AP | DV | foo | NC | pp |

Развитие уха у рыбок данио начинается в виде утолщения эпидермального слоя в плакоду толщиной в два клеточных диаметра на ст. 9 сомитов (Kimmel et al., 1995). Происходит кавитация плакоды, чтобы сформировать просвет и волосковые клетки начинают дифференцироваться, проецируя ворсинки (bristles) в жидкость, наполняющую внутренность плакоды (Haddon and Lewis, 1996). В течение последующих нескольких дней, колонки (columns) ткани выростают из стенки отического пузырька, сливаются в центре пространства, чтобы сформировать полукружные каналы. Множественные гены экспрессируются в развивающемся ухе или участвуют собственно в формировании органа (Whitfield et al., 2002). Гены pax2a и dlx3b экспрессируются в развивающихся плакодах (Krauss et al., 1991; Lun and Brand, 1998; Solomon and Fritz, 2002). Гены Fgf3 и Fgf8 непосредственно участвуют в индукции отических плакод (Leger and Brand, 2002; Maroon et al.,2002; Phillips et al., 2001). Ингибирование любой из этих сигнальных молекул вызывает заметное снижение размеров плакоды, тогда как ингибрование обоих вызывает элиминацию примордия уха. Ген pax8 является самым ранним из известных молекулярных маркеров для клеток, которые станут отической плакодой, но его действительная роль в индукции неизвестна (Pfeffer et al., 1998).

Как и у всех позвоночных ухо рыбок данио выполняет двойную функцию определение линейного ускорения и слух (Bever and Fekete, 2002). Хотя функции сходны с таковыми у человека, но многие структуры отсутствуют, включая улитку и среднее ухо. Структуры среднего уха впервые возникают во время перхода из воды на сушу и оно возникает, как полагают, из жабр (spiracular pouch) и челюсти (hyomandibular кости) рыб (Webster et al., 1992).

Глоточные хрящи происходят из трех потоков вентролатерально мигрирующих клеток краниального neural crest (NC). Глоточный скелет обнаруживает как anterior-to-posterior (AP) сегментную полярность, каждый сегмент происходит из эмбриональной глоточной дуги, так и dorsal-to-ventral (DV) полярность внутри каждого AP сегмента (Trainor and Krumlauf, 2001). Первая мандибулярная дуга дает вентральную часть Meckel’s хряща, который сочленяется с дорсальной palatoquadrate. Вторая гиоидная (hyoid) дуга серийно гомологична первой дуге дает вентральную ceratohyal, которая сочленяется посредством interhyal с hyosymplectic. Нyosymplectic состоит из ветральной symplectic палочковидной области и дорсальной пластинко-подобной hyomandibular области. Дуги и карманы формируются динамически с эктодермой, формирующей AP серию билатеральных поверхностных вдавлений (‘in-pockets’), комплементарных билатеральным энтодермальным out-pockets, которые вместе образуют глоточные карманы, разделеяющие соседние дуги вдоль AP оси. Миграторные NC клетки заполняют пространства между образующимися карманами, принимая цилиндрическую морфологию, характерную для центральной сердцевины параксиальной мезодермы (Kimmel et al., 2001). Глоточные карманы. по-видимому, передают сигналы соседним NC клеткам (Le Douarin and Ziller, 1993; Veitch et al., 1999) и существенны для выполнения роли endothelin1 (edn1) в формировании вентральных хрящей у рыбок данио и мышей (Clouthier et al., 1998; Kurihara et al., 1994; Miller et al., 2000). Доказательсва в пользу сигналов формирующих паттерн дорсальных хрящей fgf8 рыбок данио получены у мутантов acerebellar (ace), у которых редуцирована hyomandibular область. Однако, ранние дефекты нервной трубки и отсутствие экспрессии ace в карманах делает инт ерпретацию затруднительной (Roehl and Nusslein-Volhard, 2001). Изучение мутантны рыбок casanova (cas) и нокдаун с помощью Fgf3 morpholino антисмысловых олигонуклеотидов указывает на то, что потеря экспрессии Fgf3 в карманах ведет к ранней апоптической элиминации задних NC клеток (Alexander et al., 1999; David et al., 2002). Как Fgf сигнал м. функционировать в формировании DV патерна внутри дуг все еще неясно.

Инсерционный мутагенез, jсуществленный с помощью MIT (Amsterdam et al., 1999; Golling et al., 2002) позволил выделить 4 инсерционных аллеля у рыбок данио ортологов forkhead транскрипионных факторов Foxi1 (FREAC6, FKHL10, HFH-3, Fkh10) (Avraham et al., 1995; Chen et al., 2002; Clevidence et al., 1993; Hulander et al., 1998; Larsson et al., 1995), которые обнаруживают специфически дефекты как в развитии уха, так и челюстей. Отические плакоды сильно уменьшены в размере, часто расщеплены на две маленькие плакоды и отсутствуют полукрыжные каналы часто давая в результате одиночную большую послость вместо обычных трех отдельных камер. Производные дорсальной части первой дуги palatoquadrate, несколько редуцированы у мутантов, тогда как вентральный Meckel’s хрящ неотличим от дикого типа. Дорсальные производные второй дуги, hyomandibular область, сильно редуцирована у мутантовin, тогда как вентральная symplectic rod область и ceratohyal выглядят лишь слегка поврежденными. Из задних дуг, третья и четвертая, обнаруживают существенные варьирующие редукции, тогда как хрящи 5-7 дуг выглядят практически неизменеными. Интересно, что целенаправленные мутации Foxi1 у мышей дают дефекты в развивающемся ухе, а гомозиготные мутантные мыши рождаются с дефектами слуха и вестибулярного аппарата и обнаруживают низкую выживаемось после рождения (Hulander et al., 1998), это указывает на некоторрую консервацию онтогенетических путей в ушах у рыб и мышей.

Полностью оригинал статьи в формате *.pdf находится ЗДЕСЬ

DISCUSSION

Role of foxi one in otic placode induction and organization

Эксперссия гена foo начинается рано с обнаружением мРНК на ст. сферы (sphere) в ограниченной вентральной области вблизи анимального полюса. Эта область соответствует презумптивной плакодной ткани (Kozlowski et al., 1997; Woo et al., 1995). На ст. хвостовой почки экспрессия foo обнаруживатся в двух отдельных билатеральных областях, которые маркируют будущие плакоды. Экспрессия foo в презумптивной плаконой ткани не только предшествует экспрессии pax8, но и эмбрионы foo/foo обнаруживают также полную потерю экспрессии pax8 в отической плакоде, а также редукцию и дизорганизацию поздних маркеров отической плакоды. Это ставит pax8 ниже foo, который оказывается самым ранним из известных маркеров отической плакоды.

На ст. хвостовой почки, dlx3b обычно экспрессируется во всех плакодных тканях, формируя дискретный латеральный диск экспрессии, который окружает переднюю часть нейральной пластинки с наивысшим уровнем экспрессии над будущей отической плакодой (Akimenko et al., 1994). На ст. 10-сомитов dlx3b обычно строго экспрессируется в отической плакоде, хотя его экспрессия не определяется больше латеральнее между отическими плакодами и самым переденим доменом. Хотя на ст. 10 сомитов эмбрионы foo/foo обнаруживают редуцированную экспрессию dlx3b отическими плакодами, мутантные эмбрионы, по-видимому, сохраняют также со стадии хвостовой почки некоторый латеральный диск экспрессии dlx3b, окружающий переднюю часть нейральной пластинки (см. Рис. 3), указывая тем самым, что foo м. участовать в ограничении или поддержании когеренции (coherence) доменов экспрессии плакодных маркеров. Эта неспособность точно ограничивать доменов экспрессии маркеров отических плакод, таких как dlx3b и pax2a, м. объяснить почему эмбрионы foo/foo часто обнаруживают расщепление и/или удвоение отических пузырьков на pharyngula и более поздних стадиях. Т.о., этот Foxi1-зависимый путь выполняет важную функцию в развитии отических плакод, но не играет существенной роли в инициальной индукции.

Известно, что индукция отических плакод нуждается в fgf3 и fgf8 (Leger and Brand, 2002; Maroon et al., 2002; Phillips et al., 2001). Предполагается, что экспрессия pax8 индуцируется с помощью fgf3 сигналов, но величина сигнала, необходимого для индукции pax8 значительно ниже, чем для др. маркеров отических плакод.

Удаление fgf3/8 сигналов полностью элеимнирует отическую индукцию, но эмбрионы foo/foo все еще обнаруживают индукцию некоторых маркеров. Хотя возможны и др. модели, простейшая модель помещает активность foo между fgf3/8 и pax8 в процессе индукции. Предполагается, что передача сигналов fgf3/8 в отические плакоды индуцирует параллельные пути. Foxi1-независимый путь начинается очень рано и д.б. ответственен за инициальную индукцию и экспансию отических плакод. Т.к. эмбрионы foo/foo полностью лишены экспрессии pax8 в отических плакодах, но все еще способны индуцировать плакодные структуры, которые обязательно формируют ухо, то полученные данные указывают на то, что у рыбок данио pax8 и foo не нужны для индукции отических плакод. Имеется ранняя экспрессия pax8 в отических плакодах мышей (Pfeffer et al., 1998), линия мышей с целенаправленной делецией pax8 получена, но нет еще данных касательно дефектов ушей (Mansouri et al., 1998).

Второй, Foxi1-зависимый путь имеет, по крайней мере, один нижестоящий эффект: индукция экспрессии pax8. Исходя из данных, полученных при обработке эмбрионов ингибитора Fgf рецептора, SU5402 (Leger and Brand, 2002), инициация этой pax8 индукции происходит спустя некоторое время после 70% epiboly, т.к. SU5402, добавленный на 70% epiboly м. блокировать экспрессию pax8. Роль более раннего иницирующего Fgf сигнала д. обеспечивать активирующих сигнал для foo-экспрессирующих клеток. чтобы индуцировать pax8 и вообще др. неидентифицированные нижестоящие гены. Важно отметить, что экспрессия foo скорее всего не зависит от передачи сигналов fgf3/8 даже через pax8 экспрессию.

Fig. 10. A model that places foo in pathways for ear and jaw development. foo expression is independent of Fgf signaling, but it allows cells to respond to Fgf signaling with a specific genetic program, which includes the induction of pax8. Feedback mechanisms for the maintenance of Fgf expression are inferred from the data. Phenotypic effects observed in the embryos when foo function is eliminated are listed below.

Авт. полагают, что foo/foo мутантные эмбрионы демонстрируют отсутствие связи индукции плакод с их последующим морфогенезом (Fig. 10). Эта организационная или ‘integrity-maintenance’ активность д. сводить плакоду вместе из более мелких диссоцированных предшественников плакод. Т.к. области pax2a и dlx3b, по-видимому, несколько редуцированы, то м. предположить, что foo-экспрессирующие клетки генерируют позитивную обратную петлю для Fgf сигналов (Fig. 10).

Roles of fooin the developing jaw

Эмбрионы foo/foo обнаруживают тяжелые дефекты хрящей. Пролит свет на то, как активность foo м. дифференциально затрагивать форму дорсальных и вентральных хрящей, влияя на поддержание экспрессии fgf3. На ст. 10-сомитов эмбрионы foo/foo имеют дизорганизованный третий поток клеток NC, который проникает в область отических плакод. Т.к. отические плакоды, как полагают, служат в качестве ингибирующих сигналов наведения (Sechrist et al., 1993; Smith et al., 1997), то наблюдаемые дефекты миграции третьего потока в целом вторичны к ранее описанным дефектам отических плакод. Без поддержания интегральности тонких межклеточных взаимодействий отическая плакода не м.б. более способной к отклонять вентральное движение клеток третьего потока NC. Степень миграции при дефекте третьего потока, по-видимому, ограничена инвацией на территорию отической плакоды, т.к. не обнаруживается клеток третьего потока, экспрессирующих krox20, на постмигратороной территории второго потока (Fig. 4D, dorsal view, the area lateral to r2-r4). Значительная фракция клеток третьего потока NC не подвергается апоптозу, хотя и редуцируется, задние хрящи всегда обнаруживаются у foo/foo эмбрионов. Альтернативно эти дефекты миграции д.б. присущими клеткам NC, лишенным активности Foo.

Т.к. первый и второй потоки миграции клеток NC кажутся нормальными у эмбрионов foo/foo, то hyomandibular дефекты скорее всего возникают из-за дефектов на поздних стадиях развития челюстей. На ст. 15 сомитов экспрессия foo легко обнаруживется в энтодерме глоточных карманов. Примерно на ст. 20 сомитов эмбрионы foo/foo обнаруживают потерю экспрессии pax8 из карманов сразу после ст. 24 сомитов в результате преждевременной потери экспрессии fgf3. Комбинированное действие сильных Fgf сигналов и активности foo д. служить прообразом доменов экспрессии в карманах pax8, т.к. fgf3 экспрессируется только в задней половине кармана pp2 как и pax8. В согласии с этим наблюдением, экспрессия pax8 в отической плакоде строго зависит от передачи сигналов Fgf и активности foo. Т.о., и в ушах и челюстях экспрессия foo, по-видимому, ответственна за модификацию нижестоящих клеточных реакций на передачу сигналов Fgf, ведущих к индукции экспрессии pax8 .

Интересно, что потеря экспрессии pax8 у эмбрионов foo/foo предшествует потере fgf3, поддерживаемого в кармане pp2. Возможно, что и foo и pax8 функционируют. чтобы поддерживать в энтодерме карманов интегральность маркеров, таких как nkx2.3 по способу, аналогичному с интегральностью в отических плакодах (Fig. 10). fgf3 экспрессируется в глоточных карманах грубо в виде AP прогрессивной волны. Начиная со ст. 15 сомитов и до 34 hpf, экспрессия fgf3 поддерживается в двух карманах, одновременно с ослаблением в самом переднем из карманов совпадает активация в следующем более заднем кармане. У эмбрионов foo/foo инициальная индукция экспрессии fgf3 в любом данном кармане, по-видимому, нарушена лишь слегка. Однако, начало ослабления сигнала, по-видимому, происходит преждевременно, это согласуется с ролью foo в поддержании экспрессии fgf3 в карманах. Т.о., экспрессия foo не нужна для инициальной индукции fgf3 в карманах, но является частью механизма временной позитивной петли обратной связи, которая поддерживает передачу сигналов fgf3. Возможно, что это поддержание осуществляется или на транскрипционном уровне, заставляя клетки продолжать экспрессироваить fgf3, или на уровне выживаемости, обеспечивая сигналами петлю обратной связи, которая защищает fgf3 клетки от апоптоза.

В 26 hpf, в дугах наблюдается 20-кратное увеличение апоптоза в клетках NC. Эта временная волна клеточной гибели, по-видимому, управляет результатом потери поддержания fgf3, т.к. у обоих cas мутантов, у которых отсутствует вся энтодерма (включая экспрессию fgf3 в карманах) и у SU5402-обработанных эмбрионов, у которых передача сигналов Fgf рецепторами блокируется, обнаруживают обширный апоптоз NC клеток. Апоптоз foo мутантных эмбрионов не столь тяжелый как в некоторых др. случаях из-за некоторого сохранения остатков fgf3 signaling. Соответсвенно, fgf3-MO животные, по-видимому, обладают дефектами челюстей, которые очень сходны с и слегка тяжелее, чем те, что обнаруживаются у эмбрионов foo/foo (Рис. 5, 8). Следовательно, неспособность поддерживать экспрессию fgf3 у эмбрионов foo/foo и м.б. причиной случаев распространенного, но преходящего апоптоза клеток NC, вызывающего уменьшение дорсальных структур и mandibular, и hyoid дуг и более изменчивую редукцию в более задних бранхиальных дугах.

Апоптическая гибель клеток NC, по-видимому, объясняет более позднее отсутствие дорсальной части первой и второй дуг доменов экспрессии gsc, также как и потерю дефектов задних дуг в экспрессии dlx2, dlx3b и hand2. В особенности экспрессия dlx2 скорее всего теряется в задних дугах cas/cas и fgf3-MO животных (David et al., 2002). Ненарушенный паттерн вентральных клеток NC проявляется в виде нормальной экспрессии dlx2, dlx3b, hand2, gsc и hoxa2 генов в клетках вентральной части NC, также как и эквивалентность размеров хряща Meckel’s у foo/foo и дикого типа эмбрионов. Интересно, что клетки вентральной части NC и mandibular и hyoid дуг, которые не нуждаются в fgf3-опопсредованных сигналах для выживания и/или пролиферации, отсутвтвуют у SU5402-обработанных эмбрионов, указывая на важную роль разных, еще неустановленных Fgf лигандов. Сходным образом, несмотря на дефекты поддержания fgf3, которые распространяются на более задние карманы, такие как pp3 - pp5, тогда как более задние 5-7 дуги, по-видимому, не затрагиваются у foo/foo эмбрионов. Возможным объяснением нормального формирования паттерна этих задних дуг является не установленный Fgf сигнал. который м. компенсировать потерю fgf3. С этим согласуется то, что fgf3-MO животные часто имеют нормальные хрящи с 5 по 7 дугу, которые отсутствуют у эмбрионов, обработанных SU5402 (David et al., 2002).

Сложность формирования паттерна фарингеальной энтодермы подтверждается наблюдениями потери экспрессии pax8 в рр2 примерно на ст. 20 сомитов (Рис. 9E,F) и сохранение клетками thyroid follicular предшественниками экспрессии pax8 в 34 hpf у foo/fooэмбрионов. Т.к. обе ткани являются производными глоточной энтодермы, то альтеранативные пути д. существовать для индукции экспрессиии pax8 не только в тканях, такиех как глаза, MHB и пронефические протоки, но и также в более медиальных областях глоточной энтодермы. Возможно, что экспресиия foo в глотоных карманах имеет др. важные функции.

Во-первых, м. предположить, что относительные размеры определенных хрящевых элементов м. испытывать непосредственное влияние со стороны продолжительности определенного Fgf сигнала; чем более короткое пульсовое воздействие Fgf, тем меньше клеток будет выживать и пролиферировать и меньше будет структура. Следовательно, возможно что или разные Fgf сигналы м. обеспечивать выживаемость разных популяций предшественников хряща или что короткое, но интенсивное пульсовое воздействие Fgf сигнала будет облегчать выживаемость вблизи источника, но на растоянии эффект будет мал. Во-вторых, предполагается, что региональная функциональность передачи сигналов Fgf будет управлять формой хряща. Паттерн-хзависимая индукция разнообразных молекул антогонистов Fgf, таких как sef или члены семейства sprouty, м. управлять формой хряща путем элиминирования специфических Fgf сигналов из специфических клеток NC. Так, sprouty4 экспрессируется в карманах (Furthauer et al., 2001). Комбинированное действие множественных patterned Fgf агонистов и множественных антогонистов будет генерировать чрезвычайно сложные DV, AP и ML матрицы для выживания, пролиферации и гибели. Более того, небольшие изменения в этом сложном взаимодействии сигналов м.б. одним из механизмов эволюционной адаптацуии структуры челюстей.

Evolutionary implications

Итак, foo является очень ранним регулятором развития ушей и челюстей и находится выше pax8 индукции в обеих структурах. Гены pax2, pax5 и pax8, как полагают, возникли из одиночного родоначального pax2/5/8 гена (Pfeffer et al., 1998). Идентифицирован одиночный pax2/5/8 ген у асцидий и amphioxus, которые экспрессируются в области зачатка глотки, в области. аналогичной фарингеальным дугам позвоночных (Kozmik et al., 1999; Wada et al., 1998). Учитывая общность генной экспрессии между отическим пузырьком и дугами, м. предположить, что возможен синтез между двумя интерпретациями данных экспресии pax2/5/8 у этих примитивных организмов (Kozmik et al., 1999; Wada et al., 1998). Сupulae асцидий м. рассматривать как жаберные щели, которые обладают плакоид-подобными функциями и которые дифференцируются в реснитчатые первичные сенсорные клетки, связанные с питанием. Функциональное и пространственное разделение этих сенсорных областей в независимые от подлежащих дуг структуры, как это имеет место у хордовых, м. объяснить, почему определенные молекулярные маркеры, которые характеризуют исходную энтодерму жаберных щелей поддерживают у позвоночных структуры, производные плакод. Из того, что у рыбок данио коэкспрессируются foo и pax8 в эктодерме отических плакод и в энтодерме карманов, м. сделать вывод, что примордиальные жаберные щели д.были экспрессировать foo и pax8 и в эктодермальнои и энтодермальном слоях.

Даже если челюсти и уши не имеют общего происхождения, обладание ими общими сетями регуляторных генов помогает объяснить, как выход из воды на сушу сдел возможной транссформацию hyomandibular в стемечко (Webster et al., 1992). Если клетки гиоидной части NC теряют причину превращаться в челюсти, но все еще чувствительны ко многим тем же самым сигнальным молекулам, таким как Fgfs, то вполне возможно, что презумптивные клетки hyoid NC начали отвечать на сигналы, родственные отической плакоде вместо того. чтобы формировать челюсть. Без сходства генной экспрессии механизм такого сдвига клеток NC от челюстей к среднему уху м. возникнуть только случано и неконтролируемым образом. To address this issue directly is challenging; however, a simple, testable prediction of this jaw-ear crossover theory is that Foxi1 –/– mice should display middle ear bone defects, perhaps specific to the stapes.

Zebrafish foxi one modulates cellular responses to Fgf signaling required for the integrity of ear and jaw patterningRobert M. Nissen , Jizhou Yan , Adam Amsterdam, Nancy Hopkins and Shawn M. Burgess (burgess@nhgri.nih.gov)),Development 130, 2543-2554, 2003

Zebrafish foxi one modulates cellular responses to Fgf signaling required for the integrity of ear and jaw patterning
Robert M. Nissen , Jizhou Yan , Adam Amsterdam, Nancy Hopkins and Shawn M. Burgess (burgess@nhgri.nih.gov)),
Development 130, 2543-2554, 2003