Глиогенез в Сетчатке

Becoming glial in the neural retina Kathryn B. Moore, Monica L. Vetter (Monica.Vetter@hsc.utah.edu) Developmental Dynamics Volume 221, Issue 2, 2001. Pages:146-153,
During development of the vertebrate neural retina, multipotent stem cells give rise to retinal neurons as well as to Müller cells, the principal glial population in the retina. Recent studies have shed light upon the extracellular and intracellular signaling pathways that regulate Müller glial cell genesis. Emerging evidence demonstrates that activation of the Notch signaling pathway can play a role in regulating Müller cell development as well as gliogenesis in other parts of the central nervous system. Cyclin dependent kinase (CDK) inhibitors of the Cip/Kip subfamily are cell cycle regulators that can regulate progenitor proliferation during retinal development, but also regulate the proliferation of Müller glia when they become activated in response to stress or injury. Surprisingly this class of proteins can also promote the development of Müller glia. In this review we discuss the role of both Notch and the CDK inhibitors in regulating Müller cell development. (Рис.1.) \| p27^Kip1/Xic1 and Notch pathway components promote Müller glial cell differentiation. This model incorporates findings from studies in the retina as well as other CNS tissues. Retinal neuron differentiation is regulated by proneural basic helix-loop-helix (bHLH) transcription factors that promote the expression of Delta, a ligand for the Notch receptor. Activation of Notch on neighboring retinal progenitor cells can lead to expression of the transcription factors Hes1/Hes5, which inhibit expression of proneural bHLH genes. Activation of Notch can also promote expression of glial-specific genes, such as glial fibrillary acidic protein (GFAP), potentially through Hes1/Hes5. Since Hes1/Hes5 are transcriptional repressors, additional downstream components are likely required. Notch expression can be regulated by the paired-type homeodomain transcription factor rax. The cell cycle regulators 27Xic1/Kip1 can also promote Muller glial differentiation through unknown mechanisms. They may promote the expression of glial-specific genes, or potentially regulate the competence of progenitor cells to respond to other glial-promoting signals	У всех позвоночных сетчатка содержит 6 классов нейрональных клеток и один тип глиальных клеток, Müller глиальные клетки. Эти клетки предназначены для выполнения определенных функций, все они происходят из общих стволовых клеток сетчатки. Во время развития сетчатки стволовые клетки или остаются мультипотентными предшественниками, дифференцирующимися в нейроны или в глиальные клетки. Известны факторы, отвечающие за генерацию различных типов нейронов сетчатки. Напр., позитивно действующие helix-loop-helix (bHLH) гены и др. транскрипционные факторы, регулирующие судьбу нейронов в сетчатке. Но мало известно о том, как генерируются Müller клетки в сетчатке из стволовых клеток. Некоторые молекулярные сигналы идентифицированы, включая сигнальные факторы, такие как epidermal growth factor receptor. Большая же часть внеклеточных сигналов и внутриклеточных медиаторов этих сигналов, детерминирующих глиальную судьбу в сетчатке, неидентифицирована. В последенее время достигнуты определенные успехи в этом направлении. Недавно несколько исследований продемонстрировали, что передача сигналов Notch является мощным индуктором глиальной дифференцировки, включая и Müller глию. Рецепторы Notch составляют семейство законсервированных трансмембранных белков, которые со множественными лигандами участвуют в принятии решений о клеточной судьбе во время эмбриогенеза, включая и дифференцировку нейральных стволовых клеток (Рис. 1). NOTCH AND MÜLLER GLIOGENESIS Хотя Notch, как известно, ингибирует нейрогенез во многих системах, однако он играет и инструктивную роль в глиогенезе. В карциномных клетках P19 мышей, усиленная экспрессия постоянно активной формы Notch супресирует нейрональную и мышечную дифференцировку, но не глиогенез.В периферической нервной системе (ПНС) и центральной нервной системе (ЦНС) активация Notch способствует дифференцировке Шванновских клеток из стволовых клеток нейрального гребня и радиальной глиии в переденем мозге мышей, соотв. Установлено, что и Notch1 и Notch3 непосредственно детерминируют мультипотентные клетки предшественники, производные гиппокампа крыс, в астроглию. Клональный анализ показал, что Notch1 и Notch3 действуют инструктивно при выборе судьбы астроглии. В сетчатке позвоночных, Notch экспрессируется клетками предшественниками сетчатки и затем подавляется в дифференцирующихся и зрелых нейронах. Экспрессия Notch усиливается в дифференцирующейся Müller глие у Xenopus laevis, крыс и мышей, это согласуется с предполагаемой его ролью в развитии Müller глии. Известно, что Notch делает возможным глиогенез в сетчатке в дополнение к его хорошо известной роли по блокировнию нейрогнеза. У крыс, экспрессия постоянно активной формы Notch подавляет дифференцировку нейронов, но делает ее возможной для Müller глии. Инструктивная роль Notch в глиогенезе продемонстирована с использованием ретровирусных векторов для инфекции клеток предшественников сетчатки у крыс постоянно активной формой рецепторов Notch. Свыше 90% инфицированных клеток предшественников становилось Müller глией, по сравнению с 8% контрольных инфицированных вирусом клеток. Müller глиальные клетки идентифицировались не только по морфологическим критериям, но и по иммуноокрашиванию антисывороткой к трем маркерам Müller глии. Т.к. при этом количество нейрональных типов клеток снижалось, то очевидно, что Notch м. специфически обеспечивать генерацию глии. Однако, трудно полностью исключить возможность того, что Notch просто предупреждает клетки от дифференцировки вполть до того момента, пока они в позднем развитии не выберут судьбу Müller глии. Тот факт, что не обнаруживается увеличения количества др. поздно появляющихся типов клеток, таких как биполярные клетки или палочки, в Notch-трансфицированных сетчатках указывает на то, что Notch не просто удерживает предшествениики в их исходном состоянии, а обладает способностью различать разрешающие инструкции, которая затушовывается тем фактом, что Müller глиальные клетки являются последними из дифференцирующихся. Ситуация осложняется еще и тем, что трансфицированные/инфицированные клетки находятся в сложных меняющихся условиях из внутренних и внешних сигнальных молекул. Хотя доказательства, полученные на грызунах, подтверждают, что Notch играет роль в глиогенезе Müller клеток, ситуация более запутана у амфибий. У Xenopus, как и в сетчатке крыс, Müller глия - это последние генерируемые клетки и они являются последними клетками, экспрессирующими Notch. Однако, когда клетки предшественники трансфицировали in vivo активированными Notch, ни клеточные деления, ни судьба Müller глии не менялась, вместо этого дифференцировка блокировалась. Не исключена возможность, что трансфицированные клетки были незрелыми глиальными клетками, во всяком случае полученные результаты не согласуются с предположением, что Notch активно способствует глиогенезу. Возможно, что отличия в экспериментальных подходах смогут объяснить разные эффекты активации Notch у грызунов и амфибий. Одной из возможных причин неспособности Notch's индуцировать Müller глию у Xenopus м.б. то, что избыточная экспрессия затрагивает ранние клетки предшественники у Xenopus и что клетки предшественники этих ранних стадий м.б. некомпетентными отвечать на Notch сигнал, чтобы давать глию. Эта гипотеза согласуется с моделью, предложенной Cepko et al. ([1996]), согласно которой митотические клетки сетчатки со временем меняют свою способность отвечать на ретинальную среду. Т.к. эффекты активации Notch также м. изменяться в ходе развития сетчатки, то интересно было бы проверить, влияет ли трансфекция Notch позднее у Xenopus в развитии сетчатки, исходя из предположения, что предшественники поздних стадий д. обладать способностью дифференцироваться в Müller глию. Или, напротив, Notch м. играть более пермиссивную роль в детерминации судьбы глии в сетчатке амфибий. Проверка эффектов экспрессии высоких уровней Delta^STU, укороченной формы лиганда Notch, показала, что она взаимодействует с активацией пути Notch в предшественниках сетчатки. Клетки, неправильно экспрессирующие Delta^STU, никогда не дифференцируются в Müller глию, но принимают более ранннюю нейрональную судьбу. Эти результаты указывают на то, что даже если передача сигналов Notch не играет инструктивную роль в Müller глиогенезе у Xenopus, то активация этого пути м.б. важной для контроля реакции клеток предшественников на дифференцирующие сигналы, включая и те, что способствуют выбору судьбы Müller глии. EFFECTORS OF THE NOTCH PATHWAY IN THE RETINA Остается определить в точности, как Notch инструктирует предшественников принять судьбу Müller глии в сетчатке грызунов. Одна из возможностей - это вовлечение активации негативно действующих basic helix-loop-helix факторов, сходных с Drosophila hairy и Enhancer of split. таких как Hes гены (Рис. 1). Было установлено, что Hes1 экспрессируется в клетках предшественниках сетчатки и подавляется в дифференцирующихся нейронах, тогда как экспрессия сохраняется в Müller глие. Клетки дифференцирующейся глии в сетчатке мышей экспрессируют также Hes5. Активация Notch, как было установлено, индуцирует экспрессию и Hes1 и Hes5 у млекопитающих; однако, это не было продемонстрировано в отношении развития сетчатки. У мышей эктопическая экспрессия Hes1 в культивируемых E17 сетчатках покзала, что Hes1-трансфицированные клетки не напоминают какие-либо зрелые клетки сетчатки. Вместо этого Hes1, по-видимому, держит клетки в состоянии недифференцированных предшественников. Хотя анализ фенотипа Müller глии не был специально исследован в этой работе с помощью специфических для глии маркеров, но Hes1, по-видимому, ингибирует и глиальную и нейрональную дифференцировку. Дальнейший анализ с использованием ретровирусных векторов и ряда Müller клеточно-специфических антител показал, что форсированная экопическая экспрессия Hes1 на ст. P0 сетчатки крыс вызывает увеличение количества Müller глии. Напротив, если передача сигналов Notch блокирована с использованием доминантно негативных форм Hes1, то появляется меньше Müller глии. Это согласуется с предположением, что Hes1 опосредует эффекты активации Notch. Разлдичия между этими двумя экспреиментами м.б. обусловлены различиями в уровнях экспрессиии генов. Кроме того, на Hes1 трансфицирующий культуры сетчатки м. влиять несколько другое время развития, в одном эксперименте это сетчатки ст. E17.5-P0 в др. только ст. P0 постнатального развития. Возможно, что предшественники разных стадий отвечают по-разному на Hes1. Эффекты также м. зависеть от присутствия или отсутствия др. факторов в этих культурах сетчатки. Др.Notch эффектор, Hes5 также является хорошим кандидатом на роль передатчика сигналов Notch во время Müller глиогенеза. Эктопическая экспрессия в разивающейся сетчатке Hes5 обладает способностью увеличивать количество клетокMüller глии, тогда как ингибирование ведет к генерации палочковидных фоторецепторов, поздно-возникающих нейрональных клеток. Этот эффект, по-видимому, является результатом конверсии предшественников глии в клетки с нейрональной судьбой. У эмбрионов мыши без Hes5 количество клеток Müller глии снижено. Полученные результаты указывают на то, что Hes гены важны для опосредования эффектов Notch в регуляции Müller глиогенеза. Активирует ли Notch один или оба Hes гена in vivo во время развития сетчатки еще предстоит определить. Недавно установлено, что родственный Hes генам, hairy/Enhancer of split [E(spl)] homolog 2 (hesr2) способствует глиогенезу в культурах эксплантов сетчатки из эмбрионов и новорожденных мышей. Ген hesr2 не влияет на пролиферацию или гибель клеток, это указывает на то, что hesr2 действует инструктивно, способствуя выбору глиальной судьбы. Ген hesr2 оказывает более значительный эффект на постнатальные культуры, чем пренатальные, снова подтверждая модель, согласно которой компетентность предшественников реагиррует на средовые сигналы, которые м. меняться в ходе развития сетчатки. Не установлена зависит ли активация hesr2 от Notch. Механизм(ы), с помощью которых Notch эффекторы специфицируют глиальную судьбу неясны. Глиогенез м. происходить как в результате прямой Hes так и hesr2-опосредованной активации специфичного для глии пути. Возможно, что эти гены м. усиливать действие транскрипционных факторов, индуцирующих глиогнез. Показано, что и Notch1 и Notch3 способствуют дифференцировке астроцитов из мультипотентных клеток предшественников, производных гиппокампа, и способствуют также активации промоторов для glial fibrillary acidic protein (GFAP), специфичного для глии гена, который экспрессируется и в Müller глии. Сходные механизмы м. действовать и в сетчатке. Альтернативно, глиальная судьба м.б. состоянием, которое м. достигнуто, если только факторы, способствующие нейрональной дифференцировке, репрессированы, а окружающие условия будут способствовать достижению глиальной судьбы. В подтверждение этой гипотезы, Müller глиальные клетки репрессируются с помощью позитивно действующих bHLH генов, т.к. они увеличиваются в сетчаткахMash1 и NeuroD-дефицитных мышей. Корреляции между увеличением количества клеток Müller глии и усилением активности hesr2 обнаружены в сетчатках Mash1-Math3 двойных нокаутных мышей,это указывает на то, что Mash1 и Math3 обычно должны репрессировать глиогенез, ингибируя hesr2. Hes1 и Hes5 м. репрессировать экспрессию пронейральных bHLH генов, таких как NeuroD и Mash1, которые обычно функционируют, способствуя приобретению нейрональной судьбы клеткми (Рис. 1). Было показано, что Hes1 необходим, чтобы репрессировать активность и экспрессию Mash1. Нет прямых доказательств для репрессииr Hes5 позитивно действующими bHLH факторами в сетчатке; однако, экспрессия Mash1 усиливается в областях, лишенных Hes5 у Notch мутантных мышей. Т.обр., ключевой ступенью для Müller глиогенеза м.б. потеря нейрогенных возможностей, что потом позволяет др. факторам обеспечивать или разрешать глиальную дифференцировку. Эта модель согласуется с данными, демонстрирующими, что где то в др. месте WYC пронейральные bHLH регулируют выбор или нейрональной или глиальной судьбы за счет способствования нейрогенезу и ингибирования глиогенеза. Используя кортикальные структуры мыши, было показано, что bHLH фактор neurogenin1 оладает способностью обеспечивать выбор нейральной судьбы, действуя как транскрипционный активатор, тогда как ингибирование дифференцировки астроцитов обеспечивается секвестрированием транскрипционного коактиватора, CBP/p300, необходимого для активации генов глиальной дифференцировки. В др. исследовании изучали роль neurogenin2 и Mash1 в культурах из кортикальных предшественников мышей. Т.к. популяция ngn2;Mash1 мутантных клеток предшественников при выборе судьбы сдвигалась с нейрональной к глиальной, то это строго свидетельствует, что neurogenin2 и Mash1 обычно направляют развитие клеток в направлении нейрональной судьбы. Разумно предположить, что сходные bHLH факторы м. контролировать судьбу предшественников нейрональных и Müller глиальных клеток в сетчатке за счет прямого активирования нейрогенной транскрипции и репрессии глиогенеза, и/или непрямого регулирования компетентности предшественников отвечать на внешние нейроненый и глиогенные сигналы, такие как Notch. Все эти исследования ведут нас к пониманию того, как возникают Müller глиальные клетки. Роль Notch в этом процессе Müller глиогенезе согласуется с с его ролью, обнаруженной в глиогенезе и в ПНС и ЦНС. Хотя и имеются доказательства того, что передача сигналов Notch и Hes генов способствует образованию Müller глиальных клеток, мы лишь в начале выявления компонентов Notch-опосредованного глиогенеза в сетчатке. Наблюдения, что Müller глия все еще генерируется у Hes5 нулевых мышей и что избыточная экспрессия Notch способствует пролиферации предшественников в сетчатке, тогда как Hes1 нет, указывает на то, что Notch м. не всегда действовать посредством Hes генов. Notch м. активировать др. гены, такие как Deltex, которые м. ингибировать гены дифференцировки независимо от генов Hes или он м. активировать ген hesr2. Исход передачи сигналов Notch во время ретиногенеза м.б. назависим от присутствия или отсутствия вне- и внутриклеточных сигналов. Одним из потенциальных кандидатов является epidermal growth factor receptor (EGFR), который участвует в генезе клеток Müller глии. Notch регулирует некоторые реакции клеток на члены семейства EGF. Что регулирует способность клеток отвечать на лиганды Notch? Установлено, что избыточная экспрессия rax гомеобоксного гена ведет к усилению активности Notch в клетках сетчатки и м. способствовать дифференцировке клеток Müller глии, указывая тем самым, что Rax м. регулировать экспрессию Notch в предшественниках (Рис. 1). Судьба Müller клеток вместе с судьбой специфических ретинальных нейронов скорее всего приобретается в ответ на внешние сигналы, такие как Notch благодаря активации или репрессии уникальных комбинаций позитивно- и негативно действующих bHLH факторов, гомеобоксных генов и нижестоящих мишеней. CYCLIN DEPENDENT KINASE INHIBITORS IN THE RETINA Предполагается, что предшественники сетчатки отвечают на внеклеточные сигналы, такие как сигналы Notch пути или активация epidermal growth factor receptor (EGFR), чтобы помочь им выйти из клеточного цикла и приобрести фенотип, который они хотят. Следовательно, регуляция контроля клеточного цикла интимно связана с контролем дифференцировки клеток сетчатки. Ход клеточного цикла контролируется активностью cyclin-dependent kinases (CDKs), которые негативно регулируются посредством взаимодействия с ингибиторами cyclin-dependent kinase inhibitors (CKIs). CKIs реагируют на сигналы, ингибирующие рост из внеклеточного окружения, обусловливая арест клеточного цикла в G1. CKIs , следовательно, играют важную роль в регуляции пролиферации клеток предшественников в ответ на внеклеточные сигналы. Члены CKIs сверхсемейства Cip/Kip включают три белка у млекопитающих, p21^Cip1, p27^Kip1 и p57^Kip2. Все три содержат cyclin/cdk связывающий домен на своем N-конце, который необходим для ингибирования активности циклин-зависимых киназ. Предполагается, что некоторые члены этого сверхсемейства CKIs регулируют пролиферацию клеток Müller глии и играют также роль в развитии Müller глии. CKI белок p27^Kip1 обнаруживает две фазы экспрессии в сетчатке мышей, указывая тем самым на его участие более чем в одной стадии развития глаз. Ранняя фаза экспрессии p27^Kip1 обнаруживается в ранних постмитотических клетках сетчатки, когда они выходят из клеточного цикла, это согласуется с его ролью в регуляции выхода из клеточного цикла предшествеников сетчатки и указывает на то, что избыточной экспрессии p27^Kip1 в клетках предшественниках сетчатки в кульуредостаточно для обеспечения выхода из клеточного цикла, даже в присутствии митогена. Однако, помимо ранней фазы экспрессии обнаруживается сохранение экспрессии p27^Kip1 в дифференцирующейся Müller глие зрелой сетчатки мыши. Это указывает на то, что p27^Kip1 м. регулировать некоторые аспекты зрелого фенотипа этих клеток. REGULATION OF REACTIVE GLIOSIS OF MÜLLER CELLS Целенаправленное разрушение p27^Kip1 у мышей обусловливает увеличение пролиферации и мульти-органную гиперплазию, включая эффекты и на ЦНС. Нокаутные p27^Kip1 мыши обнаруживают также фенотип дисплазии сетчатки, который обусловлен изменениями Müller глии скорее, чем генерализованными эффектами на пролиферацию предшественников. Установлено, что временное окно, во время которого клетки сетчатки пролиферируют увеличено у p27^Kip1 нокаутных мышей, но p27^Kip1 необязателен для выходя из клеточного цикла предшественников сетчатки. Однако, у p27^Kip1 нокаутных мышей Müller глия дизорганизована, пролиферирует за пределами обычного временного промежуткагенеза Müller клеток и экспрессирует glial fibrillary acidic protein (GFAP), который обычно экспрессируется в этих клетках в ответ на острый стресс или повреждение сетчатки. Выявлено 10-20 кратная индукция GFAP-иммунореактивности Müller глиальных клеток у p27Kip1 нокаутных мышей. Реактивная Müller глия разрушает наружную ограничивающую мембрану сетчатки и вызывает смещение тел фоторецепторных клеток и Müller глии в область обычно содержащую наружные сегменты, тем самым приводя к фенотипу ретинальной дисплазии. Чтобы показать, что фенотип ретинальной дисплазии обусловлен активацией Müller глиальных клеток, индуцировали реактивный глиоз в сетчатке с помощью ouabain. Выявили драматическое увеличение количества GFAP-позитивных Müller клеток, сопровождаемое подавлением p27^Kip1 и активацией пролиферации этих клеток. Кроме того, индукции реактивного глиоза оказалось достаточно, чтобы вызвать разрушение наружной ограничивающей мембраны, что вело к ретинальной дисплазии, сходной с той, что наблюдалась у p27^Kip1 нокаутных мышей. Для объяснения, почему реактивные Müller глиальные клетки не продолжают беспрепятственно пролиферировать в отсутствие функции p27^Kip1, было установлено, что происходит подавление позитивного регулятора клеточного цикла cyclin D3 в течение 24 ч. после активации реактивного глиоза. В клоне олигодендроцитов зрительного нерва финальный арест роста in vivo обнаруживает сходство и связан со специфическим подавлением уровня cyclin E. Т.обр., регуляция уровней циклинов м.б. важным компенсаторным механизмом, который м. гарантировать, что контроль клеточного цикла не очень сильно зависит от активности CKI белков, таких как p27^Kip1. p27^Kip1, т.обр., по-видимому. играет роль в регуляции инициации реактивного глиоза в сетчатке, возможно за счет контроля повторного вступления Müller глиальных клеток в клеточный цикл. Остается вопрос, насколько важно повторное вступление в клеточный цикл для инициации реактивного глиального фенотипа и не играет ли p27^Kip1 более непосредственную роль в регуляции реактивного фенотипа Müller глии. REGULATION OF MÜLLER GLIAL DIFFERENTIATION BY CYCLIN DEPENDENT KINASE INHIBITORS Не выявлено эффектов на соотношение дифференцированных типов клеток в сетчатке p27^Kip1 нокаутных мышей, это указывает на то. что p27^Kip1у мышей не играет роли в нормальном гистогенезе сетчатки. Сходные результаты полученны на Xenopus с использованием p27^Xic1. Этот белок член Cip/Kip семейства CKIs, который обнаруживает гомологию и с Cip1 и Kip1 и также экспрессируется в клетках сетчатки, когда они начинают дифференцировку. На поздних стадиях, экспрессия p27^Xic1 в зрелых клетках центральной сетчатки снижается, но персистирует на краях, где ретинальный гистогенез продолжается а течсение всей жизни животных. Было показано, что избыточная экспрессия p27^Xic1 в предшественниках сетчатки у Xenopus вызывает драматическое увеличение представительства Müller глии вместо биполярных клеток. Происходит арест очень раннего клеточного цикла в ответ на избыточную экспрессию p27^Xic1, это согласуется с тем, что наблюдается при избыточной экспрессии p27^Kip1. Однако, одного ареста клеточного цикла недостаточно для индукции образования Müller глии, т.к. обработка hydroxyurea или избыточная экспрессия доминантно-негативных форм Cdk2 и cdc2 не индуцируют Müller глии. Эти результаты подтвержают, что that p27^Xic1 играет инструктивную роль в развитии клеток Müller глии (Рис. 1). C помощью делеционного анализа p27^Xic1 белка удалось установить, что способность p27Xic1 способствовать дифференцировке Müller глиальных клеток отделима от CDK ингибирующей активности белка. Область на N-конце p27^Xic1, известная как CDK/cyclin-связывающая область, необходима для обеих функций, хотя короткий участок из пяти аминокислот необходим для индуцирующей активности Müller клеток, но не для CDK ингибирующей активности. CDK/cyclin связывающая область законсервирована у всех членов Cip/Kip сверхсемейства CKIs, это согласуется с обнаружением, что у млекопитающих p27^Kip1 и p21^Cip1 также способствуют активности Müller глии, когда экспрессируются избыточно. Мутантная форма p21^Cip1, которая обладает пониженной способностью ингибировать ход клеточного цикла, все еще способна эффективно способствовать дифференцировке клетокMüller глии. Следовательно, p27^Xic1 и родственные молекулы м. регулировать генез Müller глии во время нормального развития и что эта функция независит от клеточный цикл регулирующей активности CKIs. Механизм, лежащий в основе этой способности способстовать дифференцировке клеток Müller глии, неясен. Коэкспрессия cyclin A2 и Cdk2 с p27^Kip1 ингибирует его активность, способствующую Müller глие, за счет связывания p27^Kip1 и титрации его или стерического блокирования его домена, индуцирующего Müller глиальные клетки. Т.к. очень небольшая область p27^Xic1 белка специфически отвечает за его способность обеспечивать дифференцировку Müller глиальных клеток, то должна быть стратовая точка для следования потенциалу взаимодействующих компонентов. Избыточная экспрессия p27^Xic1 в сетчатке грызунов м. вызывать некоторое увеличение генеза Müller глиальных клеток в обмен на биполярные клетки, сходное с тем, что обнаруживается у Xenopus. Однако, тот же самый эффект не обнаруживается с p27^Kip1. Необходим ли p27^Xic1 для нормального генеза Müller глиальных клеток в сетчатке Xenopus? Снижение эндогенной экспрессии p27^Xic1 в разивающейся сетчатке с помощью антисмысловой конструкции приводит к 50% снижению глии у p27^Kip1 нокаутных мышей, но глия скорее всего становится аномально реактивной. p27^Xic1 у Xenopus и p27^Kip1 мыши не являются прямыми гомологами, поэтому хотя активность p27^Xic1 и м.б. необходимой для генеза Müller глиальных клеток in vivo, это м.б. неверным для p27^Kip1. Эта функция м. выполняться др. родственной молекулой у мышей. Это подтверждается наблюдением, что p27^Xic1, но не p27^Kip1, м. способстовать дифференцировке Müller глиальных клеток в сетчатке грызунов. Имеются также отличия в основных механизмах, используемых для генерации Müller глии, у амфибий и грызунов. Возможно также, что компенсаторные механизмы вструпают в игру у p27^Kip1 нокаутных мышей. гарантируя генерацию нормального количества Müller глии. Т.к. экспрессия антисмысловых конструкций в сетчатке Xenopus затрагивает только небольшой набор клеток, то сходные компенсаторные механизмы м. не вступать в действие. Открывается также возможность, что у Xenopus антисмысловые эксперименты с глией м. присутствовать, но они просто аномально реактивны и избегают идентификации с помощью критериев ламинарной позиции и морфологии. Важной функцией CKIs является реакция на внеклеточные сигналы, чтобы регулировать ход клеточного цикла. Интересно бы рассмотреть возможность того, что этот класс белков м. также интегрировать информацию от внешних сигналов, чтобы регулировать генез Müller глиальных клеток. Несколько внешних сигнальных путей влияют на генез Müller глии. Так, активация Notch пути м. способствовать дифференцировке Müller глиальныхы клеток. Notch м. дейстовать синергично с p27^Xic1 в регуляции дифференцировки Müller глии. Пока не установлено, м. ли др. внеклеточные сигнальные пути также действовать синергично с CDK ингибитором белков для регуляции дифференцировки Müller глии. Единственный кандидат на эту роль - это EGFR сигнальный путь. Усиление передачи сигналов за счет избыточной экспрессии EGFR в клетках предшественниках ретины увеличивает пропорцию клеток, которые дифференцируются в Müller глию. Следовательно, передача сигналов через EGFR м. оказывать дифференциальные эффекты на CDK ингибитор белков, такой как p27^Kip1, чтобы регулировать или пролиферацию или дифференцировку Müller глиальных клеток. Высокие уровни передачи сигналов EGFR в предшественниках сетчатки не всегда способствуют Müller глиальному фенотипу. Мкорее всего такой исход зависит от стадии развития и окружающей среды, в которой находятся предшественники. Следовательно, др. еще неидентифицированные сигнальные пути дю. иметь важное значение в регуляции Müller глиального фенотипа. TВсе это указывает на то, что CDK ингибиторные белки м. регулировать пролиферацию Müller глиальных клеток во время реактивного глиоза в сетчатке, а также генез Müller глиальных клеток во время развития. Интересно было бы рассмотреть возможность того, что CDK ингибирующие белки регулируют также реактивный глиоз и в др. частях нервной системы.

У всех позвоночных сетчатка содержит 6 классов нейрональных клеток и один тип глиальных клеток, Müller глиальные клетки. Эти клетки предназначены для выполнения определенных функций, все они происходят из общих стволовых клеток сетчатки. Во время развития сетчатки стволовые клетки или остаются мультипотентными предшественниками, дифференцирующимися в нейроны или в глиальные клетки. Известны факторы, отвечающие за генерацию различных типов нейронов сетчатки. Напр., позитивно действующие helix-loop-helix (bHLH) гены и др. транскрипционные факторы, регулирующие судьбу нейронов в сетчатке.

Но мало известно о том, как генерируются Müller клетки в сетчатке из стволовых клеток. Некоторые молекулярные сигналы идентифицированы, включая сигнальные факторы, такие как epidermal growth factor receptor. Большая же часть внеклеточных сигналов и внутриклеточных медиаторов этих сигналов, детерминирующих глиальную судьбу в сетчатке, неидентифицирована. В последенее время достигнуты определенные успехи в этом направлении.

Недавно несколько исследований продемонстрировали, что передача сигналов Notch является мощным индуктором глиальной дифференцировки, включая и Müller глию. Рецепторы Notch составляют семейство законсервированных трансмембранных белков, которые со множественными лигандами участвуют в принятии решений о клеточной судьбе во время эмбриогенеза, включая и дифференцировку нейральных стволовых клеток (Рис. 1).

NOTCH AND MÜLLER GLIOGENESIS

Хотя Notch, как известно, ингибирует нейрогенез во многих системах, однако он играет и инструктивную роль в глиогенезе. В карциномных клетках P19 мышей, усиленная экспрессия постоянно активной формы Notch супресирует нейрональную и мышечную дифференцировку, но не глиогенез.В периферической нервной системе (ПНС) и центральной нервной системе (ЦНС) активация Notch способствует дифференцировке Шванновских клеток из стволовых клеток нейрального гребня и радиальной глиии в переденем мозге мышей, соотв. Установлено, что и Notch1 и Notch3 непосредственно детерминируют мультипотентные клетки предшественники, производные гиппокампа крыс, в астроглию. Клональный анализ показал, что Notch1 и Notch3 действуют инструктивно при выборе судьбы астроглии.

В сетчатке позвоночных, Notch экспрессируется клетками предшественниками сетчатки и затем подавляется в дифференцирующихся и зрелых нейронах. Экспрессия Notch усиливается в дифференцирующейся Müller глие у Xenopus laevis, крыс и мышей, это согласуется с предполагаемой его ролью в развитии Müller глии. Известно, что Notch делает возможным глиогенез в сетчатке в дополнение к его хорошо известной роли по блокировнию нейрогнеза. У крыс, экспрессия постоянно активной формы Notch подавляет дифференцировку нейронов, но делает ее возможной для Müller глии. Инструктивная роль Notch в глиогенезе продемонстирована с использованием ретровирусных векторов для инфекции клеток предшественников сетчатки у крыс постоянно активной формой рецепторов Notch. Свыше 90% инфицированных клеток предшественников становилось Müller глией, по сравнению с 8% контрольных инфицированных вирусом клеток. Müller глиальные клетки идентифицировались не только по морфологическим критериям, но и по иммуноокрашиванию антисывороткой к трем маркерам Müller глии. Т.к. при этом количество нейрональных типов клеток снижалось, то очевидно, что Notch м. специфически обеспечивать генерацию глии. Однако, трудно полностью исключить возможность того, что Notch просто предупреждает клетки от дифференцировки вполть до того момента, пока они в позднем развитии не выберут судьбу Müller глии. Тот факт, что не обнаруживается увеличения количества др. поздно появляющихся типов клеток, таких как биполярные клетки или палочки, в Notch-трансфицированных сетчатках указывает на то, что Notch не просто удерживает предшествениики в их исходном состоянии, а обладает способностью различать разрешающие инструкции, которая затушовывается тем фактом, что Müller глиальные клетки являются последними из дифференцирующихся. Ситуация осложняется еще и тем, что трансфицированные/инфицированные клетки находятся в сложных меняющихся условиях из внутренних и внешних сигнальных молекул.

Хотя доказательства, полученные на грызунах, подтверждают, что Notch играет роль в глиогенезе Müller клеток, ситуация более запутана у амфибий. У Xenopus, как и в сетчатке крыс, Müller глия - это последние генерируемые клетки и они являются последними клетками, экспрессирующими Notch. Однако, когда клетки предшественники трансфицировали in vivo активированными Notch, ни клеточные деления, ни судьба Müller глии не менялась, вместо этого дифференцировка блокировалась. Не исключена возможность, что трансфицированные клетки были незрелыми глиальными клетками, во всяком случае полученные результаты не согласуются с предположением, что Notch активно способствует глиогенезу. Возможно, что отличия в экспериментальных подходах смогут объяснить разные эффекты активации Notch у грызунов и амфибий.

Одной из возможных причин неспособности Notch's индуцировать Müller глию у Xenopus м.б. то, что избыточная экспрессия затрагивает ранние клетки предшественники у Xenopus и что клетки предшественники этих ранних стадий м.б. некомпетентными отвечать на Notch сигнал, чтобы давать глию. Эта гипотеза согласуется с моделью, предложенной Cepko et al. ([1996]), согласно которой митотические клетки сетчатки со временем меняют свою способность отвечать на ретинальную среду. Т.к. эффекты активации Notch также м. изменяться в ходе развития сетчатки, то интересно было бы проверить, влияет ли трансфекция Notch позднее у Xenopus в развитии сетчатки, исходя из предположения, что предшественники поздних стадий д. обладать способностью дифференцироваться в Müller глию. Или, напротив, Notch м. играть более пермиссивную роль в детерминации судьбы глии в сетчатке амфибий. Проверка эффектов экспрессии высоких уровней Delta^STU, укороченной формы лиганда Notch, показала, что она взаимодействует с активацией пути Notch в предшественниках сетчатки. Клетки, неправильно экспрессирующие Delta^STU, никогда не дифференцируются в Müller глию, но принимают более ранннюю нейрональную судьбу. Эти результаты указывают на то, что даже если передача сигналов Notch не играет инструктивную роль в Müller глиогенезе у Xenopus, то активация этого пути м.б. важной для контроля реакции клеток предшественников на дифференцирующие сигналы, включая и те, что способствуют выбору судьбы Müller глии.

EFFECTORS OF THE NOTCH PATHWAY IN THE RETINA

Остается определить в точности, как Notch инструктирует предшественников принять судьбу Müller глии в сетчатке грызунов. Одна из возможностей - это вовлечение активации негативно действующих basic helix-loop-helix факторов, сходных с Drosophila hairy и Enhancer of split. таких как Hes гены (Рис. 1). Было установлено, что Hes1 экспрессируется в клетках предшественниках сетчатки и подавляется в дифференцирующихся нейронах, тогда как экспрессия сохраняется в Müller глие. Клетки дифференцирующейся глии в сетчатке мышей экспрессируют также Hes5. Активация Notch, как было установлено, индуцирует экспрессию и Hes1 и Hes5 у млекопитающих; однако, это не было продемонстрировано в отношении развития сетчатки.

У мышей эктопическая экспрессия Hes1 в культивируемых E17 сетчатках покзала, что Hes1-трансфицированные клетки не напоминают какие-либо зрелые клетки сетчатки. Вместо этого Hes1, по-видимому, держит клетки в состоянии недифференцированных предшественников. Хотя анализ фенотипа Müller глии не был специально исследован в этой работе с помощью специфических для глии маркеров, но Hes1, по-видимому, ингибирует и глиальную и нейрональную дифференцировку. Дальнейший анализ с использованием ретровирусных векторов и ряда Müller клеточно-специфических антител показал, что форсированная экопическая экспрессия Hes1 на ст. P0 сетчатки крыс вызывает увеличение количества Müller глии. Напротив, если передача сигналов Notch блокирована с использованием доминантно негативных форм Hes1, то появляется меньше Müller глии. Это согласуется с предположением, что Hes1 опосредует эффекты активации Notch. Разлдичия между этими двумя экспреиментами м.б. обусловлены различиями в уровнях экспрессиии генов. Кроме того, на Hes1 трансфицирующий культуры сетчатки м. влиять несколько другое время развития, в одном эксперименте это сетчатки ст. E17.5-P0 в др. только ст. P0 постнатального развития. Возможно, что предшественники разных стадий отвечают по-разному на Hes1. Эффекты также м. зависеть от присутствия или отсутствия др. факторов в этих культурах сетчатки.

Др.Notch эффектор, Hes5 также является хорошим кандидатом на роль передатчика сигналов Notch во время Müller глиогенеза. Эктопическая экспрессия в разивающейся сетчатке Hes5 обладает способностью увеличивать количество клетокMüller глии, тогда как ингибирование ведет к генерации палочковидных фоторецепторов, поздно-возникающих нейрональных клеток. Этот эффект, по-видимому, является результатом конверсии предшественников глии в клетки с нейрональной судьбой. У эмбрионов мыши без Hes5 количество клеток Müller глии снижено. Полученные результаты указывают на то, что Hes гены важны для опосредования эффектов Notch в регуляции Müller глиогенеза. Активирует ли Notch один или оба Hes гена in vivo во время развития сетчатки еще предстоит определить.

Недавно установлено, что родственный Hes генам, hairy/Enhancer of split [E(spl)] homolog 2 (hesr2) способствует глиогенезу в культурах эксплантов сетчатки из эмбрионов и новорожденных мышей. Ген hesr2 не влияет на пролиферацию или гибель клеток, это указывает на то, что hesr2 действует инструктивно, способствуя выбору глиальной судьбы. Ген hesr2 оказывает более значительный эффект на постнатальные культуры, чем пренатальные, снова подтверждая модель, согласно которой компетентность предшественников реагиррует на средовые сигналы, которые м. меняться в ходе развития сетчатки. Не установлена зависит ли активация hesr2 от Notch.

Механизм(ы), с помощью которых Notch эффекторы специфицируют глиальную судьбу неясны. Глиогенез м. происходить как в результате прямой Hes так и hesr2-опосредованной активации специфичного для глии пути. Возможно, что эти гены м. усиливать действие транскрипционных факторов, индуцирующих глиогнез. Показано, что и Notch1 и Notch3 способствуют дифференцировке астроцитов из мультипотентных клеток предшественников, производных гиппокампа, и способствуют также активации промоторов для glial fibrillary acidic protein (GFAP), специфичного для глии гена, который экспрессируется и в Müller глии. Сходные механизмы м. действовать и в сетчатке. Альтернативно, глиальная судьба м.б. состоянием, которое м. достигнуто, если только факторы, способствующие нейрональной дифференцировке, репрессированы, а окружающие условия будут способствовать достижению глиальной судьбы. В подтверждение этой гипотезы, Müller глиальные клетки репрессируются с помощью позитивно действующих bHLH генов, т.к. они увеличиваются в сетчаткахMash1 и NeuroD-дефицитных мышей. Корреляции между увеличением количества клеток Müller глии и усилением активности hesr2 обнаружены в сетчатках Mash1-Math3 двойных нокаутных мышей,это указывает на то, что Mash1 и Math3 обычно должны репрессировать глиогенез, ингибируя hesr2. Hes1 и Hes5 м. репрессировать экспрессию пронейральных bHLH генов, таких как NeuroD и Mash1, которые обычно функционируют, способствуя приобретению нейрональной судьбы клеткми (Рис. 1). Было показано, что Hes1 необходим, чтобы репрессировать активность и экспрессию Mash1. Нет прямых доказательств для репрессииr Hes5 позитивно действующими bHLH факторами в сетчатке; однако, экспрессия Mash1 усиливается в областях, лишенных Hes5 у Notch мутантных мышей. Т.обр., ключевой ступенью для Müller глиогенеза м.б. потеря нейрогенных возможностей, что потом позволяет др. факторам обеспечивать или разрешать глиальную дифференцировку. Эта модель согласуется с данными, демонстрирующими, что где то в др. месте WYC пронейральные bHLH регулируют выбор или нейрональной или глиальной судьбы за счет способствования нейрогенезу и ингибирования глиогенеза. Используя кортикальные структуры мыши, было показано, что bHLH фактор neurogenin1 оладает способностью обеспечивать выбор нейральной судьбы, действуя как транскрипционный активатор, тогда как ингибирование дифференцировки астроцитов обеспечивается секвестрированием транскрипционного коактиватора, CBP/p300, необходимого для активации генов глиальной дифференцировки. В др. исследовании изучали роль neurogenin2 и Mash1 в культурах из кортикальных предшественников мышей. Т.к. популяция ngn2;Mash1 мутантных клеток предшественников при выборе судьбы сдвигалась с нейрональной к глиальной, то это строго свидетельствует, что neurogenin2 и Mash1 обычно направляют развитие клеток в направлении нейрональной судьбы. Разумно предположить, что сходные bHLH факторы м. контролировать судьбу предшественников нейрональных и Müller глиальных клеток в сетчатке за счет прямого активирования нейрогенной транскрипции и репрессии глиогенеза, и/или непрямого регулирования компетентности предшественников отвечать на внешние нейроненый и глиогенные сигналы, такие как Notch.

Все эти исследования ведут нас к пониманию того, как возникают Müller глиальные клетки. Роль Notch в этом процессе Müller глиогенезе согласуется с с его ролью, обнаруженной в глиогенезе и в ПНС и ЦНС. Хотя и имеются доказательства того, что передача сигналов Notch и Hes генов способствует образованию Müller глиальных клеток, мы лишь в начале выявления компонентов Notch-опосредованного глиогенеза в сетчатке. Наблюдения, что Müller глия все еще генерируется у Hes5 нулевых мышей и что избыточная экспрессия Notch способствует пролиферации предшественников в сетчатке, тогда как Hes1 нет, указывает на то, что Notch м. не всегда действовать посредством Hes генов. Notch м. активировать др. гены, такие как Deltex, которые м. ингибировать гены дифференцировки независимо от генов Hes или он м. активировать ген hesr2. Исход передачи сигналов Notch во время ретиногенеза м.б. назависим от присутствия или отсутствия вне- и внутриклеточных сигналов. Одним из потенциальных кандидатов является epidermal growth factor receptor (EGFR), который участвует в генезе клеток Müller глии. Notch регулирует некоторые реакции клеток на члены семейства EGF. Что регулирует способность клеток отвечать на лиганды Notch? Установлено, что избыточная экспрессия rax гомеобоксного гена ведет к усилению активности Notch в клетках сетчатки и м. способствовать дифференцировке клеток Müller глии, указывая тем самым, что Rax м. регулировать экспрессию Notch в предшественниках (Рис. 1).

Судьба Müller клеток вместе с судьбой специфических ретинальных нейронов скорее всего приобретается в ответ на внешние сигналы, такие как Notch благодаря активации или репрессии уникальных комбинаций позитивно- и негативно действующих bHLH факторов, гомеобоксных генов и нижестоящих мишеней.

CYCLIN DEPENDENT KINASE INHIBITORS IN THE RETINA

Предполагается, что предшественники сетчатки отвечают на внеклеточные сигналы, такие как сигналы Notch пути или активация epidermal growth factor receptor (EGFR), чтобы помочь им выйти из клеточного цикла и приобрести фенотип, который они хотят. Следовательно, регуляция контроля клеточного цикла интимно связана с контролем дифференцировки клеток сетчатки. Ход клеточного цикла контролируется активностью cyclin-dependent kinases (CDKs), которые негативно регулируются посредством взаимодействия с ингибиторами cyclin-dependent kinase inhibitors (CKIs). CKIs реагируют на сигналы, ингибирующие рост из внеклеточного окружения, обусловливая арест клеточного цикла в G1. CKIs , следовательно, играют важную роль в регуляции пролиферации клеток предшественников в ответ на внеклеточные сигналы. Члены CKIs сверхсемейства Cip/Kip включают три белка у млекопитающих, p21^Cip1, p27^Kip1 и p57^Kip2. Все три содержат cyclin/cdk связывающий домен на своем N-конце, который необходим для ингибирования активности циклин-зависимых киназ. Предполагается, что некоторые члены этого сверхсемейства CKIs регулируют пролиферацию клеток Müller глии и играют также роль в развитии Müller глии.

CKI белок p27^Kip1 обнаруживает две фазы экспрессии в сетчатке мышей, указывая тем самым на его участие более чем в одной стадии развития глаз. Ранняя фаза экспрессии p27^Kip1 обнаруживается в ранних постмитотических клетках сетчатки, когда они выходят из клеточного цикла, это согласуется с его ролью в регуляции выхода из клеточного цикла предшествеников сетчатки и указывает на то, что избыточной экспрессии p27^Kip1 в клетках предшественниках сетчатки в кульуредостаточно для обеспечения выхода из клеточного цикла, даже в присутствии митогена. Однако, помимо ранней фазы экспрессии обнаруживается сохранение экспрессии p27^Kip1 в дифференцирующейся Müller глие зрелой сетчатки мыши. Это указывает на то, что p27^Kip1 м. регулировать некоторые аспекты зрелого фенотипа этих клеток.

REGULATION OF REACTIVE GLIOSIS OF MÜLLER CELLS

Целенаправленное разрушение p27^Kip1 у мышей обусловливает увеличение пролиферации и мульти-органную гиперплазию, включая эффекты и на ЦНС. Нокаутные p27^Kip1 мыши обнаруживают также фенотип дисплазии сетчатки, который обусловлен изменениями Müller глии скорее, чем генерализованными эффектами на пролиферацию предшественников. Установлено, что временное окно, во время которого клетки сетчатки пролиферируют увеличено у p27^Kip1 нокаутных мышей, но p27^Kip1 необязателен для выходя из клеточного цикла предшественников сетчатки. Однако, у p27^Kip1 нокаутных мышей Müller глия дизорганизована, пролиферирует за пределами обычного временного промежуткагенеза Müller клеток и экспрессирует glial fibrillary acidic protein (GFAP), который обычно экспрессируется в этих клетках в ответ на острый стресс или повреждение сетчатки. Выявлено 10-20 кратная индукция GFAP-иммунореактивности Müller глиальных клеток у p27Kip1 нокаутных мышей. Реактивная Müller глия разрушает наружную ограничивающую мембрану сетчатки и вызывает смещение тел фоторецепторных клеток и Müller глии в область обычно содержащую наружные сегменты, тем самым приводя к фенотипу ретинальной дисплазии.

Чтобы показать, что фенотип ретинальной дисплазии обусловлен активацией Müller глиальных клеток, индуцировали реактивный глиоз в сетчатке с помощью ouabain. Выявили драматическое увеличение количества GFAP-позитивных Müller клеток, сопровождаемое подавлением p27^Kip1 и активацией пролиферации этих клеток. Кроме того, индукции реактивного глиоза оказалось достаточно, чтобы вызвать разрушение наружной ограничивающей мембраны, что вело к ретинальной дисплазии, сходной с той, что наблюдалась у p27^Kip1 нокаутных мышей. Для объяснения, почему реактивные Müller глиальные клетки не продолжают беспрепятственно пролиферировать в отсутствие функции p27^Kip1, было установлено, что происходит подавление позитивного регулятора клеточного цикла cyclin D3 в течение 24 ч. после активации реактивного глиоза. В клоне олигодендроцитов зрительного нерва финальный арест роста in vivo обнаруживает сходство и связан со специфическим подавлением уровня cyclin E. Т.обр., регуляция уровней циклинов м.б. важным компенсаторным механизмом, который м. гарантировать, что контроль клеточного цикла не очень сильно зависит от активности CKI белков, таких как p27^Kip1. p27^Kip1, т.обр., по-видимому. играет роль в регуляции инициации реактивного глиоза в сетчатке, возможно за счет контроля повторного вступления Müller глиальных клеток в клеточный цикл. Остается вопрос, насколько важно повторное вступление в клеточный цикл для инициации реактивного глиального фенотипа и не играет ли p27^Kip1 более непосредственную роль в регуляции реактивного фенотипа Müller глии.

REGULATION OF MÜLLER GLIAL DIFFERENTIATION BY CYCLIN DEPENDENT KINASE INHIBITORS

Не выявлено эффектов на соотношение дифференцированных типов клеток в сетчатке p27^Kip1 нокаутных мышей, это указывает на то. что p27^Kip1у мышей не играет роли в нормальном гистогенезе сетчатки. Сходные результаты полученны на Xenopus с использованием p27^Xic1. Этот белок член Cip/Kip семейства CKIs, который обнаруживает гомологию и с Cip1 и Kip1 и также экспрессируется в клетках сетчатки, когда они начинают дифференцировку. На поздних стадиях, экспрессия p27^Xic1 в зрелых клетках центральной сетчатки снижается, но персистирует на краях, где ретинальный гистогенез продолжается а течсение всей жизни животных. Было показано, что избыточная экспрессия p27^Xic1 в предшественниках сетчатки у Xenopus вызывает драматическое увеличение представительства Müller глии вместо биполярных клеток. Происходит арест очень раннего клеточного цикла в ответ на избыточную экспрессию p27^Xic1, это согласуется с тем, что наблюдается при избыточной экспрессии p27^Kip1. Однако, одного ареста клеточного цикла недостаточно для индукции образования Müller глии, т.к. обработка hydroxyurea или избыточная экспрессия доминантно-негативных форм Cdk2 и cdc2 не индуцируют Müller глии. Эти результаты подтвержают, что that p27^Xic1 играет инструктивную роль в развитии клеток Müller глии (Рис. 1).

C помощью делеционного анализа p27^Xic1 белка удалось установить, что способность p27Xic1 способствовать дифференцировке Müller глиальных клеток отделима от CDK ингибирующей активности белка. Область на N-конце p27^Xic1, известная как CDK/cyclin-связывающая область, необходима для обеих функций, хотя короткий участок из пяти аминокислот необходим для индуцирующей активности Müller клеток, но не для CDK ингибирующей активности. CDK/cyclin связывающая область законсервирована у всех членов Cip/Kip сверхсемейства CKIs, это согласуется с обнаружением, что у млекопитающих p27^Kip1 и p21^Cip1 также способствуют активности Müller глии, когда экспрессируются избыточно. Мутантная форма p21^Cip1, которая обладает пониженной способностью ингибировать ход клеточного цикла, все еще способна эффективно способствовать дифференцировке клетокMüller глии. Следовательно, p27^Xic1 и родственные молекулы м. регулировать генез Müller глии во время нормального развития и что эта функция независит от клеточный цикл регулирующей активности CKIs. Механизм, лежащий в основе этой способности способстовать дифференцировке клеток Müller глии, неясен. Коэкспрессия cyclin A2 и Cdk2 с p27^Kip1 ингибирует его активность, способствующую Müller глие, за счет связывания p27^Kip1 и титрации его или стерического блокирования его домена, индуцирующего Müller глиальные клетки. Т.к. очень небольшая область p27^Xic1 белка специфически отвечает за его способность обеспечивать дифференцировку Müller глиальных клеток, то должна быть стратовая точка для следования потенциалу взаимодействующих компонентов. Избыточная экспрессия p27^Xic1 в сетчатке грызунов м. вызывать некоторое увеличение генеза Müller глиальных клеток в обмен на биполярные клетки, сходное с тем, что обнаруживается у Xenopus. Однако, тот же самый эффект не обнаруживается с p27^Kip1.

Необходим ли p27^Xic1 для нормального генеза Müller глиальных клеток в сетчатке Xenopus? Снижение эндогенной экспрессии p27^Xic1 в разивающейся сетчатке с помощью антисмысловой конструкции приводит к 50% снижению глии у p27^Kip1 нокаутных мышей, но глия скорее всего становится аномально реактивной. p27^Xic1 у Xenopus и p27^Kip1 мыши не являются прямыми гомологами, поэтому хотя активность p27^Xic1 и м.б. необходимой для генеза Müller глиальных клеток in vivo, это м.б. неверным для p27^Kip1. Эта функция м. выполняться др. родственной молекулой у мышей. Это подтверждается наблюдением, что p27^Xic1, но не p27^Kip1, м. способстовать дифференцировке Müller глиальных клеток в сетчатке грызунов. Имеются также отличия в основных механизмах, используемых для генерации Müller глии, у амфибий и грызунов. Возможно также, что компенсаторные механизмы вструпают в игру у p27^Kip1 нокаутных мышей. гарантируя генерацию нормального количества Müller глии. Т.к. экспрессия антисмысловых конструкций в сетчатке Xenopus затрагивает только небольшой набор клеток, то сходные компенсаторные механизмы м. не вступать в действие. Открывается также возможность, что у Xenopus антисмысловые эксперименты с глией м. присутствовать, но они просто аномально реактивны и избегают идентификации с помощью критериев ламинарной позиции и морфологии.

Важной функцией CKIs является реакция на внеклеточные сигналы, чтобы регулировать ход клеточного цикла. Интересно бы рассмотреть возможность того, что этот класс белков м. также интегрировать информацию от внешних сигналов, чтобы регулировать генез Müller глиальных клеток. Несколько внешних сигнальных путей влияют на генез Müller глии. Так, активация Notch пути м. способствовать дифференцировке Müller глиальныхы клеток. Notch м. дейстовать синергично с p27^Xic1 в регуляции дифференцировки Müller глии. Пока не установлено, м. ли др. внеклеточные сигнальные пути также действовать синергично с CDK ингибитором белков для регуляции дифференцировки Müller глии. Единственный кандидат на эту роль - это EGFR сигнальный путь. Усиление передачи сигналов за счет избыточной экспрессии EGFR в клетках предшественниках ретины увеличивает пропорцию клеток, которые дифференцируются в Müller глию. Следовательно, передача сигналов через EGFR м. оказывать дифференциальные эффекты на CDK ингибитор белков, такой как p27^Kip1, чтобы регулировать или пролиферацию или дифференцировку Müller глиальных клеток. Высокие уровни передачи сигналов EGFR в предшественниках сетчатки не всегда способствуют Müller глиальному фенотипу. Мкорее всего такой исход зависит от стадии развития и окружающей среды, в которой находятся предшественники. Следовательно, др. еще неидентифицированные сигнальные пути дю. иметь важное значение в регуляции Müller глиального фенотипа.

TВсе это указывает на то, что CDK ингибиторные белки м. регулировать пролиферацию Müller глиальных клеток во время реактивного глиоза в сетчатке, а также генез Müller глиальных клеток во время развития. Интересно было бы рассмотреть возможность того, что CDK ингибирующие белки регулируют также реактивный глиоз и в др. частях нервной системы.

Becoming glial in the neural retina Kathryn B. Moore, Monica L. Vetter (Monica.Vetter@hsc.utah.edu) Developmental Dynamics Volume 221, Issue 2, 2001. Pages:146-153,

Becoming glial in the neural retina
Kathryn B. Moore, Monica L. Vetter (Monica.Vetter@hsc.utah.edu)
Developmental Dynamics Volume 221, Issue 2, 2001. Pages:146-153,