ER | UDP

Во всех эукариотических клетках одними из наиболее важных пострансляционных модификаций белков является ковалентное добавление углеводов. Такие гликопротеины представляют собой многочисленный класс молекул, которые обнаруживаются в клеточных мембранах, особенно в плазматических мембранах и во внеклеточных секретах, таких как плазма, Углеводная половинка или олигосахарид ответственны за множество важных физикохимических свойств белков и играют роль в межклеточном распознавании, оплодотворении и развитии. Изменения олигосахаридов гликопротеина наблюдаются при некоторых патологических состояниях у человека, включая рак, ревматоидные артриты и воспаление. См. также: Proteins: postsynthetic modification; Glycosylation and disease; Cell surface glycoconjugates

Types of Glycoproteins and their Occurrence

Известны два основных типа ковалентных добавок олигосахаридов. Они затрагивают модификацию аминокислотных боковых цепочек: N-гликозилирование аминогрупп аспарагина и O-гликозилирование гидроксильных групп серина или треонина (Рис. 1). N-сцепленные олигосахариды м.б. далее подразделены на три больших класса; сложный тип, содержащий N-acetylglucosamine, маннозу, галактозу, фукозу и сиаловую кислоту; oligomannose тип, содержащий N-acetylglucosamine и только маннозу и гибридный тип, который обладает свойсвами, общими как комплексным, так и олигоманнозным цепочкам (Рис. 2). Большинство гликопротеинов содержит и N- и O-сцепленные олигосахариды и содержит более одной олигосахаридной цепочки на молекулу. Не каждый аспарагин или серин и треонин оккупируются углеводами. N-сцепленное гликозилирование нуждается в распознающем мотиве, триплете Asn-X-Ser(Thr), где X остатком м. б. любая аминокислота за исключением пролина. Потребность в O-сцепленном гликозилировании менее рестриктивна и не существует консенсусных последовательностей, индентифицируемых анализом гликопротеинов. Как N- так и O-сцепленные олигосахариды представлены сходными моносахаридами, которые м.б. сцеплены вместе для образования сходных последовательностей (Рис. 2 и 3). См. также: Proteins: fundamental chemical properties

Glycoforms

природа и вариабельность сцепления и последовательностей моносахаридов в глдикопротеинах создает структурную гетерогенность. Хотя аминокислотные последовательности белков остаются неизменными, популяция олигосахаридных структур изменчива. Индивидуальная белковая молекула м. нести уникальный набор олигосахаридных структур и этот субнабор из популяции называется гликоформой (glycoform) (Rademacher et al., 1988). Белки, которые состоят из нескольких N- и O-сцепленных олигосахаридов м. иметь несколько гликоформ; те, которые содержат только N-сцепленные олигосахариды м. иметь несколько меньше. Напр., human immunodeficiency virus (HIV) gp120, который содержит 20–25 потенциальных N-сцепленных сайтов, имеет свыше 100 разных олигосахаридных структур, тогда как ribonuclease B, которая имеет один N-сцепленный сайт, имеет соответственно меньше (~5) разных структур. Генерация гликоформ еще более осложнена клеточно- и ткане-специфическим гликозилированием, так что потенциальное число генерируемых гликоформ м.б. чрезвычайно большим. Имеет ли это функциональное значение для активностей, ассоциированых с гликопротеинами? Известно из анализа ribonuclease (RNAase) B и immunoglobulin G, что присутствие олигосахарида м. влиять на динамику стабильности белка и способствовать стабилизации трехмерных структур (Dwek, 1996). Наиболее убедительные доказательства функции гликоформ получены в исследовании естественно возникших вариантов гликозилирования tissue plasminogen activator и plasminogen. В этих гликопротеинах занятие вариабельных мест гликозилирования влияет на четвертичную ассоциацию энзима и субстрата и влияет на гидролиз (Dwek, 1996). Эту информацию оказалось возможным получить, используя аккуратные методы анализа гликопротеинов, и это позволило разработать компьютероное моделирование динамики олигосахаридных молекул в растворе. Комбинирование рентгеновских кристаллографических данных по белкам и трехмерных структур и перемещения олигосахаридов сделало картину более ясной как в целом выглядят гликопротеины (Woods et al., 1994; Dwek, 1995). Олигосахаридная часть гликопротеина занимает довольно большое пространство и поэтому неудивительно, что тип или присутствие олигосахаридов м. создавать пространственные конфликты с белком. Следовательно, олигосахариды м маскировать белковые домены и предупреждать ассоциацию их с др. белками, напр., влиять на событие соедирнения энзима с субстратом. Генерация гетерогенной популяции гликопротеинов м.б. одним из путей, с помощью которых клетка контролирует биологическую активность. См. также: Monosaccharides; Protein stability; Plasminogen activation system; Enzyme activity: control; Substrate binding to enzymes

N-Linked Glycans: Structure and Biosynthesis

Oligosaccharide transfer, trimming and protein folding in the endoplasmic reticulum

N-сцепленное гликозилирование белков инициируется с переноса Glc3Man9GlcNAc2 олигосахарида с dolichol липидной промежуточной структуры на формируемую пептидную цепь в просвете endoplasmic reticulum (ER) (Рис. 4). Сравнение белков, как полагалось, участвующих в переносе олигосахаридов в дрожжевых и животных клетках, выявило высокую степень организационной консервации, это указывает на тесные временные и пространственные взаимоотношения между синтезом, транслокацией и N-гликозилированием полипептида. Существенны субъединицы oligosaccharyltransferase, которая переносит олигосахарид с dolichol липида на возникающий белок, они являются членами очень большого комплекса белков, состоящего из конституитивных рибосомальных белков, таких как ribophorin. Реакционный механизм oligosaccharyltransferase еще полностью не установлен, но некоторые данные указывают на то, что мотив ‘Asx-turn’ позволяет carbonyl остатку аспарагина взаимодействовать с threonine/serine NH и hydroxyl, чтобы обеспечить его protonation (присоединение протона). Относительная важность глюкозы как части олигосахарида в ассистировании или в переносе сигналов является видо-специфичной. В клетках млекопитающих только те гликаны, которые содержат остатки глюкозы, переносятся на белок, даже в мутантных клеточных линиях, которые синтезируют укороченные Glc3Man5GlcNAc2 олигосахариды. Распознавание и соединение наружного плеча глюкозного остатка, как полагают, индуцирует конформационные изменения в активном сайте oligosaccharyltransferase, влияя на ассоциацию постоянного пептидного субстрата. Неспособность trypanosomatid protozoa синтезировать dolichol-P-голюкозу не предупреждает гликозилирования, но ведет к переносу неглюкозилированных олигосахаридов. У этого паразита отсутствуют обнаружимые количества α-glucosidase I, но α-glucosidase II необходима для участия в chaperone-обусловленном пути reglucosylation. См. также: Cell structure; Plant endoplasmic reticulum

Получено подтверждение дополнительной роли активности glucosidase II в ER. Сеачала в работе группы Parodi’s было показано, что постоянно активная uridine diphosphate (UDP)-glucose:glycoprotein glucosyltransferase присутствует в микросомах, полученных от ряда разных видов, включая растения, насекомые, трипаносоматиды, грибы и животные (Parodi, 1996). Эта glucosyltransferase присутствует в виде растворимого энзима в просвете ER, она была выделена до кажущейся гомогенности из микросом печени крыс и делящихся дрожжей Schizosaccharomyces pombe. Способность временно реглюкозилировать только денатурированный гликопротеины указывает на то, что in vivo, только расправленные, частично упакованные или неправильно упакованные гликопротеины реглюкозилируются и что прохождение этой ступени предупреждается принятием корректной конформации – процессом, который прячет белковые детерминанты (возможно гидрофобные аимнокислоты) от glucosyltransferase.

Второй механизм, который участвует во временных взаимодействиях вновь синтезированных гликопротеинов в ER, нуждается в молекулярных хаперонах (chaperons), которые облегчают складывание и сбору субъединиц возникающих белков. Эти взаимодействия, особенно с интегральными белками мембран, таких как calnexin или растворимый calreticulin, гарантируют, что только правильно сложенные и собранные белки будут экспортироваться из ER. Calnexin обнаруживает значительную специфичность к гликопротеинам, несущим N-сцепленные олигосахариды, т.к. tunicamycin предупреждает образование glycoprotein–calnexin комплексов, а предварительная обработка ингибиторами α-glucosidase, castanospermine и deoxynojirimycin, также блокирует эти взаимодействия. Calnexin, как было показано, обладает lectin-подобной способностью связывать monoglucosylated олигосахариды в качестве инициальной ступени. Это подтвержюает, что распознавание неупакованных областей вновь синтезированных белков или трансмембранных областей связанных с мембранами белков, также необходимо для взаимодействий calnexin, которые предупреждают преждевременный экспорт неполностью упакованных белков из ER. См. также: Protein folding in vivo; Membrane proteins; Lectins

Модель (Helenius, 1994) показывает, как эти два куска, кажущиеся чужеродными, м.б. вовлечены в создание общего, эволюционно законсервированного механизма по сохранению интегральности белок-упаковывающих путей у всех эукариот. Вновь синтезированные белки гликозилируются и первый ?2-сцепленный остаток глюкозы удаляется с помощью α-glucosidase I. Быстрое удаление (период полу-жизни ~5 мин) экспозированной α3-сцепленной глюкозы с помощью α-glucosidase II, создает моноглюкозилированный олигосахарид, который распознается также α-glucosidase II (гидролиз этой глюкозы происходит значительно медленнее) и calnexin. Если происходит перенос на calnexin посредством сигнала распознавания и др. межбелковых взаимодействий, то скомплексованный гликопротеин вовлекается в перемещение достаточно долго, так что м. предположить возникновение правильно уложенной конформации. Обычный маршрут, осуществляемый упакованными белками, диссоциация комплекса, удаление α3-глюкозы с помощью α-glucosidase II и обязательный экспорт из клетки. В частично упакованных белках, которые диссоциируют от calnexin прежде чем будет достигнуто правильно упакованное состояние, или те, на которые действуют glucosidases слишком быстро до взаимодействия с calnexin, олигосахариды reglucosylated и цикл событий повторяется. Если белки необратимо испорчены неправильной упаковкой, то к циклу повторного глюкозилирования добавляется связывание с calnexin и реакции deglucosylation. Механизм предупреждает формирование белковых агрегатов до тех пор, пока не произойдет их исключение из ER в лизосомы. См. также: Protein folding: overview of pathways; Lysosomal degradation of proteins; Protein export from endoplasmic reticulum to the cytosol: methods

Эта модель и в частности распознавание совершенного процессинга промежуточных олигосахаридов с помощью calnexin, как полагают, объясняет эволюционное значение способа en bloc гликозилирования, который возник у ранних эукариот. Вовлечение α-glucosidase II являктся кардинальным для успешности такого качества контрольного механизма, т.к. энзим должен действовать три раза и в трех местах во время цикла deglucosylation и reglucosylation. Выяснение с помощью nuclear magnetic resonance (NMR) структуры глюкозилированного N-гликана позволило смоделировать и предсказать посредством чего calnexin и α-glucosidase II приближаются к своему общему субстрату к разным сторонам молекулы. Это объясняет, почему α-glucosidase II м. гидролизовать проксимальный остаток глюкозы от олигосахарида, чтобы обеспечить высвобождение гликопротеина из комплекса.

Правильно упакованный гликопротеин, теперь содержащий укороченный олигосахарид, переносится с помощью везикулярного транспорта из ER в аппарат Гольджи. См. также: Endoplasmic reticulum to Golgi transport: methods

Oligosaccharide processing in the Golgi complex

Процессинг олигосахарида с помощью glycosidases осуществляется посредством ранних элементов комплекса Гольджи после удаления одиночного mannose остатка в ER. Удаление трех др. остатков маннозы с помощью Golgi α-mannosidase I формирует изомер Man5GlcNAc2. После действия N-acetylglucosaminyltransferase I (GlcNAcT-I), два терминальных остатка маннозы вырезаются с помощью Golgi α-mannosidase II.

Имеется endo-α-mannosidase в аппарате Гольджи, которая действует, чтобы deglucosylate частично уложенные или неполностью собранные олигосахариды (Рис. 4). Это объясняет отсутствие полного ингибирования процессинга при использовании ингибиторов α-glucosidase I и объясняет вклад в формирование комплекса glycan в клетках, дефицитных по glucosidase. Большинство клеток млекопитающих содержит некоторые определяемые активности endomannosidase, но анализ in vitro не выявляет активности в экстрактах дрожжевых клеток, activity in yeast cell extracts, mung проростках фасоли и клетках Drosophila cells.

Медиальная часть аппарата Гольджи является клеточным местом действия для большинства glycosyltransferases, которые обеспечивают разветвленные паттерны N-гликанов в клетках эукариот. Это происходит в данном компартменте и в поздних trans элементах Гольджи, в которых glycosyltransferase энзимы регулируют синтез разных структур, обнаруживаемых у эукариот. Следовательно, видо-специфическое гликозилирование м. зависеть от присутствия или отсутствия гена и/или его ткане-специфической регуляции. Разные типы N-гликанов обнаруживаются у эукариотических видов. См. также: Plant Golgi apparatus

Species-specific N-glycosylation

Prokaryotic glycosylation

N-гликозилирование белков не является модификацией, характерной только для эукариот: идентифицирован ряд видов бактерий, которые способны гликрзилировать белки. Полная химическая структурная характеристика поверхностного слоя (S-layer) гликопротеина из Halobacterium halobium, крайнего halophile из archaebacteria, выявила присутствие глюкозы в β сцеплении с остатком аспарагина, как часть Asn-X-Ser/Thr. Этот класс бактерий располагает также на клеточной поверхности повторяющимися единицами сульфатированных сахаридов, сходных по композиции с гликозаминогликанами эукариот. Эта структура вместе с N-glucosyl единицами, компенсирует отсутствие peptidoglycan, типичного для клеточных стенок eubacteria. Модификация β-GlcAsn не ограничена archaebacteria и идентифицирована на laminin, выделенном их опухолей мыши. Имеется ли новый путь N-гликозилирования, общий и archaebacteria и млекопитающим, который используется независимо от β-GlcNAcAsn гликозилирования? Недавний филогенетический анализ показал, что archaebacterial транскрипционный фактор, TATA-binding protein (TBP), имеет свыше 40% гомологичных последовательностей с белком человека и способен взаимодействовать с белками человека, чтобы регулировать транскрипцию. Эти данные указывают на то, что транскрипционный аппарат м. возникнуть из общего клона, который уже стал более разнообразным от eubacteria (all other prokaryotes). Archaea м. обладать общим родоначальным клоном с эукариотами, это объясняет новые данные по N-гликозилированию. См. также: Bacterial cells; Archaeal cells; Halophiles; Glycosaminoglycans: structure and biological functions

Eukaryotic glycosylation

Фундаментальной характеристикой эукариот является присутствие связанных с мембранами компартментов и путей мембранного транспорта, в которых аппарат Гольджи играет центральную роль в процессинге и секреции гликопротеинов. Паразитический protozoan Giardia lamblia, примитивный эукариот не нуждается в обнаружимом комплексе Гольджи, чтобы секретировать простые негликозилированные белки, но индукция и ферментативных активностей Гольджи и структур Гольджи происходит во время encystation of trophozoites. Т.к. ribosomal ribonucleic acid (RNA) паразита обладает многими общими гомологичными последовательностями с прокариотами, чем с др. эукариотами, то и сейчас он м. онтогенетически регулировать биогенез биосинтетически компетентных комплексов, сходных по морфологии с высшими эукариотами, поэтому данный вид м. представлять собой эволюционный ‘мостик’ между прокариотами и эукариотами. Способность паразитировать на вновь возникающих формах жизни м. оказать селективное давление, необходимое для модификации одиночных генных продуктов у этого уникального организма.

Yeast glycosylation

Анализ структурных свойств N-гликанов из ряда эукариотических видов выявило Гольджи-обусловленные glycosyltransferase-зависимые изменения. Дрожжевые гликаны являются обычно oligomannosidic типа и заканчиваются добавочной маннозной цепочкой, чтобы сформировать гомологичное семейство с Man9–14GlcNAc2 основой. Некоторые подверглись более сильному процессингу за счет добавления наружной цепочки, состоящей из α1,6-сцепленного маннозного остова с α1,2- и α1,3-сцепленными боковыми цепочками, каждая из которых м. состоять из 50–200 остатков. Вывод из этого исследования такой, что дрожжи д. иметь разнообразные базовые сердцевины (core) олигоманнзных структур в результате действия дополнительных и часто уникальных наборов action glycosyltransferases. Чтобы синтезировать более сложные mannans, напр., д. использоваться 10–12 mannosyltransferases (Gemmill and Trimble, 1999). См. также: Gene expression in yeast

Insect glycosylation

Большинство гликопротеинов, проанализированных в тканях насекомых, напр., в культивируемых клетках mosquito и lepidopteran и лисинок Drosophila, являются oligomannosidic типа. Fucosylation наиболее внутренних остатков GlcNAc наблюдается в гликопротеинах, происходящих из Drosophila и Apis (медоносной пчелы), в последнем случае они часто bifucosylated в α1,3- и α1,6-сцеплениях. Использование клеток lepidopteran линий для экспрессии гетерологичных белков с использованием baculovirus векторов вызывало дальнейший интерес к событиям гликозилирования в клетках насекомых. Используя in vitro glycosyltransferase метод, было измерено присутствие активностей GlcNAc-transferase I и II в экстратах из клеток lepidopteran (Altmann, 1996). Некоторые доказательства демонстрируют онтогенетически регулируемую экспрессию sialylated белков у эмбрионов Drosophila, но ?2,8-сцепление сиаловой кислоты для подтверждения углеводной структуры этих белков не получено.

Protozoan parasite glycosylation

Сиаловая кислота инкорпорируется в гликопротеины trypanosomatid protozoan, но не посредством sialyltransferase (т.к. эти паразиты неспособны синтезировать cytidine monophosphate (CMP)-сиаловую кислоту из N-acetylmannosamine), а посредством экспрессирующихся на поверхности trans-sialidase. Помимо сиаловой кислоты найдены complex-типа N-сцепленные гликаны, которые также содержат некоторые ?l,3-сцепленные остатки галактозы и разветвленных polylactosamine. В дополнение к complex-типа гликанам обнаружены oligomannose структуры, сходные с таковыми у позвоночных и беспозвоночных, описаны и необычные galactofuranose, rhamnose, ribose и xylose моносахаридные замены. Сложные жизненные циклы паразитов, особенно тех, которые имеют хозяевами и млекопитающих и насекомых, характеризуются рядом биохимических процессов, из которых N-гликозилирование является хрошим примером, который является уникальным. См. также: Trypanosoma

Не все паразиты остро нуждаются в N-гликозилировании во время своего жизненного цикла. Бесполая внутриэритроцитарная стадия малярийного паразита Plasmodium falciparum не обнаруживает видимых включений радиомеченных предшественников в N-сцепленные гликопротеины и не обнаруживает активности oligosaccharyltransferase. Паразит, по-видимому, синтезирует O-сцепленные гликаны и не известно происходит ли гликозилирование на др. стадиях жизненного цикла, напр., на половой стадии жизненного цикла. См.также: Plasmodium

Plant glycosylation

В отличие от клеток животных у растений не возникает жестких пространственных взаимоотношений между ER и сосденими цистернами Гольджи. Эта совершенно иная организация внутренних мембран отражает высокую пропорцию, до 80%, синтетической производительности аппарата Гольджи, которая связана со сборкой сложных полисахаридов, уникальной функцией Гольджи у растений. Вакуолярные и клеточной поверхности гликопротеины гликозилируются с помощью механизмов, сходных с теми, что описаны для др. эукариотических клеток, что ведет к к продукции и oligomannose и complex-типа N-гликанов. Изучение некоторых растительных лектинов и др. белков подтвердило отсутствие сиаловой кислоты в комплексных типах и присутствие стержневых α1,3-сцепленных остатков фукозы и α1,2-сцепленной xylose с α-mannose остатком. Остатки α1,2-сцепленной xylose в N-гликанах, по-видимому, увеличивают иммуногенность белков, к которым они прикреплены. Антитела, полученные против этого эпитопа обнаруживают общий антигеннный детерминант растений и у ряда видов Mollusca и Insecta. См.также: Plant endoplasmic reticulum; Plant Golgi apparatus; Lectins

Other lower eukaryotes

Частое использование рекомбинантных baculoviruses для экспрессии гетерологических белков в клетках lepidopteran (Sf9) в терапевтических целях и для структурных и функциональных исследований увеличило осведомленность о гликозилировании в клетках насекомых. Некоторые данные доступны о N-гликозилировании и у др. беспозвоночных. N-гликаны, участвующие в супрамолекулярных структурах, формируемых annelid Perineresis aibuhitensis, как было показано, содержат mannose, fucose, galactose и амино-сахара; однако, нет доступных структурных данных. C-реактивные белки от horseshoe crab, Limulus polyphemus (Arthropoda taxa), являются исключительно oligomannose типа. Олигосахариды клеточной поверхности плесни Dictyostelium discoideum, как полагают, играют роль в формировании клеточных агрегатов и, как было показано, регулируются онтогенетически. Олигосахариды. выделенные из этих являются в основном олигоманнозного типа, они содержат рнебольшие количества сульфатированных и фосфорилированных остатков, несущих заряды, но но сиаловой кислоты не обнаружено. Показано присутствие α1,2-сцепленной ксилозы в N-сцепленных олигосахаридах от D. discoideum и это м. объяснить антигенность гликопротеинов слизистой плесни. См.также: Baculovirus expression system; Antigens: carbohydrates

Существуют прекрасные доказательства α1,2-xylosylation N-гликанов помимо, напр., благодаря анализу гликопротеинов соединительной ткани улиток Lymnaea stagnalis.

Mammalian complex N-linked glycosylation

Действие GlcNAc-трансферазы I и II в medial Гольджи служит сигналом для процессинга комплексных гликопротинов с помощью glycosyltransferases в trans элементах Гольджи у млекопитающих и птиц (Рис. 4). Действие α- и β-galactosyltransferases, α-fucosyltransferases, β-N-acetylgalactosaminyltransferases и α-sialyltransferases ответственно за генерацию разнообразия структуры N-гликанов у этих видов. Хотя каждая glycosyltransferase катализирует синтез одиночного glycosidic сцепления (за исключением некоторых fucosyltransferases), некоторые отдельные энзимы способны синтезировать одно и то же сцепление. Каждый из клонированных генов glycosyltransferase или complementary deoxyribonucleic acids (cDNAs) предсказывают существование общей типа II трансмембранной топологии, заключающейся в коротком N-терминальном цитоплазматическом домене, одиночной трансмембранной области и большом С-терминальном каталитическом домене. Усилиями молекулярного клонирования выявлены существнно отличающиеся семейства glycosyltransferase, которые имеют that have значительную гомологию на уровне первичных аминокислот, но являются неродственными членами разных семейств, указывая на независимую эволюцию. Члены семейства часто включают glycosyltransferases из довольно удаленных видов, так выявлено сходство растительной и человеческой GlcNAc-transferase I. Члены семейства α1,3-fucosyltransferase обладают значительным количеством сходных последовательностей. Семейство sialyltransferaseсодержит более 12 членов, каждый обладает разной акцепторной специфичностью и первичными последовательностями having different acceptor specificities and primary sequence, помимо короткой пептидной области в 48–49 аминокислот имеется ‘sialyl motif’, sugar nucleotide-связывающая область. Как эти transferase участвуют в создании разнообразия струкуры олигосахаридов, которые появляются в природе и прекрасно законсервированы? Glycosyltransferases обладают одной и той же топограйической и структурной организацией, но это сходство не отражается на геномном уровне, так как нет общих паттернов интрон-экзонной структуры между генами transferase. Не все glycosyltransferases возникли в результате перемещений экзон-кодируемых доменов. Напр., fucosyltransferases имеют родиночную экзонную кодирующую последовательность, тогда как galactosyltransferase и sialyltransferase гены являются мультиэкзонными. Адаптации организмов к созданию дивергентных олигосахаридов, которые удовлетворяют потребности в более разумном способе межклеточных взаимодействий, м.б. движущей силой для удвоений генов и/или перемещений экзонов. Родоначальный ген, содержащий области, кодирующие каталитический домен, м.б. использованы несколько раз для создания ряда отдельных генов glycosyltransferase, чему существуют экспериментальные подтверждения. Структурная и функциональная организация каталитической области нуждается в анализе с помощью регтгеновской кристаллографии до того как будут сделаны эволюционные корреляции. См.также: Multigene families: evolution; Protein coding segments: evolution of exon-intron gene structure; Evolutionary developmental biology: gene duplication, divergence and co-option

O-Linked Glycans: Structure and Biosynthesis

Вторая модификация является ковалентным прикреплением гидроаксильной группы C1 N-acetylgalactosamine к α-гидроксильной группе остатков серина или треонина, чтобы сформировать O-сцепленные гликаны (Рис. 1).

O-гликаны обладают или простым структурным дизайном, включая тот, что обычно находят в большинстве гликопротеинов, сожержащих N-сцепленные гликаны или те, что имеют олигосахаридные цепочки столь же сложные как N-гликаны, такие как GlyCAM-1, ассоциированный с эндотелием лиганд для L-selectin и нейтрофильный лиганд для P-selectin (Рис. 3). Mucins, основное составляющее слизистых секретов, являются довольно большими молекулами, содержащими 50–80% углеводов по весу, здесь олигосахариды обеспечивают в большей степени физикохимические свойства муциновых гликопротеинов. К сожалению, в настоящее время недостаточно данных для привязки ‘informational’ свойств к определенным углеводным последовательностям, в первую очередь из-за трудностей получения однозначной структурнрой информации. См.также: Cell surface glycoconjugates

O-linked glycoprotein biosynthesis

В отличие от котрансляционных добавок en bloc синтезируемых олигосахаридов к аспарагиновым остаткам, модификации по сериновым и треониновым аминокислотам являются событиями, которые нуждаются в последовательном действии нескольких различных glycosyltransferases. Следовательно, не до конца упакованные glycosidases не играют роли в контроле биосинтеза и дальнейшем использовании каждого гликана, что определяется конкурентными силами между трансферазами за общие акцепторные сайты, т.к. белок мигрирует по секреторному пути в клетке. В дополнение, по-видимому, не существует консенсуса аминокислотных последовательностей, чтобы управляли первым событием, добавлением N-acetylgalactosamine к серину и треонину с помощью UDP-N-acetylgalactosamine:polypeptide N-acetylgalactosaminyl transferase. Это происходит несмотря на попыткаи определить потенциальные последовательности путем анализа аминокислотных остатков, фланкирующих гликозилируемые серины или треонины, или путем сравнений in vitro скорости гликозилирования акцепторов, используя ряд определенных пептидов и очищенных трансфераз.

Обобщая эти исследования по поиску мотивов гликозилирования за счет идентификации фланкирующих областей вокруг изсестных сайтов присоединения, м. говорить о отдельных ‘правилах’ для гликозилирования серина и треонина. Недавние попытки создать искусственные нейральные сети и взвешенные матричные алгоритмы, чтобы определить точное позиционирование serine- и threonine-сцепленных GalNAc остатков, исходя из первичных аминокислотных последователностей, предсказали существование определенных предполагаемых мотивов и увеличили шансы исполнения предсказаний. Напротив, прямой анализ изменений в сайте связывания энзима, который специфицируется совершенно др. аминокислотными последовательностями, м. позволить решить эту проблему. кДНК для UDP-GalNAc:polypeptide N-acetylgalactosaminidase была клонирована как из телячьего кишечника, так и коровьей плаценты, а сравнение показало полную структурную идентичность последовательностей более чем из 519 аминокислот, кодирующей растворимую форму энзима. Рекомбинантная форма этой transferase сохраняет 58-кратное предпочтение к гликозилированию треонина in vitro, хотя нельзя исключить возможность, что тот же самый энзим гликозилирует остатки серина и треонина in vivo на этой стадии. Т.к. O-связи возникают, чтобы сформировать кластеры на N-концах большинства гликопротеинов, и имеют повышенное предпочтение к solvent-exposed β виткам, то специфичность трансфераз м.б. опредлена с помощью аминокислотных последовательностей, которые способны принимать вид exposed β витка.

Дальнейшее исследование муцинового типа O-гликанов м.б. лучше всего описано за счет изучения их структурного содержимого. Простейшие гликаны содержат serine- или threonine-замещенные N-acetylgalactosamine, затем идут те, что содержат два моносахарида, напр., Galβl,3GalNAc, и те, которые содержат три или более. Гликаны последнего класса содержит структурные свойства, которые указывают на их принадлежность к отдельным группам или ‘core’ гликанам, из которых описаны 8 (Van den Steen et al., 1998).

Элонгация этих ‘core’ последовательностей за счет структуры остова, из которых обычно обнаруживаются 5, которые являются чрезвычайно различающимися, а количество точек разветвления делает определение полной структуры большинства больших цепей гликанов трудным. Понимание, как гликозилирование контролируется клетками, до сих пор остается целью, которая трудно достижима. Субклеточный сайт по инициации O-гликозилирования является, по-видимому, белок-, видо- и ткане-специфичным, кроме того имеют место пострансляционные события, происходят внутри гладкого мембранного комплекса. Созревание гликана в поздних элементах аппарата Гольджи д. скорее всего зависеть от средовых усовий и от набора glycosyltransferases, которые конкурируют за акцепторные субстраты. Многие из кДНК для трансфераз, участвующих в биосинтезе, были клонированы, включая те, которые синтезируют антигены групп крови, и их изучение безусловно усилит наше понимание контрольных механизмов для синтеза этого комплексного класса гликанов. См.также: Antigens

Species-specific O-glycosylation

Др. виды также способны к O-glycosidically присоедирнению углеводных половиное к серину и треонину. У высших растений основной модификацией сериновых остаков лектинов и белков клеточной стенки является добавление galactose, а лектины томатов несут дальнешую модификацию hydroxyproline остатков арабинозой. Хотя считалось, что эти широко распространенные у растений модификации не идентифицируются у видов животных, однако hydroxyprolines оказалисть связанными с коллагенами. Сходным образом добавление xylose к O-glycosidic связи с треонином в slime cap корней кукурузы и у красных водорослей напоминает инициальную ступень glycanation при синтезе протеогликанов. См.также: Plant cell wall biosynthesis

Дрожжевые и грибковые клетки O-гликозилируют остатки серина и треонина с марннозой, процесс, который иницируется в ER посредством двух, возможно трех, mannosyltransferases, которые используют dolicholphosphomannose в качестве донора сахара. Дополнительные остатки маннозы добавляются или в ER или в Гольджи, чтобы сформировать гликан, который структурно очень отличен от тех, что обнаруживаются у высших эукариот. См.также: Fungal physiology

Значительно меньше известно о O-сцепленном гликозилировании в клетках беспозвоночных. Анализ гликопротеинов в культивируемых клетках насекомых показывает, что они синтезируют преимущественно одиночные Ser/Thr-сцепленные GalNAc остатки, лишь немногие из них замещены на галактозу и никогда не замещаются на сиаловую кислоту. Этот тип укороченных структур аналогичен структуре N-гликана, найденного в этих клетках, и представляет собой продукт ограниченного биосинтеза.

Other O-linked glycans

Не только O-сцепленный N-acetylgalactosamine имеет модификации сериновых и треониновых остатков, но и ряд белков с повторяющимися epidermal growth factor (EGF) мотивами содержат fucose и xylose–glucose единицы прикрепленные сходным образом. Установлено, что активность ряда ядерных и цитоплазматических белков критически регулируется приобретением одного или боеее O-сцепленных остатков, в частности N-acetylglucosamine (Hayes and Hart, 1994). Присутствие столь немногих углеводных остатков достаточно ли для модулирования функции белков? Сравненивая величины энергии, затрачиваемой клетками на декорирование белков сложными, высоко разветвленными типами гликанов, возникает вопрос, почему эти биосинтетические пути законсервированы, если сходная функция м.б. осуществлена значительно меньшим пулом клеточных энзимов? Указаниями на стратегии, адоптируемые клетками, является компартментализованность функции белков. Полупроницаемые барьеры, которые отделяют все клетки от наружной среды заняты белками, чьи функциональные половинки помещаются так, чтобы взаимодействовать как с внутренними, так и внешними условиями. Большинство N-гликозилированных белков располагается на внеклеточной поверхности или секретируется во внеклеточное пространство. Лучшими способами для однозначного анализа олигосахаридных модификаций являются индентификации некоторых располагающихся внутри клеток белков, которые N-гликозилируются, включая и те, что из ER (α-glucosidase II, напр.), и из ядерных мембран и лизосом. Очень немногие имеют цитоплазматическое происхождение в отличие от большинства O-GlcNAc-модифицированных белков. Это потому, что они д. иметь разные функции? O-GlcNAc модификации сравнимы с фосфорилированием, крупным внутриклеточным событием, по своему повсеместному участию в регуляции определенных функций белков.

Analysis of Glycoprotein Oligosaccharides

SDS-PAGE analysis of glycoproteins

Простым и доступным методом анализа гликопротеинов является sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). М. б. использованы методы химической детекции для углеводных половинок, такие как periodate oxidation и детекция in situ с помощью Schiff реагента. Использование более чувствительных репортерных молекул, таких как digoxigenin-hydrazide или biotin-hydrazide, позволяют колорметрическую детекцию гликопротеинов в nanogram (fmol). См.также: Gel electrophoresis: one-dimensional

Вклад углеводов в массу полипептидной цепи м.б. оценен после deglycosylation с использованием trifluoromethanesulfonic кислоты. Эта процедура эффективно отщепляет N- и O-прикрепленные олигосахариды, делая белок интакным. Селективное отщепление N-прикрепленных олигосахаридов производится с помощью endoglycosidases, таких как peptide-N4-(N-acetyl-α-glucosaminyl)asparagine amidase (PNGase), или endo-?-N-acetylglucosaminidase, вызывающих недеструктивное отщепление олигосахаридов от большинства гликопротеинов. Подсчеты массы полипептидов с помощью SDS-PAGE до и после deglycosylation позволяюьт определить количество N-прикрепленных цепочек олигосахаридов. К сожалению, мало комерчески доступных энзимов, способных отщеплять все O-прикрепленные олигосахариды от белков.

Лектины, растительные и животные белки, которые способны привязывать сахара специфически или к терминальным остаткам или как часть расширенных последовательностей, м. выявлять олигосахаридные цепочки гликопротеинов с помощью Western blotting. Эта техника м. идентифицировать тип и даже части гликановых последовательностей в N- и O-сцепленных гликопротеинах.

Analysis of oligosaccharides isolated from proteins

Glycan release and labelling

Для дальнейшего вычленения типов моносахаридных сцеплений и количества олигосахаридных структур необходимо выделение интактных олигосахаридов, сопровождая это качественным анализом. Существует два метода выделения гликанов: химическое отщепление с использованием anhydrous hydrazine; и выделение с помощью endoglycosidase. Терминальный N-acetylhexosamine остаток м.б. мечен с помощью reductive методов, использующих или sodium borotritiide для введения радиоактивной группы или флюоресцентные молекулы, такие как 2-aminobenzamide, которые дают более чувствительные репортерные группы для детекции (Dwek, 1996).

Fractionation of oligosaccharides

High-performance liquid chromatography (HPLC) для анализа олигосахаридов увеличивает разрешающую способность в смесях и время элюции м. оказаться прогностическим для гликановой структуры (Rudd and Dwek, 1997). Используя комбинацию методов хроматографического разделения, таких как hydrophilicity и charge, м.б. проанализированы полные профили структур, присутствующих в гликопротеинах. См.также: Liquid chromatography

Physical methods of analysis

Методы ионизации и детекции с помощью масс-спектрометрии нуждаются в относительно небольших количествах материала (ниже pmol). Техника matrix-assisted laser desorption, связанная с облучением выборок вместе с ultraviolet light-absorbing matrix, сопровождаемой mass separation ионов позволяет определять только значения масс, но не дает информации о сцеплениях, несмотря на то, что вносится некоторая фрагментация гликанов. Анализ олигосахаридов в растворах с помощью electrospray mass spectrometry имеет преимущества в том, что он обеспечивает прямое купирование с HPLC liquid phase chromatographic разделением. См.также: Mass spectrometry in biology

NMR анализ обычно нуждается в больших количествах свободных олигосахаридов, чтобы подтвердить идентичность структуры и сцепления, но делает это более однозначно и недеструктивно на µmol уровне.

Enzymatic methods

Структурная характеристика олигосахаридов м.б. осуществлена с использованием glycosidases, группы гидролитических энзимов, широко распространенных в природе.

Структурные исследования с помощью последовательного переваривания с помощью exoglycosidase базируется на известной специфичности и чистоте glycosidase-catalysed гидролиза (Jacob and Scudder, 1994). Exoglycosidases обычно каталитически специфичны к моносахаридам, которые отщеплены, и к их anomeric конфигурациям; напр., β-galactosidase гидролизует только гликаны, содержащие терминальные β-galactose остатки, а α-fucosidase те, которые содержат терминальные α-fucose остатки. Соединенное с анализом продуктов реакции после переваривания олигосахаридов при неизмененых концах, HPLC или mass spectrometry м. выявить общую структуру (Dwek, 1996; Rudd and Dwek, 1997).

Originally published: March 2001

GlycoproteinsTerry D Butters University of Oxford, Oxford, UKEncyclopedia of Life Science doi:10.1038/npg.els.0000705

Glycoproteins
Terry D Butters
University of Oxford, Oxford, UK
Encyclopedia of Life Science doi:10.1038/npg.els.0000705