируют передачу сигналов ERK/MAPK, а последние необходимы для EGF-индуцируемой активации калпаина, активность ERK/MAPK необходима также для активации калпаина в ответ на v-Src. Известно, что некоторые ERK/MAPK локализуютс в фокальных адгезиях после активации ts v-Src. Вообще adhesion-associated ERK/MAPK необходимы для полной активации калпаина, который, в свою очередь, расщепляет FAK и запускает разборку фокальных адгезий.

Calpain protease and cell-cycle regulation.

Идентифицирована позитивная петля обратной связи, с помощью которой активация v-Src вызывает увеличение трансляции calpain 2, который, в свою очередь, ведет к деградации его физиологического ингибитора, calpastatin. Восстановление уровня calpastatin супрессирует протеолиз FAK и морфологическую трансформацию, это указывает на то, что v-Src-индуцированная стимуляция активности калпаина необходима для трансформации. Избыточная экспрессия calpastatin также ингибирует прохождение v-Src-трансформированных клеток через G1 фазу клеточного цикла (Box 3). Aктивация v-Src обычно способствует повышенной экспрессии cyclin A, cyclin D и CYCLIN-DEPENDENT KINASE 2 (Cdk2) и гиперфосфорилированию retinoblastoma protein (Rb), который стимулирует прохождение через G1 и усиливает пролиферацию v-Src-трансформированных клеток. Однако, избыточная экспрессия calpastatin ингибирует эти эффекты (Рис. 6). Это указывает на роль активности калпаина в обеспечении, по крайней мере, некоторых эффектов v-Src на ход клеточного цикла. Точный механизм, с помощью которого обеспечивается фосфорилирование Rb и уровни cyclin A, cyclin D и Cdk2 во время Src-индуцированной трансформации, остается неизвестным. Однако, показано, что калпаин расщепляет p27^Kip1, указывая тем самым, что калпаином обусловленный обмен cyclin-dependent-kinase inhibitors (CKIs) м. способствовать течению клеточного цикла. Напротив, транслокация calpastatin в клеточное ядро во время Src трансформации м. ингибировать обмен ядерного субстрата калпаина, такого как cyclin D, который затем влияет на фосфорилирование Rb. Calpain расщепляет многочисленные факторы транскрипции. Итак, calpain м. косвенно влиять на течение клеточного цикла путем регуляции обмена транскрипционных факторов, которые активируют экспрессию генов, контролирующих клеточный цикл.

Кроме того, ингибиторы калпаина, избыточная экспрессия calpastatin или нокаут calpain 4 обусловливают супрессию v-Src-индуцированного якорь (anchorage)-независимого роста — классического признака онкогенной трансформации.Это указывает на то, что регуляция активности калпаина после активации ts v-Src обладает многочисленными эффектами: облегчает оборот фокальных адгезий и влияет на кухню (machinery) клеточного цикла, которая осуществляет прохождение через G1. Итак, протеолитическая активность калпаина м. служить как общая связка между динамической регуляцией адгезии и пролифераци клеток. В контексте ts v-Src-трансформированных клеток, способность калпаина влиять на некоторые реакции, которые инициируют клеточные адгезии, вносит свой вклад в anchorage-независимый рост.

Механизмы, с помощью которых калпаин дерегулирует v-Src-индуцированную экспрессию циклинов, активность CDK и фосфорилирование Rb, неизвестны. Не известно и то, калпаин или другие протеазы вызывают c-Src-зависимые эффекты на передачу митогенных сигналов, которые индуцируются с помощью рецепторов ростовых факторов, таких как platelet-derived growth factor receptor (PDGFR).

Src activity at cadherin-dependent adhesions

v-Src aи эндогенный SFKs присутствуют в ADHERENS JUNCTIONS между эпителиоидными клетками почек крыс, а также в фокальных адгезиях. Имеются доказательства, что фосфорилирование тирозинов, обеспечиваемое SFKs играет роль в разрушении адгезий между эпителиальными клетками.Напр., экспрессия v-Src в клетках крыс и кур нарушает кадхерин зависимые межклеточные адгезии. Кроме того, Madin–Darby canine kidney (MDCK) эпителиальные клетки, которые трансформированы с помощью ts v-Src имеют эпителиальный фенотип при непермиссивной температуре, но быстро теряют межклеточные контакты и приобретают фибробласт подобную морфологию при пермиссивной температуре. В этих клетках активность v-Src, ассоциированая с повышенной фосфориляцией тирозина E-cadherin, β-catenin и др. белков слипчивых соединений, пробуждает кадхерин-зависимые межклеточные адгезии и вызывает дедифференцировку и инвазивность. Идентифицирован медиатор v-Src-индуцируемых нарушений межклеточных адгезий, который функционирует, регуллируя эндоцитоз E-cadherin. Идентифицирована новая E3 UBIQUITIN PROTEIN LIGASE,названная Hakai, которая ассоциирует с E-cadherin зависимым от фосфорилирования тирозина способом и контролирует ubiquitylation и эндоцитоз E-cadherin–β-catenin комплекса. Hakai м. функционировать как посттрансляционный регулятор стабильности E-cadherin, которая чувствительна к активности v-Src. Более того, Ras-трансформированные эпителиальные клетки груди также плохо формируют межклеточные соединения и ассоцированное увеличение фосфорилирования тирозинов белков слипчивых соединений. Все это указывает на то, что фосфорилирование тирозинов обычно ассциирует с разрушением адгезий между эпителиальными клетками.

Имеются доказательства, что фосфорилирование тирозинов, обеспечиваемое эндогенными SFKs, вносит вклад в дестабилизацию эпителиальных адгезий. Напр., факторы миграторного роста, такие как hepatocyte growth factor (известный также как scatter factor) или EGF, индуцируют дисперсию нормальных и злокачественных эпителиальных клеток, возможно, индуцируя фосфорилирование тирозинов адгезивных белков. Кроме того, EGF-индуцированная дисперсия клеток карциномы мочевого пузыря крыс нуждается в активности c-Src. В одном исследовании KERATINOCYTES Fyn-дефицитных мышей выявлены пониженные уровни tyrosine-phosphorylated β- и γ-catenin белков, что сопровождается структурными и функциональными аномалиями клеточной адгезии. В том же исследовании кожи мышей с нарушением как Fyn так и c-Src генов выявлено снижение фосфорилирования тирозинов β-catenin и структурные изменения, которые связаны с нарушениями межклеточной адгезии кератиноцитов. Следовательно, фосфорилирование тирозинов м. играть и позитивную роль в сборке межклеточных адгезий между нормальными кератиноцитами. Однако, в др. исследовании, все три SFKs ко-рекрутировались вместе с E-cadherin в кальцием индуцированные межклеточные адгезии кератиноцитов. Фармакологическое и молекулярное ингибирование активности Src-tyrosine-kinase в первичных кератиноцитах человека способствует стабилизации межклеточных контактов и поставке E-cadherin в области контактов, даже при относительно низких концентрациях кальция, которые обычно не поддерживают сильную кадхерином-обеспечиваемую адгезию. Подтверждено, что ингибирование каталитической активности эндогенных SFKs усиливает кадхерином обеспечиваемые межклеточные контакты, которые указывают на то, что SFK-зависимое фосфорилирование обычно необходимо для ослабления или разрушения этих структур. Кажущиеся противоречивыми заключения м.б. примерены мультидоменовой природой Src киназ и различиями в экспериментальных подходах. Показано, что белковые продукты c-Src и Fyn генов необходимы для собственно сборки контактов между кератиноцитами in vitro и in vivo. Напротив, киназная активность необходима для разборки кадхерин-зависимых межклеточных адгезий. По-видимому, Src SH2 и SH3 домены необходимы для сборки межклеточных адгезий, тогда как каталитическая активность в сайтах адгезии запускает их последующую разборку. Это похоже на потребность в функции v-Src SH3-домена во время сборки фокальных адгезий, которые содержат онкобелок, и на роль ее киназной активности в последующем обороте фокальных адгезий во время трансформации и миграции клеток.

Предполагается, что калпаин регулирует оборот кадхерин-катениновых комплексов. Src-индуцированная регуляция калпаина м. влиять на интегральность кадхерином обеспечиваемых межклеточных адгезий и передачу внутриклеточных сигналов, исходящих из этих мест.

Future directions

Остаются нерешенными вопросы о природе SH3 связываемых партнерах и последовательности событий, ведущих к v-Src переключению между микротрубочковыми и актиновыми сетями и к изменению положения из околоядерной области (вообще из эндосом в области Гольджи) через нижнюю часть клетки к адгезивным комплексам плазматических мембран. Хотя SH3-доменом обеспечиваемое связывание PI3K необходимо, оно не единственное. Существует последовательное связывание нескольких Src SH3-взаимодействующих белков, которые обеспечивают перенос между субклеточными компартментами, а порядок связывания предопределяется и доступностью (близостью к Src) и относительным сродством связывания партнеров. Известтно несколько потенциальных SH3-домен-связывающих партнеров. Напр., Src SH3 domain-binding Arf-GTPase-activating protein (ASAP1, известный также как centaurin β4) v/ осуществлять связь между направлением Src и скоординированной регуляцией мембранного транспорта и моделирование цитоскелета. А Src SH3 domain-binding mDia белки (гомологи у млекопитающих Diaphanous-related formin белков, которые связывают RhoA со сборкой актиновых филамент), м. обеспечивать связь между актин-зависимым транзиом Src через нижнюю часть клетки и сборкой актиновых филамент.

Возникает также вопрос, может ли активность ERK/MAPK вносить вклад в цикл сборки-разборки или она выполняет чисто сигнальные функции. Неясно значение MEK-зависимого фосфорилирования paxillin.

Не выяснена связь между Src-зависимой фосфориляцией тирозина в FAK и стабильностью FAK белка. Получены предварительные данные, что фосфорилирование регулирует способность FAK действовать в качестве субстрата для calpain. Кроме того, т.к. FAK не является единственной мишенью для calpain в местах адгезии, необходимо идентифицировать и др. v-Src-индуцируемые протеолитические мишени и установить порядок событий расщеплния.

Интересно установить, вносит ли вклад Src-индуцируемая модуляция calpain–calpastatin системы или индуцируемый протеолиз в межклеточных адгезияхв фенотип эпителиальных опухолевых клеток с повышенной активностью Src.

Чтобы понять онкогенные эффекты надо знать молекулярные механизмы, контролирующие внутриклеточные перемещения v-Src и c-Src в интегриновые адгезии, контролирующие сборку интегрин-связанных мультипротеиновых комплексов после того как клетка прикрепляется к внеклеточному матриксу.

V-SRC'S HOLD OVER ACTIN AND CELL ADHESIONSMargaret C. Frame, Valerie J. Fincham, Neil O. Carragher, John A. Wyke Nature Reviews Molecular Cell Biology 3, 233-245 (2002)

Boxes

Links