COORDINATING EARLY KIDNEY DEVELOPMENT: LESSONS FROM GENE TARGETING
Seppo Vainio & Yanfeng Lin Nature Reviews Genetics 3, 533 -543 (2002)
Перевод Л.М. Константиновой
Почка широко используется в изучении механизмов органогенеза. В её развитие вовлечены такие фундаментальные процессы, как специализация эпителиальных клеток, индуцированный морфогенез и клеточная дифференцировка - общие для развития многих других органов. Эксперименты с генами-мишенями (gene-targetting) значительно расширили наши представления о ходе развития почки, а также выявили многие важные гены, регулирующие ранний почечный органогенез, некоторые из которых играют роль в образовании наследственных дефектов почек. Хотя наше понимание того, как образуется почка, все ещё ограничено, эти исследования начинают обеспечивать понимание генетических и клеточных взаимодействий, которые регулируют ранний органогенез.
(Рис.1.) | Морфологические стадии раннего почечного развития и некоторые из генов, вовлечённых в его развитие
а) Почка мыши начинает развиваться, когда зачаток мочеточника формируется в каудальном конце Вольфова канала (WD) на 10.5 день развития мыши. Мочеточниковый зачаток превращается в метанефрическую мезенхиму (MM) и
в) стимулирует (индуцирует) мезенхиму, которая является смежной с концами зачатка мочеточника (UB), уплотняя и формируя мезенхимную зону стромы.
c) Уплотненная мезенхима индуцирует разветвление мочеточникового зачатка, начиная с 11.5 дня.
d) В связи с морфогенезом и разветвлением мочеточников, мезенхииные клетки образуются в каждой области эпителиального конца и подвергаются эпителио-мезенхимному преобразованию, формируя функциональную единицу почки - нефрон.
e) Нефрон формируется, проходя через подобную запятой и S-образную стадии развития. S-образный тяж соединяется с ветвью мочеточникового древа, которое продолжает соединяться в систему собирающих протоков. ЭНДОТЕЛИАЛЬНЫЕ КЛЕТКИ мигрируют в собирающий нефрон, формируя клубочек (гломерулу).
Окрашенные области нарисованы не в масштабе.
(Рис.2.) | Модель генетических взаимодействий в течение раннего почечного развития
Данные получены на knockout-мышах. Регулируя Gdnf (вторичный нейротрофический фактор глиальных клеточных линий), Pax2 (ген 2 из бокса парности) может вносить вклад в инициирование почечного развития. Хотя Pax2 и Wt1 (ген 1 опухоли Вильмса) взаимодействуют друг с другом, Gdnf всё ещё экспрессируется у мутантов по гену Wt1, указывая, что Wt1 может регулировать некоторые другие важные сигналы/гены, внося вклад в раннее развитие почек. Eya1 (Ген 1 отсутствия глаз) мог бы также регулировать Gdnf, чтобы внести в индукцию или развитие мочеточникового зачатка посредством Ret (протоонкоген) активированный сигнальный путь, принимая во внимание, что Foxc1 мог бы отрицательно регулировать Eya1 и влиять на точку начала развитие почки. Sall1 (сорее-подобный ген 1) экспрессируется в мезенхиме, но потеря Sall1 косвенно нарушает развитие и зачатка мочеточника. Поэтому Sall1 может действовать раньше мочеточникового Emx2 (ген 2 пустых дыхательных отверстий) и влиять на эпителиальную передачу сигналов через Wnt 6. Эти взаимодействия гипотетические и основаны на результатах экспрессии in vivo и knockout-мутантах мыши; только в нескольких случаях подтверждённых биохимически 9, 10, 12, 25, 26.
Зелёный текст обозначает факторы транскрипции; черный текст, факторы роста или их рецепторы.
(Рис.3.) | Экспрессия маркерного гена в течение раннего развития почек
a) На 11.5 день эмбрионального развития, Gfra1(вырабатываемый линией глиальных клеток нейротрофического фактора рецептор-альфа 1) экпрессируется в зачатке мочеточника и слабо - в мезенхиме.
b) По контрасту, Wnt11 (связанный с отсутствием крыльев MMTV сайт интеграции 11) экспрессируется на 11.5 день на концах зачатка мочеточника, который разветвился только один раз.
c) В течение последующего ветвления, Wnt11 поддерживается на концах разветвления мочеточникового зачатка (15.5 дней).
d) Pax2 (ген 2 бокса парности) экспрессируется в Вольфовом канале, мочеточниковом зачатке и в нефрогенной мезенхиме, которая является смежной с указанным зачатком в возрасте 11.5 дней, принимая во внимание, что
e) Wnt4 (показанный синим цветом) экспрессируется в претубулярной агрегатах клеток.
Зачаток мочеточника визуализировался путём его иммуноокрашивания антителами против Troma-1 (коричневый цвет).
f) Нефрогенные клетки, которые экспрессируют Pax2 и Wnt4 также экспрессируют и выделяемый спирально-связанный белок (sFrp2; возраст - 14.5 дней), а также генерируют нефроны.
(Рис.4.) | Гепаран-сульфатные протеогликаны клеточной поверхности
Почка - один из главных выделительных и гомеостатических органов тела. Она выполняет две существенные функции: выделяет большинство конечных продуктов обмена веществ (удаляет их из крови, продуцируя мочу); а также регулирует концентрацию некоторых компонентов жидкостей тела, таких как соль и мочевая кислота, управляя их выделением и реабсорбцией. Почка служила моделью развития в течение более, чем 40 лет, отчасти благодаря простоте, с которой она может развиваться и изучаться в культуре (1; см. BOX 1). Эта система органов полезна при исследовании многих из фундаментальных вопросов биологии развития, таких как специализация эпителиальных клеток, индуктивно-тканевые взаимодействия, дифференцировка, поляризация клеток, трансформация мезенхимы в эпителиальную ткань и формирование паттерна. Как и в случае многих других органов, развитие почки регулируется последовательными и реципрокными индуктивно-тканевыми взаимодействиями. Одна из целей исследования развития почки - выявление сигналов, которые определяют эти взаимодействия, и то, как они функционируют и координируют экспрессию регуляторных молекул: факторов транскрипции, рецепторов, а также механизма функционирования внеклеточного матрикса (ECM) - что позволяет создать комплексную структуру органа.
Органогенез включает в себя многие клеточные процессы, такие как клеточная пролиферация, адгезия клеток, апоптоз, дифференцировка клеток, изменения формы клеток и клеточной миграции - для каждого из которых требуются молекулы из различных классов и семейств. В последние годы при изучении потомков мутантов мышей были обнаружены многие существенные для контроля развития гены, которые управляют совокупностью органов, в частности и таких, как почка. Изучение почки увеличило наше понимание механизмов специализации эпителиальных клеток и взаимных индуктивных взаимодействий, которые существуют между различными типами клеток и тканей, а также того, какой вклад эти взаимодействия вносят на ранних этапах развития. Некоторые «почечные» мутанты мышей, оказались также полезными моделями для изучения наследственных болезней почек расстройств у человека (об этом см. ниже).
В предлагаемом обзоре мы обсуждаем, как генетические исследования привели к выявлению некоторых сигнальных каскадов, которые регулируют раннее развитие почек, и вовлечены ли центры передачи сигналов в координацию раннего органогенеза. Процессы образования / развития сосудов и иннервации не обсуждаются, поскольку наши представления об их регулирующей роли в раннем развитии почек всё ещё ограничены.
Морфогенез почек
Почка взрослого млекопитающего, т.н. метанефрос (вторичная почка), развивается из и мезенхимы метанефроса, которые оба происходят от . Прежде, чем вольфов канал даёт начало одной из ранних тканей метанефроса - зачатку мочеточника, он участвует в образовании двух переходных почкоподобных органов: пронефроса и мезонефроса. Метанефрическая почка начинает развиваться после того, как вольфов проток продлевается каудально по оси тела и продуцирует вырост, называемый зачатком мочеточника (рис. 1a).
Мочеточниковый зачаток представляет собой эпителиальную ткань, которая внедряется в на 10,5-11 день у мыши и 35-37 день у человека. После внедрения в мезенхимную ткань, этот зачаток стимулирует клетки мезенхимы, которые окружают его, чтобы уплотниться в форме шляпки из близко ассоциированных клеток в (рис. 1b). развивается на периферии этой мезенхимы, а также между ветвями мочеточника. Затем уплотнённые клетки мезенхимы стимулируют зачаток мочеточника к ветвлению и формированию двух новых мочеточниковых концов (рис. 1c), а сами начинают формировать претубулярные агрегаты, которые подвергаются эпителио-мезенхимному переходу, чтобы сформировать эпителиальную трубку.
Почечные трубочки развиваются в - выделительные единицы почки, посредством нескольких стадий развития (рис. 1 d, e). Сначала, трубочка имеет форму запятой, которая затем сменяется S-образной. S-образный тяж формирует (рис. 1e), а также проксимальный канал и дистальные каналы, которые присоединяются к мочеточниковому зачатку.
Средний отдел трубочки развивается в петлю Генле. Проксимальный канал и петля Генле - области почки, ответственные за реабсорбцию большинства необходимых молекул и солей из мочи, прежде чем они поступают в систему .
В течение процесса разветвления эпителиального зачатка мочеточника, каждый конец действует как индуктивный центр, инициирующий нефрогенез, образуя новые эпителиальные концы, после того, как ветвь удлинилась и обособилась. Ветви зачатка мочеточника, в конечном счёте, формируют систему протоков, которая собирает мочу в и мочевой пузырь. В ходе ветвления зачатка мочеточника, индукция трубочки многократно повторяется, чтобы произвести 12.000 нефронов в почке мыши и 500.000-1.000.000 нефронов в человеческой почке. У человека нефрогенез к моменту рождения завершается, а у крыс и мышей продолжается постнатально. Эндотелиальные клетки, которые внедряются в почку, инициируя её развитие, также развиваются из почечной мезенхимы, вносят вклад в формирование функционального нефрона 3 (рис.1e).
Мезенхимные сигналы, инициирующие органогенез
Неизвестно, инициирует ли мезенхима метанефроса органогенез, стимулируя формирование зачатка мочеточника, который затем внедряется в неё и начинает ветвиться. Или же инициирующие сигналы исходят от вольфова канала до отпочковывания зачатка мочеточника? Какие гены в первую очередь определяют метанефрическую почку, и какие секреторные сигналы инициируют почечный органогенез?
Мы хотели бы предложить свои соображения о последовательных взаимодействиях, которые координируют формирование зачатка мочеточника (Рис. 1,2). Ген-супрессор 1 опухоли Вильмса (Wt1), кодирует фактор транскрипции, который имеет несколько изоформ, играющих различные роли в формировании мочеполовой системы 4. Мутация гена WT1 у человека может привести к возникновению опухолей почек в детстве 5, а также и вызвать синдром WAGR (опухоль Вильмса / аниридия / аномалии МПС / умственная отсталость), Denys-Dash и Frasier синдромы, которые характеризуются аномалиями гонад и почек 6,7. Экспрессия WT1 сначала проявляется в уплотнении мезенхимных клеток. У мышей с угнетённым (knockout) Wt1 геном, мезенхима метанефроса формируется, но зачаток мочеточника не в состоянии развиваться из вольфова канала, и происходит образование метанефрической бластемы с последующим апоптозом, что приводит к полному отсутствию развития почки 8. Как фактор транскрипции, Wt1 может регулировать экспрессию секретируемых факторов, являющихся медиаторами мезенхимных сигналов, которые индуцируют формирование зачатка мочеточника. Wt1 может также регулировать способность мезенхимы метанефроса отвечать на индуктивные сигналы, получаемые от зачатка мочеточника. Амфирегулин, принадлежащий к семейству эпидермальных факторов роста (Egf)-секретируемых сигналов, был идентифицирован как прямая мишень для Wt1 при инициировании почечного развития, и отображает его экспрессию 9. Однако маловероятно, что амфирегулин является сигналом, который стимулирует отделение зачатка мочеточника, т. к. блокирование активности амфирегулина в культуре органа не предотвращает раннее развитие указанного зачатка 9. Вследствие этого механизм действия Wt1 при инициировании развития почки ещё предстоит выяснить.
ген Pax2 (ген 2 бокса парности) также регулируется Wt1, поскольку его экспрессия подавляется Wt1 in vitro 10. Однако экспрессия Pax2 (рис. 3) снижена у Wt1-мутантных эмбрионов в почечной мезенхиме, указывая, что эти гены взаимодействуют в инициировании почечного развития 11. Хотя взаимодействие между Wt1 и Pax2 в процессе инициирования развития почки всё ещё остаётся предметом исследования, недавнее свидетельство указывает, что Pax2 может также управлять инициированием морфогенеза почек, управляя экспрессией Gdnf (вырабатываемый линией глиальных клеток нейротрофический фактор). Gdnf кодирует фрагменты семейства преобразующих факторов роста (Tgf) - сигнальных молекул, которые играют важную роль в индукции зачатка мочеточника. Отсутствие Pax2 вызывает утрату экспрессии Gdnf в метанефрической мезенхиме, Pax2 также регулирует Gdnf транскрипцию in vitro 12. Функция Gdnf в индукции почки чётко установлена. Он экспрессируется в почечной мезенхиме до индукции зачатка мочеточника, и его утрата у мышей ведёт к отсутствию формирования зачатка. Таким образом, Gdnf является важным сигналом для индукции обособления зачатка мочеточника 13-15. Поскольку локальное действие Gdnf на одну из сторон вольфова протока in vitro индуцирует образование добавочных зачатков мочеточника, Gdnf достаточен для индукции формирования зачатка мочеточника, а позже - для регуляции его ветвления 16, 17. Однако, вероятно, что вместе с Gdnf в регуляцию формирования данного зачатка вовлечены и другие факторы, поскольку экспрессия Gdnf сохраняется, например, в лишённых Wt1 почках, где отсутствует обособление зачатка мочеточника 11, кроме того, Gdnf не стимулирует ветвление изолированного зачатка, культивируемого in vitro (см. ниже).
Экспрессия Gdnf в почечной мезенхиме, как полагают, регулируется геном Eya1, гомологом отсутствия глаз у дрозофилы (Eya), который кодирует другой фактор транскрипции гомеобоксного семейства генов. EYA1-мутации у человека лежат в основе бранхио-ото-ренального (BOR) синдрома 18, 19. Как и в случаях с Wt1, Pax2 и Gdnf-мутантами, зачаток мочеточника будет не в состоянии внедриться в почечную мезенхиму эмбриона мыши при отсутствии Eya1. Экспрессии Gdnf также нет в отсутствие Eya1, но Pax2 продолжает экспрессироваться в мезенхиме этих мутантных эмбрионов. Вследствие этого Eya1 может функционировать в мезенхимной сигнализации ранее Gdnf, но позже Pax2, регулируя инициирование развития почки 18.
Недавно было открыто воздействие гена Sall1 на раннее развитие почки 20. Sall1 - свойственный млекопитающим гомолог регион-специфического гомеозисного гена дрозофилы spalt (Sal1). Гетерозиготные SALL1-мутации у человека ведут к развитию синдрома Townes-Brocks - аутосомно-доминантного заболевания, которое характеризуется диспластичными ушными раковинами, преаксиальной полидактилией, заращением ануса, а также аномалиями почек и сердца. Sall1 экспрессируется в почечной мезенхиме, и его инактивация у мышей ведёт к неполному росту зачатка мочеточника и отсутствию формирования его канала. Интересно, что мезенхима у эмбрионов мышей с отсутствием данного гена (Sall1-null) может формировать каналы при индукции со стороны спинного мозга in vitro (см. BOX 1), т.е. дефект у особей с «отключённым» Sall1 наблюдается в зачатке мочеточника. Экспрессия Gdnf, Eya1 и Wt1 продолжается в мезенхиме Sall1-мутантов 20, указывая, что Sall1 находится «ниже» этих сигналов или возможно действует независимо от них.
Фактор транскрипции, принадлежащий к семейству вилкообразно-верхушечный / спирально-крылый Foxc1 (forkhead бокс C1) выражен в почечной мезенхиме и может определять местоположение формирования зачатка мочеточника на вольфовом канале 21. Данное предположение подтверждается тем, что в Foxc1-knockout-эмбрионах формируются двойные зачатки мочеточника и почки, причём особенности формирования определяются генотипом. Как полагают, Foxc1 выполняет свою функцию, подавляя Gdnf и Eya1 в передней части почечной мезенхимы 21.
Имеющиеся данные о раннем развитии почки, указывают, что в инициировании органогенеза участвует множество генов, которые не могли бы функционировать независимо друг от друга. Некоторые из них могут действовать, модулируя Gdnf, например (рис. 2; см. Таблицу 1). Интересно, что большинство факторов, известных на сегодняшний день как влияющие на инициирование почечного развития, являются факторами транскрипции, которые экспрессируются в мезенхиме метанефроса. Эти гены также могут играть роль в её обособлении от остальной части почечной мезенхимы. Для доказательства необходим более детальный анализ экспрессии у особей дикого типа и knockout-мутантов, а также путём создания особей со смешанными признаками, основываясь на характере их экспрессии. Мы всё ещё не знаем, какие сигналы инициируют почечное развитие, но локализация многих из этих рано действующих генов в мезенхиме указывает, что данная ткань может специализироваться первой и что мезенхиальный сигнал может стимулировать формирование зачатка мочеточника. Последующие генетические отборы у мышей, а возможно и других модельных организмов, должны идентифицировать сигналы, которые могут быть вовлечены в инициирование органогенеза почки.
Индукция мочеточников
Рост зачатка мочеточника начинается с локального утолщения вольфова протока (на 10.5 день развития у мыши), после чего зачаток вскоре внедряется в смежную мезенхиму метанефроса (рис.1). В течение последних лет in vivo были идентифицированы некоторые важные регуляторы роста мочеточника, хотя мы ещё не понимаем до конца, как регулируются удлинение и стадии ветвления зачатка и какие сигналы взаимодействуют при регуляции дифференцировки мезенхимы.
Инициирование зачатка мочеточника. Тирозин-киназный рецептор Ret, который при мутации может проявлять себя как онкогенный 22, экспрессируется в зачатке мочеточника и контролирует пролиферацию и ветвление зачатка мочеточника 23, 24. Факт, что Gdnf и Ret являются взаимно стимулирующими, а также то, что Gdnf-индукция развития мочеточникового зачатка является Ret-зависимой, а отсутствие и Ret, и Gdnf приводит к развитию фенотипически сходных почек 13-15, 24-26 - всё это свидетельствует, что локальная мезенхимная экспрессия Gdnf вносит вклад в индукцию зачатка мочеточника посредством передачи сигналов Ret. Ген, кодирующий ко-рецептор для Ret - Gfra1 (производный глиальной линии клеток нейротрофический рецептор фактора-альфа 1), также экспрессируется в зачатке мочеточника (Рис. 1,3), и его инактивация у мышей ведёт к появлению фенотипа, подобного наблюдаемому у мышей с «угнетёнными» Ret- и Gdnf- 27, что подтверждает его роль в передаче сигналов Gdnf. Недавние исследования показали, что две изоформы Ret: Ret9 и Ret51 - имеют различное действие in vivo; моноизоформные Ret51 мыши, у которых нет Ret9, имеют гиподисплазию почки и недостаточность кишечных ганглиев в толстом кишечнике 28. Ret-сигнализация в клетках Madine Derby почки собаки (MDCK), которые являются почечными эпителиальными клетками, ведёт к потере клеточной адгезии, увеличенной подвижности и миграции этих клеток к локальному источнику Gdnf29, возможно, посредством сигнала, обеспечиваемого фосфатидилинозитол3-киназой 30. Благодаря этому Ret9/Gfra1/Gdnf-система может инициировать развитие мочеточника, стимулируя рост зачатка мочеточника по направлению к мезенхимному источнику Gdnf с помощью механизма хемоаттракции.
Рост и разветвление зачатка мочеточника. Возможно, Ret/Gfra1/Gdnf-система координирует рост мочеточника с помощью других секретируемых факторов, среди которых плейотропин (Ptn), также известный как Hb-Gam 31 и морфогенетический костный белок 4 (Bmp4) 32. Ptn экспрессируется в почечной мезенхиме и может стимулировать ветвление изолированных зачатков мочеточника в культуре вместе с Gndf, свидетельствуя о том, что эти два фактора достаточны для ветвления мочеточника in vitro 31. Bmp4 экспрессируется в клетках мезенхимы, которые окружают вольфов проток и ствол мочеточника в месте, удобном для регуляции роста данного зачатка. Эмбрионы мыши с генотипом Bmp4+/- на фоне C57BL/6 бэк-граунда имеют целый ряд аномалий развития, включая дефекты почек, вызванные нарушением регуляции развития зачатка мочеточника, причём аномалии подобны врождённым аномалиям почки и мочевого тракта (CAKUT) у человека 32. В культуре органа, однако, Bmp4 регулирует гены, которые экспрессируются и в мочеточниковом зачатке, и в мезенхиме, включая Gdnf 32, 33. In vivo Bmp4-регуляция развития мочеточника на стадии ветвления может быть более сложной, чем первоначально предполагалось.
Существуют ли другие факторы, регулирующие мочеточниковый рост и разветвление в процессе развития почки? Полученные in vitro и in vivo данные показали, что ECM-ассоциированные белки и белки поверхности клетки, такие как протеогликаны (PGs), также вовлечены в этот процесс. PGs выполняют много функций, в том числе: участие в передаче сигналов фактора роста и ECM-взаимодействие 34, 35. PGs состоят из ядерного протеина и сульфированных (GAG) боковых цепей. PGs клеточной поверхности, такие как синдеканы и глипиканы, и энзимы, регулирующие биосинтез (HS), принимают участие в передаче сигналов фактора роста фибробластов (Fgfs) и являются частью факторов семейства Wnt/Wingless (Wg) 34, 35 (рис. 4). Например, у дрозофилы потеря dally, кодирующего поверхность ячейки PG и являющегося гомологом PG млекопитающих (глипикана), генерирует фенотипы, которые напоминают потерю Wg-активности. Было обнаружено, что dally действует как ко-рецептор для Wg-преобразующего спирального рецептора 34.
При удалении или изменении в почке GAG цепей PGs in vitro c помощью химических реагентов, модифицирующих синтез, зачаток мочеточника приостанавливает рост и ветвление 36. Эти преобразования могут также вызывать полную реверсию действия Bmp4: от подавления роста зачатка мочеточника к стимулированию его ветвления, что указывает, на возможность для PGs контролировать специфический тип ответа на факторы роста.
Косвенное доказательство роли PGs в регуляции почечного развития получено на мутантах мыши, генерируемых gene trapping. У этих мутантов ген, кодирующий гепаран-сульфат 2-O-сульфотрансферазу(Hs2st) 37, повреждён. Этот фермент катализирует перемещение сульфата к кислороду в позиции 2 иридоник-кислотного компонента HS 38. 2-O-сульфатирование также является существенным для взаимодействия HS с факторами роста, способными к диффузии. Hs2st ген первоначально экспрессируется в зачатке мочеточника, а также временно экпрессируется в мезенхиме до дифференцировки канальцев. Мыши, гомозиготные по аллелю Hs2st gene-trap, погибают перинатально вследствие дефектов почки 37; ветвление мочеточника и уплотнение мезенхимы у таких мышей нарушены. Согласующаяся с этим фенотипом, Wnt11 экспрессия (рис. 3) утрачена в концах зачатка мочеточника; экспрессия Ret в зачатке мочеточника и экспрессия Gdnf в мезенхиме также снижена. Эти результаты указывают, что Hs2st может модулировать активность и пригодность одного или нескольких сигналов, которые стимулируют образование тубул в почке. Такие сигналы, вероятно, могут быть выражены в зачатке мочеточника или мезенхиме и становятся функциональными в результате действия PGs. Однако сигналы в почке, которые определяются Hs2st-модифицированными HS PG, остаются неуловимыми. Так происходит потому, что фенотипы мышей, у которых предполагаемые сигнальные молекулы (Wnt4 и Bmp7) были инактивированы, не кореллируют с фенотипом Hs2st gene-trap-мутантов, у которых, вероятно, Hs2st является инактивированным. Другие возможные сигналы, такие как Wnt11, экспрессия которых зависит от GAG боковых цепей, или не могут функционировать как существенные сигналы 39, или, как в случае Fgf1 и Fgf2, независимы от функционирования Hs2st 40. Hs2st может также вносить вклад в почечное развитие, регулируя взаимодействие HSPGs с компонентами внеклеточного матрикса, способствуя, например, клеточной адгезии, которая требуется для уплотнения мезенхимы.
Вопрос об участии специфических PGs в почечном развитии вышел на первый план после экспериментов по подавлению (нокаутированию) у мышей глипикана-3 (Gpc3) 41, который также видоизменён у индивидов с синдромом Simpson-Golabi-Behmel (SGBS) и почечной дисплазией 42. Gpc3 содержит цепи GAG HS, которые прикрепляются к ядерному белку, который в свою очередь прикреплён к плазматической мембране липидом - гликозил-фосфотидилинозитолом (рис. 4). Gpc3 экспрессируется в зачатке мочеточника и почечной мезенхиме, начиная с 13.5 дней развития. Но после 18.5 дней его экспрессия уменьшается. Gpc3, по-видимому, играет двойную роль в развивающейся почке. Его инактивация ведет к увеличению ветвления зачатка мочеточника на ранних стадиях почечного развития (12 день), очевидно из-за увеличения разрастания зачатка мочеточника. На более поздних стадиях (15.5-16.5 день), клетки дистального собирающего протока почки демонстрировали преувеличенно быстрое разрастание, тогда как пролиферация проксимального собирающего протока снизилась 41. Gpc3 может управлять клеточными ответами собирающего протока на факторы роста, стимулируя или подавляя его развитие, что согласуется с ролью PGs в функционировании факторов роста. Действительно, потеря Gpc3 аннулирует подавляющий эффект Bmp2 на формирование ветвей, заменяет подавление Bmp7 развития зачатка мочеточника на стимуляцию в культуре органа 43, указывая, что Gpc3 может принимать участие в Bmp-сигнализации в течение почечного развития. Различные лиганды связаны выборочно с определёнными HS-последовательностями 44; Gpc3, возможно, связывает определённые Bmps и регулирует эффект передачи их сигналов в почке.
Gpc3 также является низкоаффинным рецептором для эндостатина 45, продукта протеолитического расщепления внеклеточного компонента матрикса - коллагена типа XVIII 46. Коллаген типа XVIII 47, и его фрагмент эндостатин 48 экспрессируются в зачатке мочеточника. В условиях клеточной культуры, применяемый экзогенно эндостатин блокирует миграционный и тубулогенный ответ почечных эпителиоцитов на фактор роста гепатоцитов (Hgf). Hgf является ещё одним фактором роста, который вместе с его онкогенным рецептором, c-Мет, стимулирует ветвление мочеточника in vitro 49. Функция эндостатина зависит от присутствия Gpc3 48. Интересно, что блокирование функции эндостатина антителами усиливает разрастание и ветвление изолированных зачатков мочеточника in vitro 48. Подобный эффект замечен также у Gpc3-нокаутных мышей. Поэтому не исключено, что эндостатин может отрицательно регулировать ветвление зачатка мочеточника посредством Gpc3.
Система сигнализации Gdnf/Ret является решающей для индукции мочеточников и их ветвления, и может модулироваться другими факторами, такими как плейотрофин, способствуя генерации специфического патерна в дереве разветвления мочеточников. Вероятно, другие сигналы, такие как Fgfs и Wnts, могут также вносить вклад в эту модель, но этот вопрос ещё предстоит изучить. Факторы, которые модулируются Hs2st, также ещё должны быть идентифицированы, и для этого могут быть использованы Hs2st-мутантные мыши. Для более подробного изучения развития и моделирования ветвления зачатка мочеточника, необходимо развитие новых методов культивирования, пригодных для более точного анализа трёхмерной структуры древа.
Тубулогенез
Начиная с пионерской работы Гробстейна 1, который показал, что почечные канальцы индуцированы тканевыми взаимодействиями, главной целью исследований в этой области стал поиск почечно-канальцевых индукторов. Формирование трубки в мезенхиме вызвается in vivo зачатком мочеточника, а in vitro - различными индукторами, например, спинным мозгом (см. BOX 1). Что мы знаем об индукторах? Классическое представление состояло в том, что мезенхимные клетки, которые входят в контакт с зачатком мочеточника и его сигналом, продолжают формирование почечных канальцев. За последние годы, однако, и в эпителии мочеточников, и в мезенхиме были идентифицированы гены, необходимые для нефрогенеза, играющие решающую роль и для сигналов, генерируемых зачатком мочеточника, и для сигналов - производных мезенхимы. Эти гены также определяют нисходящие сигналы в почечной мезенхиме, управляющие нефрогенезом.
Инактивация Emx2 у мышей предоставила генетическое основание для модели, в которой сигнал зачатка мочеточника участвует в индукции канальца in vivo. Emx2 - гомеобокс-содержащий фактор транскрипции, который экспрессируется первоначально в зачатке мочеточника 50. У Emx2-нокаутных мышей, зачаток мочеточника внедряется в мезенхиму метанефроса, однако индукция канальцев отсутствует и, следовательно, развития почки не происходит. Хотя некоторые мезенхимные и эпителиальные маркерные гены раннего почечного развития, такие как Wt1, Gdnf и Ret, экспрессированы у Emx2-мутантов, экспрессия Wnt4 в клетках мезенхимы отсутствует 50 (как будет обсуждаться ниже, предполагается, что Wnt4 является важным первоначальным сигналом для тубулогенеза). Emx2 может регулировать экспрессию одного или более, пока ещё не известных, продуцируемых зачатком мочеточника индукторов, которые являются медиаторами эпителиальной сигнализации в почечной мезенхиме, вызывающими тубулогенез. Однако, как гомеобокс-содержащий фактор транскрипции, Emx2 может также регулировать экспрессию других генов, вносящих вклад в нарушение тубулогенеза при отсутствии Emx2.
Wnt сигнализация и тубулогенез. Wnt - большое семейство секретируемых сигналов, которые регулируют ключевые морфогенетические шаги в ходе эмбриогенеза 51, 52. Со времени открытия в 1994, что Wnt1 может замещать влияние спинного мозга (в пробах почечной культуры органа; см. BOX 1) как индуктор тубулогенеза, Wnts был отнесен к тубуло-индуктивным сигналам 53. Однако в норме Wnt1 не экспрессируется в эмбриональной почке. Данный факт указывает, что он дублирует сигнализацию другого Wnt, который эндогенно выражен в почечной мезенхиме или зачатке мочеточника.
Из семейства Wnt, Wnt4 экспрессируется в уплотнённой мезенхиме и претубулярных агрегатах 54 (рис. 3). Благодаря инактивации Wnt4 у мышей была открыта его решающая роль в почечном развитии. В Wnt4-/- почках, мезенхима первоначально уплотнена на разрастающемся зачатке мочеточника и экспрессируются несколько ранних маркёрных генов мезенхимной индукции, таких как Wt1 и Pax2, но дальнейшего перехода мезенхимы в эпителиальную ткань не происходит, и канальцы не формируются 54. Поэтому Wnt4, вероятно, и является тем мезенхимным сигналом, который участвует в эпителио-мезенхимном переходе 55. Хотя известно, что Wnt-сигнализация взаимодействует с путём сигнализации гена Notch 56, и поэтому может быть вовлечена в Wnt-регулируемый нефрогенез, последние данные указывают, что путь Notch не участвует в эпителио-мезенхимном переходе, происходящем в раннем почечном органогенезе, но действует позже в ходе гломерулогенеза 57.
После того, как было обнаружено, что Wnt4 является существенным для нефрогенеза, функция Wnt4-сигнализации в активации тубулогенеза была исследована с помощью генерации NIH3T3 клеток мыши, в которых экспрессирован Wnt4.
Интересно, что и Wnt4-экспрессирующие клетки, и клетки, экспрессирующие ряд других Wnt, были в состоянии стимулировать тубулогенез в почечной мезенхиме in vitro 58. Wnt4-экспрессирующие клетки могли также преодолеть дефект тубулогенеза в Wnt4-мутантной мезенхиме. Эти исследования указывают на важность тубуло-стимулирующей роли Wnt4 и свидетельствуют, что классическая, стимулирующая почку, фильтрующая проба (classical kidney-inducing transfilter assay), при которой почечный тубулогенез вызван совместным культивированием эмбриональной почки и части спинного мозга, может действовать благодаря тому, что спинной мозг производит сигнал Wnt. Это воздействует на тубуло-стимулирующий путь, обычно активизируемый Wnt4. Является ли Wnt также медиатором производимой зачатком мочеточника индуктивной сигнализации? Другой Wnt - Wnt6, экспрессируется в развивающейся почке, на концах зачатка мочеточника, что делает его возможным индуктором восходящей Wnt4 регуляции 59. NIH 3T3 клеточные линии, в которых есть экспрессия Wnt6, могут действительно стимулировать генетическую экспрессию Wnt4 и развитие почечных канальцев in vitro. Wnt6 может, поэтому, функционировать как эпителиальный Wnt, который вызывает тубулогенез, активизируя Wnt4-сигнальную трансдукцию пути 59. В качестве альтернативы, Wnt6 сигнализация может быть избыточна относительно Wnt4 и, по этой причине, действовать как индуктор. Нокаут Wnt6, и других Wnt, экспрессирующихся в зачатке мочеточника 39, может дать ответ на этот вопрос.
Согласующиеся с функцией Wnt-сигнализации в почечном развитии, Frizzled-рецепторы также экспрессируются в развивающейся почке. Экспрессия Frizzled-4 в почке цыпленка коррелирует с экспрессией Wnt4, и, возможно, преобразует Wnt4-сигнализацию 60. Экспрессия выделяемого Frizzled-связанного белка (sFrp), который противодействует эффектам сигнализации Xwnt8 у лягушек и, очевидно, предотвращает активацию рецептора 61, также коррелирует с экспрессией Wnt4 в почке. SFrp выделяется в качестве ответной реакции на сигнализацию Wnt4, и его экспрессия также зависит от активности Wnt4. И SFrp1, и sFrp2 (рис. 3) экспрессируются в почке эмбриона крысы и также имеют различные функции в тубулогенезе: sFrp1, как полагают, противодействует сигнализации Wnt, тогда как sFrp2, возможно, способствует ей 63. Это заключение основано на полученных in vitro данных, которые указывают, что формирование трубочек и ветвление зачатка мочеточника подавляются sFrp1, но что органогенез может быть восстановлен, если к культуре с sFrp1 добавить sFrp2.
Семейство SFrp, по-видимому, модулирует Wnt-сигнализацию в развивающейся почке, но детали того, как трансдукция сигнала Wnt вызывает тубулогенез, все еще остаются предметом исследования. Для уточнения этого, необходимо развитие методов внесения генов в эмбриональную почку in vivo и in vitro. Упрощенные модельные системы, основанные на использовании клеточных линий, могли бы также служить инструментами для изучения интеграции Wnt-сигнализации с другими проводящими путями, таких как Notch и Bmp проводящих путей сигнализации, в управлении нефрогенезом (см. ниже) 64.
Дрозофила представляет ещё одну систему, в которой для изучения роли Wg/Wnt сигнализации в детерминации и дифференцировке почки мухи - мальпигиевы сосуды . (См. также обзор Brogid Hogan & Peter Kolodziej на стр. 513)
Bmp-сигнализация и тубулогенез. Bmp принадлежат Tgf-суперсемейству выделяемых сигналов и являются важными регуляторами развития 67. Хотя некоторые Bmp экспрессируются в почке 68, первое генетическое доказательство того, что они функционируют в течение нефрогенеза, было получено путем нокаутирования Bmp7 у мышей. Bmp7 - единственный из Bmp, который экспрессируется в нефрогенной мезенхиме 68. У Bmp7-нокаутных мышей, почка сначала формируется как обычно, происходит и ветвление зачатка мочеточника; формируются тела в виде запятой, а затем S-образные, но, начиная с 14.5 дня развития, нефрогенез прекращается 69, 70. Экспрессия Pax2, Wt1 и Wnt4 снижена в мезенхиме метанефроса у мутантов, и это может объяснять усиленный апоптоз, который замечен в почках Bmp7-нокаутных эмбрионов. Bmp7 может функционировать в качестве сигнала выживания, который предотвращает подверженность мезенхимных клеток апоптозу. В его Bmp7, как полагают, мезенхима прогрессивно истощает запас нефрогенных клеток 71, возможно нефрогенных стволовых клеток 72, приводя к описанной выше мутации. Более поздние данные говорят о том, что дополнительный Bmp7 в культуре предотвращает подверженность апоптозу клеток дикого типа в мезенхиме метанефроса, но что такие мезенхимные клетки не способны формировать канальцы. В соединении с Fgf2, однако, Bmp7 может стимулировать рост клеток стромы и поддерживать способность мезенхимы метанефроса мезенхимы подвергаться нефрогенезу in vitro 73. На основе этих результатов Dudley с соавт.. 73 предположили, что нефрогенная мезенхима является источником сигналов, которые способствуют быстрому увеличению стромальных клеток-предшественников, которые, в свою очередь, выделяют еще не идентифицированные анти-дифференциационные сигналы и сигналы выживания, контролирующие интенсивность нефрогенеза.
В настоящее время известно, что и эпителиальные, и мезенхимные гены регулируют индуктивные взаимодействия в почке, сигнализация Wnt идентифицирована как критический индуктор тубулогенеза. Вероятно, что сигнализация Wnt модулируется другими проводящими путями, такими как Notch и Bmp-сигнализацией, что остается предметом дальнейшего изучения. Нам всё ещё не известна природа индуктора зачатка мочеточника, полученного in vivo. В случае мочеточниковой сигнализации, единственный фактор не может быть достаточен для выполнения функциональных задач зачатка. Исследование генов-мишеней (target genes) Emx2 путем анализа Emx2-мутантов может предоставить способ идентификации производных зачатка мочеточника нефрогенных факторов. Это происходит потому, что нокаутирование предотвращает экспрессию Wnt4 и, очевидно, индукцию канальцев.
Строма в почечном развитии
Как обсуждалось выше, почечная мезенхима также даёт начало клеткам иного типа, чем те, которые относятся к нефрону. Один из таких типов клеток - клетки стромы, которые не дифференцируется в нефроны или в систему собирающего протока (см. Рис. 1). Роль стромального отдела в почечном развитии не была замечена прошлые годы, но изучение генов-мишеней на мышах показали, что строма является важным источником сигнализации в почечном органогенезе, в дополнение к зачатку мочеточника и нефрогенным центрам сигнализации мезенхимы.
Первое свидетельство важного значения стромы было получено при изучении экспрессирующегося в ней knockout forkhead box D1 (Foxd1) гена (прежде называемого Bf2 геном). Хотя его инактивация ведет к дефектам в системе собирающего протока и нефронов 74, он не экспрессируется в клетках названных тканей. Это позволило предположить, что Foxd1 может участвовать в почечном развитии, регулируя экспрессию сигналов, продуцируемых клетками стромы. Данные сигналы способствуют тубулогенезу и развитию зачатка мочеточника.
Было выяснено, что Витамин А также участвует в стромальной сигнализации 75. Сигнал итамина А преобразован ретиноево-кислотными рецепторами (Rars) ядра. Ретиноево-кислотный рецептор Rara экспрессируется на низком уровне во всей эмбриональной почке, тогда как экспрессия Rarb2 ограничена клетками стромы; эти рецепторы локализованы в клетках стромы. Единичные мутанты Rara, и ретиноево-кислотного рецептора Rarb не имеют почечных дефектов. Однако у мутантов с отсутствием и Rara, и Rarb рост зачатка мочеточника снижен, что указывает на недостаточную функцию данных генов в строме. Связанная с этим фенотипом мочеточника экспрессия Ret имеет нисходящую регуляцию - в зачатке мочеточника 75. Поэтому, клетки стромы, возможно, путем сигнализации в зачатке мочеточника поддерживают экспрессию Ret, и это может зависеть от ретиноевой кислоты. При проверке этой гипотезы на экспрессии Ret в зачатке мочеточника мышей-двойных мутантов, выяснилось, что экспрессия Ret в этом случае спасает развитие почки 76. Эти наблюдения предоставляют in vivo доказательство, что сигнализация клеток стромы поддерживает экспрессию Ret, которая, в свою очередь, подключает сигнализацию, регулирующую дифференцировку мезенхимных клеток 76. Эти данные указывают, что между стромой, зачатком мочеточника и почечной мезенхимой может существовать сигнальное кольцо, которое координирует почечное развитие. Стромальная сигнализация может также иметь влияние на нефрогенную мезенхиму, которая в свою очередь продолжает влиять на зачаток мочеточника.
Хотя природа сигналов, выделяемых ранними клетками стромы, остается неясной, существуют некоторые свидетельства, указывающие, что Fgf и Wnt сигналы могут иметь связь между собой. Экспрессия Fgf7 специфична в клетках стромы, которые окружают зачаток мочеточника и развивающийся собирающий проток, в то время как Fgf7 рецептор выражен непосредственно в зачатке мочеточника. В почках Fgf7-дефицитных мышей, рост зачатка мочеточника и собирающего протока снижен, и формируется на 30 % меньшее количество нефронов 77 - фенотип, который может быть частично исправлен в культуре с Fgf7. Fgf7 также стимулирует рост изолированного мутанта зачатка мочеточника, указывая, что Fgf7 может служить как фактор роста для развития зачатка мочеточника. Wnt2b, который регулирует рост конечностей in vivo 78, выражен в околопочечной мезенхиме в тесной близости к ранней стромальной мезенхиме почки, указывая, что Wnt2b может функционирогвать в этом почечном отделе. Действительно, почечный органогенез может быть начат повторно in vitro, если отделённый зачаток мочеточника культивируется с клетками (в которых экспрессируется Wnt2b до совместного культивирования зачатка мочеточника) со свежеизолированной почечной мезенхимой 79. Поэтому Wnt2b может функционировать как перинефрический и реципрокный мезенхимный сигнал, который регулирует ранее ветвление мочеточников; его инактивация у мышей может служить доказательством данной возможности.
Строма, очевидно, играет существенную роль в почечном развитии. Её сигнализация воздействует или на нефрогенную мезенхиму, или на зачаток мочеточника, а сигнализация от нефрогенной зоны может, в свою очередь, регулировать компартмент стромы. Также возможно, что имеются стимуляторы и ингибиторы участвующих сигналов. Природа этих сигналов остается, однако, в настоящее время умозрительной, но она может быть идентифицирована с использованием мутантов и клеточных линий, полученных от мутантов и эмбрионов дикого типа. Открытие, что Foxd1 и Rar белки являются важным для почечного развития, и что они экспрессируются в различающихся областях почки, указывает, что качественно различная стромальная сигнализация может регулировать гибель стромы; строма в коре почки может испускать сигналы к окружающим тканям, которые отличаются от таковых, обеспечиваемых стромой в медуллярном слое почки.
Перспективы
Мы обсудили вклад генетики в понимание почечного развития. Анализ мутантных фенотипов предоставил обширную информацию о комплексной природе клеток и взаимодействии тканей, которые управляют ранним почечным развитием (Таблица 1). Исследования инактивации генов показали, что некоторые факторы транскрипции регулируют инициирование почечного органогенеза. Действительно ли эти факторы транскрипции действуют в нескольких проводящих путях, и играют ли они также роль в почечной спецификации? Более детальный анализ экспрессии этих генов в мутантах, и поколение компаундов knockout-мутантов могут дать некоторые ответы. Рыбки данио моут также оказаться полезным организмом для моделирования и изучения спецификации и раннего патерна почечной мезенхимы 80. Генетический скрининг у этих рыб может также помочь идентификации новых генов, которые участвуют в раннем почечном развитии 81. Эксперименты по инактивации гена у мышей поддерживают гипотезу, что клеточная сигнализация между зачатком мочеточника, нефрогенной мезенхимой и клетками стромы координирует раннее почечное развитие. Особо важны в этой области исследования сигналов типа клетка-клетка и их роли в передаче клеточных взаимодействий в почке. Линии клеток, полученные от мутантов мыши, которые экспрессируют, например, lacZ ген в почке, могли бы стать полезными инструментами для таких исследований. Роль эндотелия в сигнализации в ходе раннего почечного развития также остаются предметом изучения (см. также обзоры о роли эндотелия в печени и панкреатическом органогенезе, написанные Kenneth Zaret & Helena Edlund 82, 83).
Исследования почки показали, что контроль эпителиального разветвления включает в себя несколько факторов, таких как ECM молекулы, факторы роста, их рецепторы, протеогликаны поверхности клетки, их ферменты. Детали того, как регулируется удлинение и ветвление зачатка мочеточника, и как этими факторами генерируется специфическая система разветвлений мочеточников, еще должны быть подробно изучены. Моделирование упрощённых систем клеточной и органной культуры in vitro предоставляет системы, в которых, например, ветвление может быть проанализировано отдельно от нефрогенеза, может быть полезным для решения этих задач 31, 47.
Полученные in vitro и in vivo результаты указывают, что сигнализация Wnt кардинально важна для стимулирования почечных канальцев у мышей. Wnt/Wingless также участвует в развитии мальпигиевых сосудов дрозофил, предоставляя другую систему для изучения сигнализации Wnt в тубулогенезе 66 и для отбора генов, которые вовлечены в этот процесс (см. обзор Brogid Hogan & Peter Kolodziej)
Мы все еще не имеем точных данных о производимых зачатком мочеточника сигналах, которые управляют последовательностью этапов дифференцировки мезенхимных клеток и ведут к нефрогенезу in vivo. Имеющийся набор мутантов мышей, у которых инициирование почечного развития прервано, может использоваться для опознавания этих сигналов зачатка мочеточника. Возможно использование, например, подхода основанного на множественных микроразрезах для получения экспрессии (microarray-based expression profiling) 84, 85, а также моделей нарушений развития при болезнях человека. Для дальнейшего изучения функционирования генов в почке мы должны идентифицировать гены - энхансеры (усилители), которые регулируют экспрессию гена во времени и пространстве. Культуральные технологии в применении к почке (см. BOX1) могут предоставить базу для таких изучений. Этот традиционный подход, объединенный с модернизированными генетическими и геномными технологиями, вместе с изучением других модельных организмов, приведёт в перспективе к лучшему пониманию почечного развития уже в ближайшем будущем.
