The Golgi apparatus at the cell centre Current Opinion in Cell Biol. 2003. V. 15. P. 60-66 | |
|
Рис. 1 | Three-dimensional reconstruction of a part of the Golgi ribbon, revealing in situ physical relationships between the cis-most cisterne and MTs. (a) MTs (green) closely follow and occasionally form contacts with the membranes of the cis-most cisternae (blue). Note that in the modelled region, MTs do not exhibit a typical radial organisation. Bar = 500nm. (b) A higher-magnification view oriented to show that the paths of some MTs closely follow the membranes over considerable distances. MTs traversing the Goldgi stack can be also observed.
| |
){kind=link}
Микротрубочки (МТ) облегчат пути переноса мембран, соединяя различные органелы, которые используют массивы поляризованных МТ чтобы достичь определенного субклеточного положения. Среди мембранных органелл аппарат Гольджи (АГ) в клетках млекопитающих является особенным не только своей субклеточной локализацией в центре клетки, но и как единственная органелла, зависящая от МТ. Общепринято, что АГ находится в динамическом равновесии с эндоплазматическим ретикулемом (ЭР). Груз, покидающий ЭР, избирательно упаковывается в пре-Гольджи транспортные промежуточные образования, которые затем транслоцируются вдоль МТ в направлении центросом с помощью моторов, направлющих груз к минус концам. Эти пре-Гольджи элементы, как полагают, являются прямыми предшественниками АГ, сливаясь они генерируют первую Гольджи цистерну, которая согласно наиболее распространенной модели, затем созревает из цис (вступительной, т.е. ближайшей к ЭР) в транс (выводящую, exit) форму. Следовательно, биогенез АГ должен происходить около центросом. Одновременно образуются и др. мембранные трубочки и пузырьки и Гольджи цистерн и транпортируются обратно в ЭР. Если эти пути мембранного переноса прерваны, то структура органелы нарушается, подтверждая, что поддержание одиночного центрального АГ нуждается в соотв. балансе путей мембранного притока и оттока. Молекулярные моторы выступают здесь в качестве главных актеров в поддержании организации и положения АГ.
Structural Association of the Golgi apparatus and Mictotubules
Недавно с помощью замораживания под высоким давлением, freeze-substitution и электронной томографии изучали трехмерную структуру АГ и огружающих органелл. Это позволило авт. смоделировать индивидуальные МТ и проанализировать из in situ взаимоотношения с органеллами в Гольджи области. Организация МТ в этой области была сходной с таковой в интерфазных эпителиальных клеткиах, МТ, по-видимому, не росли из центросом. Взаимодействия между Гольджи стеками (stacks) и МТ обнаруживались преимущественно на цис стороне (Рис. 1а). Пути индивидуальных МТ, по-видимому, в точности следовали мембранам первой цистерны (на рассотоянии примерно 30 нм) и случайно контактировали с ней. Кроме того МТ проходили через Гольджи стеки посредством отверстий в цистернах во многих местах (Рис. 1b). Медиальная и транс цистерны не обнаруживали ассоциации с МТ. Это указывает на специфическую роль МТ на цис стороне АГ, где образуются новые цистерны. Созревание цис и транс цистерн д. , следовательно, сопровождаться релокализацией активностей, связывающих МТ, ассоциированных с цис-Гольджи мембранами, или за счет рециклинга мембран или за счет ассоцииации/диссоциации из цитоплазматического пула.
В соответствии с этими находками как моторные, так и не-моторные МТ-связывающие белки накапливались преимущественно на цис стороне АГ. GMAP-210, белок периферических мембран, который ведет себя подобно Гольджи матричным белкам в ответ на действие brefeldin A (BFA), агента, разрушающего АГ. Он обеспечивает взаимодействия между Гольджи мембранами и и стабильными МТ и соединяется с МТ посредством своего С=терминального домена, обнаруживающего предпочтение к минус концам МТ. Его избыточная экспрессия вызывает потерю МТ звездочек и образование плотной сети из коротких МТ, которые ко-локализуются с АГ, указывая тем самым на закрепляющую и стабилизирующую МТ активность данного белка. В условиях избыточной экспрессии GMAP-210 мембранный транспорт из АГ блокируется и нарушается серьезно морфология и размеры АГ. Следовательно, этот белок участвет в биогенезе АГ вокруг центросом.
Hook белки являются МТ-связывающими белками, которые как полагают, соединяют мембранные органеллы Гольджи с МТ. Hook3, как полагают, играет играет роль в локализации АГ рядом с центросомами. Hook3 обнаруживает зависимую от клеточного цикла локализацию, а во время интерфазы он в основном обнаруживается в juxtanuclear положении вблизи центросом. Эта локализация зависит от МТ и в основном не чувствительна к BFA. Dj время профазы Hook3 накапливается на митотических полюсах. Фракция Hook3 ассоциирует с цис-Гольджи мембранами и перераспределяется по периферическим сайтам после воздействия BFA. Кроме того, избыточная экспрессия Hook3 индуцирует фрагментацию и дисперсию АГ.
Получены тажк доказательства специфической ассоциации между МТ и некоторыми тубуловезикулярными элементами, классифицируемыми как 'endo-lysosomal compartments'. Более того, было установлено, что новый цитоплазматический линкерный белок (cytoplasmic linker protein (CLIP)) из семейства CLIP-170, CLIPR-59, ассоциирует с мембранами trans-Golgi network (TGN) и, как полагают, играет роль в динамике TGN-эндосомы.
Др. интересным аспектом являются взаимотношения между АГ и субпопуляцией стабильных МТ, которые богаты детирозинированным тубулином. Большинство стабильных МТ, которые часто выглядят короткими, конволютированными и их концы редко простираются до периферии клетки, концентрируются вокруг центросом. Морфология АГ в точности соответствует этим стабильным МТ и vice versa - некоторые из этих МТ выглядят так, как будто оба их конца закрплены на АГ. Т.о., в то время как динамические МТ участвуют в ранних стадиях транспорта Гольджи мембран, направленного к минус концам, стабильные МТ м. участвовать в поддержании и локализации структуры АГ. Стабилизация МТ м.б. достигнута за счет ассоциации МТ-ассоциированных белков или захвата МТ плюс концов. Хотя непосредсвенное участие документально не подтверждено, однако, CLIP-ассоциированные белки CLASPs являются хорошими кандидатами, чтобы стабилизировать субнабор МТ, участвующих в организации АГ. Во время избыточной экспрессии CLASPs обнаруживают МТ-стабилизирующий эффект и увеличивают количество детирозинированных МТ. Имеется существенный ассоциированный с Гольджи пул CLASPs, а CLASP2 направляется в мембраны Гольджи с помощью fatty acylation двух цистеиновых остатков его первых 14 аминокислотах.
The Golgi Apparatus and Minus-end-anchoring Activities
Центросомы считаются уникальным местом как для зарождения (nucleation) МТ (т.е. образования новых МТ), так и организации МТ, т.к. вновь формируемые МТ остаются тесно связанными с околоцентриолярным материалом. С этой точки зрения АГ выглядит как лента (ribbon), расположенная вблизи МТ-звездочек. Становится очевидным, что активность центросом более сложна и динамична. Большинство клеток постоянно высвобождает МТ из центросом, которые затем закрепляются на центросомных и не-центросомных сайтах. Сборка и органзация не-центросомных МТ также имеет мемто. Механизмы нуклеации и закрепления МТ в не-центросомных сайтах изучены плохо. Степень высвобождения МТ из центросом зависит от типа соматических клеток и коррелирует с концентрацией МТ-закрепляющих активностей на центросоме. С некоторыми вариациями морфология АГ в неполяризованных клетках, по-видмому, коррелирует с теми же самыми факторами. На одном конце спекта лимфоидные клетки, у которых все МТ закреплены на центросомах и у которых сферический АГ окружает центросомы. Фибробласты, с хорошо сфокусированными МТ-звездочками, несмотря на определенный уровень активности по высвобожденияю МТ, имеют перицентросомный АГ, который распространяется в виде juxtanuclear организации. Наконец, неполяризованные эпителиальные клетки часто имеют АГ, окружающий ядерную оболочку.
Такие интимные взаимоотношения между АГ и МТ-закрепляющей активностью выявляются также и при обработке клеток таксолом или во время дифференцировки клеток. В лимфобластах, обработанных таксолом, стабильные МТ остаются закрепленными на центросомах, а локализация Гольджи не меняется. Напротив, в фибробластах и эпителиальных клетках воздействие таксола понуждает стабильные МТ формировать пучки в дали от центросом. Большинство пучков приобретает закрепляющие белки и др. центросомные белки на одном из концов. В этих условиях элементы АГ также ассоциирут с этими концами пучков МТ.
Во время миогенеза и АГ и центросомы драматически реорганизауются. Компактынй
juxtanuclear АГ кажется диспергированным на элементы, которые образуют поясок вокруг каждого из ядер мышечной трубочки , который простирается и между ядрами. Это перераспределение сопровождается сходной реорганизацией МТ, сайтов нуклеации МТ и центросомных белков,таких как pericentrin. На живых клетках продемонстрировано, что после реорганизации и ЭР выходные (exit) сайты и элементы Гольджи оказываются вблизи центров нуклеации МТ, а значит вблизи минус концов МТ.
γ-Tubulin ring complexes
Механизмы, связанные с поддержанием ассоциации между АГ и МТ минус концами, неясны. Возможно, что МТ-nucleating/закрепляющие активности м.б. ассоциированы с АГ. Эти активности м. служить для предопределения центральной локализации АГ в клетке и вносить вклад в образование специализированного субклеточного домена. Наиболее охарактеризованными якорями МТ минус концов являются γ-тубулиновые кольцевые комплексы (γ-TuRCs), которые помимо своей роли в нуклеации МТ действуют и как шапочки МТ минус концов. Фракция цитозольного γ-тубулина обнаруживается в ассоциации с очищенными мембранами Гольджи. Часть мембран Гольджи нуклеирует (nucleate) МТ. Эта активность нуждается в ассоциированных на периферии Гольджи белках, особенно в γ-тубулине. Установлена ко-локализация nocodazole (NZ)-индуцированных элементов Гольджи и коротких, стабильных МТ, которые появляютя на периферии клеток после отмывки NZ в печеночных клетках. Указывает ли это совместное распределение на нуклеацию МТ с помощью элементов Гольджи или на рост коротких стабильных фрагментов, и участвует ли γ-тубулин в этом процессе in vivo, неизвестно. Хорошим кандидатом на эту МТ-nucleating и стабилизирующую активность АГ является GMAP-210, который способен рекрутировать γ-тубулин-содержащие комплексы к мембранам Гольджи.
Dynactin
Др. белковым комплексом, предположительно играющим роль в закреплении минус концов МТ на центросоме, является динактин. Этот большой мультисубъединичный комплекс, как полагают, функционирует как адаптор или рецептор цитоплазматического динеина с грузом и необходим для базирующейся на динеине подвижности in vitro и in vivo. Динактин состоит из двух структурных доменов: актин-подобной опоры (backbone), отвечающей за присоединение груза; и проецирующегося бокового плеча, содержащего р150Glued, dynamitin и р24 субъединицы, которые взаимодействуют с цитоплазматическим динеином, а также с МТ. В интерфазных центросомах, динактин, по-видимому, действует независимо от динеина, а МТ-связывающая активность его р150Glued субъединицы необходима для поддержания центросомно сфокусированных звездочек. Нуклеация МТ с помощью динеин-динактиновых комплеексов участвует также в организации радиального расположения МТ в отсутствие центросом во фрагментах меланофор. На АГ диактин, как полагают, способствует установке (docking) мотора динеина под загурзку. Однако, пертурбации в структуре динактина блокируют самые ранние события биогенеза Гольджи. Imaging живых трансфицированных клеток показал, что
р150Glued направляется к плюс концам растущих МТ, где он м. играть новую роль на ранних стадиях мембранного транспорта в направлении к минус концам. Охарактеризован белок, взаимодействующий с dynamitin, Bicaudal D2 (BICD2), который ко-локализуется с dynactin и на АГ и на МТ плюс концах.
Однако, следует отметить, что динактин локализуется преимущественно тем, где концентрируются минус концы и что р150Glued способен связывать МТ по всех их длине и индуцировать образование МТ-пучков при средних и высоких уровнях экспрессии. Кроме того белки, такие как XMAP215, впервые выявленный в яйцевых экстрактах Xenopus благодаря способности стимулировать скорость роста МТ на плюс концах. Играет ли динактин роль в закреплении и стабилзации МТ на поверхности мембран Гольджи, до конца неясно.
AKAP450
Имеются доказательства, что протеин киназа А (РКА) типа II м.б. важной для стабилизации минус концов МТ, которые происходят из центросом. РКА II направляется в область Гольджи/центросома благодаря взаимодействию своей регуляторной субъединицы с pericentrin и AKAP450 (известного также как CG-NAP или AKAP350). AKAP450 является продуктом многократно спласируемого гена, который дает многочисленные изоформы большого белка, который обеспечивает поддержку многим энзимам, обычно протеин киназам и протеин фосфатазам. AKAP450 локализуется и в центросомах и АГ. Его локализация на центросомах независит от МТ, тогда как АГ разрушается при деполимеризации МТ или воздействии BFA. Подтверждено, что AKAP450, который является субстратом для РКА, играет роль в динамике МТ. N-терминальный домен AKAP450 взаимодействет с GCP2/GCP3 компонентами γ-тубулиновго кольцевого комплекса и м. обеспечивать сайты для нуклеации и закрепления МТ. Взаимодействие AKAP450 с членами семейства белков ТАСС (transforming acid coiled-coil-containing), взаимодействующих с центросомными МТ, подтвержает эту идею. Интересно, что р150, связывающийся с МТ, регулируется с помощью РКА фосфорилирования.
New Functions for the Pericentrosomal Location of the Golgi apparatus
Почему Гольджи мембраны закрепляютсяв околоцентриолярной области в клетках млекопитающих? Эта локализация рассматривается как оптимальная для радиальной транспортации транспортных промежуточных образований, происходящих из ЭР, в центральное положение вдоль МТ-звездочек. Однако, базирующаяся на МТ подвижность не является абсолютно необходимой для переноса белков. Как полагают, Мт облегчают перенос мембран на большие расстояния, тогда как перемещения мембран на короткие расстояния, напр., при рециклинге Гольджи или ЭР экспорте, является МТ-независимым процессом. Анализ распределния выходных сайтов ЭР показал, что хотя и присутствует повсюду ЭР сеть, многие из них расположены в околоядерной области, ближайшей к центросоме. Это распределение быстро модифицируется в отсутствие МТ. Когда выход из ЭР блокирован микроинъекциями или избыточной экспрессией доминантно-негативной мутации Sar1, то энзимы Гольджи перераспределяются в ЭР, тогда как Гольджи матричные белки накапливаются в структурах, которые как полагают, являются ЭР выходными сайтами. В этих условиях такие структуры, по-видимому, образуют кластеры вокрух центросомы. Более того, по время дифференцировки миобласт/мышечная трубка элементы Гольджи, ЭР выходные сайты и сайты МТ нуклеации реорганизуются и перемещаются вместе. Перицентросомная область поэтому выглядит как субклеточный домен, в котором концентрируются важные активности для функционирования цитоскелетной и секреторной систем. Предполгается, что радиальное расположение МТ, закрепленных в центросоме и их проекция к периферии клеток д. обеспечивать клеткам механизм, способный регулировать МТ цитоскелет за счет регуляции активности цетросом. Скопление системы ЭР/Гольджи вокруг центросомы д. служить сходной цели и д. облегчать контроль клеточных процессов в условиях, когда клеточная архитектура как целое подвергатеся ремоделировани. Это происходит во время миграции клеток, поляризации или дифференцировки. Величиа центросом и , следовательно, фокусирование МТ-звездочек сильно варьируют во премя локомоции клеток.
Растут доказательства. что область Гольджи/центросома играет также важную роль в некоторых физиологическ их процессах, таких как внутриклеточная перадача сигналов, митоз или апоптоз. Мнение, что как центросома, так и АГ действуют как сигнальные платформы, подтверждается идентификацией трансдукции разннобразных сигнальных молекул в этих органеллах. AKAP450 и myomegalin локализуются и в АГ и в центросоме, они обладаютс способностью связывать разные кинащы, фосфатазы и фосфодиэстеразы, которые участвуют в цАМФ- и Rho-зависимой передаче сигналов. Члены семейства Rho/Rac/Cdc42 также накапливаются в этой области и очевидно м. влиять не только на специфические функции АГ и центросомы, но и координировать поведение обеих органелл.
Идентификация ARAP (Arf-GTPase activating [GAP], Rho-GAP,ankyrin repeat and pleckstrin homology domains-containing) белков показала. что они являются компонентами сигнального пути, контролирующего движения клеток. ARAP1 локализуется в АГ и регулирует Arf-, Rho- и Cdc42-зависимые активности в клетках. Предполагается, что ARAP1 координирует ремоделирование мембран и актина, связанное с движениями клеток. Cdc42 регулирует также реориентацию области Гльджи/центросом в мигрирующих фибробластах и когда активирован поставляет эффекторную киназу РАК4 в мембраны Гольджи. РАК4 участвует также в регуляции морфологии и подвижности клеток. Интересно, что активность РАК4 участвует также в онкогенной трансформации, а обеспечиваемые Cdc42 клеточные функции, включая формирование филоподий, распластывание клеток и реориентацию АГ, ингибируются активацией или избыточной экспрессией белка опухолевог супрессора р53.
Установлено также, что центросома участвует также в контроле КПП (checkpoint) клетоного цикла и в контроле хода клеточного цикла. Фрагментация и дисперсия АГ является обязательным условием для вступления в митоз в клетках млекопитающих. Подтверждается, что околоцентриолярная организация АГ является сенсором для контроля за вступлением в митоз. И АГ и центросома м. также инициировать апоптоз с помощью специфических стрессовых сенсоров и связаны с апопто-модулирующими сигналами в покоящихся клетках.
Имеющиеся данные подтверждают идею, что Гольджи/центросома м. служить в клетках в качества центальной контрольно-пропускной (checking) станции статуса цитоплазматических органелл пред каждым важным решением в жизненном цикле.