BCR | GPCRs | MZ | TCR | VAV

PHOSPHOINOSITIDE 3-KINASES (PI3Ks) - семейство энзимов, которые регулиреют различные биологические функции в каждом типе клеток, генерируя липидные вторичные мессенджеры. На базе структурного сходства, tсемейство PI3K м.б. подразделено на три класса. Класс IA PI3Ks участвует в передаче сигналов с помощью антигенных и ко-стимулирующих рецепторов и он является предметом рассмотрения данного обзора.

Class I PI3Ks

Класс I PI3Ks подразделен на две группы — class IA и class IB PI3Ks. Члены класса IA PI3K sактивируются с помощью ассоциированных с тирозин-киназой рецепторов, включая антигенные, ко-стимулирующие и цитокиновые рецепторы. Класс IA PI3Ks это гетеромерные энзимы, состоящие из регуляторной субъединицы (p85α p85β или p55γ ) и каталитической субъединицы (p110α , p110β или p110δ ). Каждая из каталитических субъединиц м.б. ассоциирована с любой из регуляторных субъединиц (BOX 1).

Класс IB PI3K, PI3K , активируется с помощью G-protein-coupled receptors (GPCRs) — большого семейства рецепторных белков, которые включают хемокиновые рецепторы. Имеется только одна каталитическая субъединица и одна регуляторная субъединица для класса IB, которые известны как p110γ и p101, соотв. Экспрессия каталитических p110&delta и p110γ субъединиц в основном ограничена лейкоцитами, тогда как p110α и p110β экспрессируются всеми типами клеток.

Функция класса I PI3Ks заключается в превращении PHOS-PHATIDYLINOSITOL-( 4,5)-BISPHOSPHATE (PtdInsP₂ ) в phos-phatidylinositol-( 3,4,5)-trisphosphate (PtdInsP₃ ) во внутреннем листке плазматической мебраны. PtdInsP₃ действует как сайт связывания для многочисленных внутриклеточных энзимов, которые содержат PLECKSTRIN-HOMOLOGY DOMAINS (PH домены) с избирательностью к этим липидам. Вообще-то наиболее важной из них является serine/threonine киназа AKT/PKB, которая выполняет важну роль в пролиферации и росте клеток, выживаемости и метаболизме многих типов клеток и эта роль законсервирована в ходе эволюции^3,4 .

В клетках B и T, PH-домен-содержащие тирозин киназы из семейства TEC — Bruton agammaglobulinaemia tyrosine kinase (BTK) в клетках В и interleukin-2 (IL-2)-inducible T-cell kinase (ITK) в клетках T — также являются важными медиаторами передачи сигналов PI3K⁵ .

Class II and class III PI3Ks

Мало известно о роли класса II и класса III PI3Ks в лимфоцитах. Класс II PI3Ks м. использовать и PtdIns и PtdIns(4)P в качестве субстрата in vitro, но их предпочтительный субстрат in vivo неизвестен¹. Класс III PI3K, Vps34 (PIK3C3), преимущественно фосфорилирует PtdIns, давая PtdIns(3)P, которые рекрутируют определенные группы эффекторных белков с т.наз. FYVE или Phox (PX) доменами¹. Классы II и III PI3Ks регулируют различные аспекты везикулярного транспорта (vesicle trafficking)⁶, и в качестве таковых обладают очевидным потенциалом для своего вовлечения в активности, такие как процессинг антигенов и цитотоксические реакции, которые используются для направленного субклеточного транспорта внутриклеточных пузырьков и их содержимого.

Dissection of PI3K function

Изучение передачи сигналов PI3K в B и T клетках с помощью иммортализованных линий клеток часто дает противоречивые результаты, особенно в отношении активации и ко-стимуляции Т-клеток⁷.

Wortmannin и структурно неродственный ингибитор LY294002 обнаруживают высокую избирательрность в отношении PI3Ks^8,9. Первые доказательства in vivo в отношении роли PI3Ks в иммунной системе получены в исследованиях на крысах, обработанных wortmannin. Было установлено, что wortmannin является мощным иммунным супрессором, и что он очень токсичен^10,11. Ни wortmannin, ни LY294002 не делают различий между разными изоформами PI3K, а т.к. PI3Ks являются критическими для клеток всех систем органов, то возникла необходимость в др. подходах.

Анализ трансгенных и gene-targeted мышей, имеющих модификации, которые мешают или улучшают активацию PI3K, пролили новый свет на роль PI3Ks в развитии, дифференцировке и активации B и T клеток (BOX 2). Чтобы исследовать роль класса I PI3Ks в клетках B и T непосредственно, различные субъединицы PI3K были целенаправлено подвергнуты гомологичной рекомбинации. Благодаря мощному перекрыванию (redundancy) между разными субъединицами и благодаря сложности, связанной с регуляцией p110 субъединиц с помощью p85 субъединиц, затруднительно детализировать разные gene-targeting стратегии до описания результирующих B- и T-клеточных фенотипов.

Dissecting PI3K function by gene targeting.

p85 локус (Pik3r1) кодирует, по крайней мере три регуляторные PI3K субъединицы (p85α , p55α и p50α ) с помощью альтернативного сплайсинга общего мРНК прелдшественника. Ген Pik3r1 целенаправленно подвергнут гомологической рекомбинации или чтобы элиминировать все три изоформы из 12 или элиминировать только длинную форму (p85α) делая возможной при этом экспрессию p55α и p50α ¹³. Не явилось неожиданным, что фенотип p85α , p55α и p50α triple-knockout мышей был в целом более тяжелым чем тот, что наблюдался у одиночных p85α нокаутных мышей. Важно, что тройные нокауты погибали вскоре после рождения и , следовательно, анализ B- и T-клеток возможен с помощью RAG COMPLEMENTATION. Для простоты, когда оба фенотипа сравнимы они будут обозначаться одиночные- и тройные-нокаутные мыши как p85α-дефицитные мыши. Разумно полагать, что после таргетинга p85α субъединица, которая, как считают, является наиболее многочисленной из класса IA регуляторных субъединиц, будет мешать рекрутированию p110 каталитической субъединицы в tyrosine-phosphorylated receptor комплексы. Однако, имеется также заметная редукция в уровне экспрессии каждого из класса IA каталитических субъединиц, которая согласуется с важной ролью p85 в защите p110 субъединиц от протеолиза^12–16. Неожиданно, в контексте передачи сигналов инсулина, PI3K-зависимые реакции оказывались усиленными скорее, чем ослабленными, у p85-дефицитных мышей, причина этого не очень понятна^16–18. Это наблюдалось также и у p85α-дефицитных мышей¹⁹(фенотип лимфоцитов у которых еще неизвестен). Следовательно, хотя имеются лишь незначительные сомнения, что активация PI3K затрагивается одним путем или др. у p85-дефицитных мышей, но это не всегда ясно, как. Внесен и дополнительный элемент сложности, некоторые исследования показали, что p85 м.б. сигнальным белком со своим собственным правилом, независимо от p110, путем взаимодействия с малыми GTPases, такими как RAC (через их RHO-GAP DOMAIN; известный также как B-cell receptor (BCR)-homology, BH, домен)^20,21 и не исключена возможность, что p85-дефицитные клетки имеют фенотип, который не является целиком следствием модулирования передачи сигналов p110 lipid-kinase.

Bi et al.^22,23 получили p110α- и p110β-дефицитных мышей, которые погибали эмбрионами после ст.(E)9.5 или вскоре после имплантации, соотв. В противоположность p110α и p110β , p110δ экспресируется в основном лейкоцитами, а p110δ-дейицитные мыши выживают, не имея существенных отклонений^24–26. Clayton et al.²⁵ и Jou et al.²⁶ устраняли экспрессию p110δ, тогда как авт. ²⁴ вносили мутации в p110δ локус, это позволяло поддерживать экспрессию каталитически неактивной субъединицы, p110δ^D910A. Сохранение экспрессии каталитически неактивной формы p110δ м. редуцировать компенсацию с помощью p110α и p110β,т.к. каждая из этих каталитических субъединиц в ассоциации с p85 конкурирует за ограниченный доступ к tyrosine-phosphorylated комплексу или RAS. Исходя из перекрываний функций и одинаковой экспрессии разных каталитических субъединиц, устранение p110δ м. предсказать, будет элиминировать 1/3 от общей tyrosine-kinase-ассоциированной PI3K активности в клетках B и T, т.к. p110δ является единственной из трех класса IA каталитических субъединиц, которые экспрессируются лимфоцитами. По-видимому, p110δ обладает большим, чем общая передача сигналов PI3K в клетках B и T, особенно в отношении антигенных рецепторов.

Мыши, дефицитные по p110γ получены тремя группами^27–29. Отсутствие потенциального перекрывания (redundancy) для каталитической p110γ субъединицы и регуляторной p101 субъединицы делает интерпретацию их экспериментов более простой, чем тех, что связаны с классом IA PI3Ks. Эти исследования показали важную роль p110γ в регуляции хемотактических реакций макрофагов и нейтрофилов^27–29. Продемонстрирована также важная роль p110γ в поддерживающих (mast) клетках³⁰, тромбоцитах³¹ и кардиальных миоцитах³². Sasaki et al.²⁹ также показали, что развитие и функция T-клеток нарушаются, тогда как B клетки остаются незатронутыми у p110γ-дефицитных мышей. Роль p110γ в передаче сигналов Т клетками рассматривалась в др. обзорах^33,34.

Numerous roles for PI3K in B cells

PI3Ks в развитии B-клеток. Развитие B-клеток проходит через определенные стадии, давая в конечном итоге, по крайней мере, три разных клона зрелых В клеток (FIG. 1). p85α-дефицитные мыши имеют частичный блок на стадии pro-B-cell и имеют пониженные количества В клеток в селезенке^12,13. Кроме того, p85α-дефицитные мыши лишены CD5⁺ B1 клеток в брюшине (50% снижение у p85α single-knockout мышей и полное отсутствие у p85α , p55α и p50α triple-knockout мышей)^12,13. p110&delta:-мутантные мыши имеют сходный фенотип, хотя возникают вариации между линиями мышей, которые были получены^24–26,34. Напр., Okkenhaug et al.²⁴ и Jou et al.²⁶ обнаружили блок в дифференцировке B-клеток на ст. костного мозга, а также снижение количества В-клеток в селезенке взрослых мышей. Напротив, Clayton et al.²⁵ не выявили каких-либо дефектов в развитии В-клеток в костном мозге. Они наблюдали, что мыши в возрасте 21 дня имели пониженные количества В клеток в селезенке, но у взрослых мышей их количество было нормальным. Причины этих расхождений неясны, но они м.б. связаны с различиями в использованных стратегиях таргетинга, а также в генетическом фоне и условиях содержания животных. Однако, все три группы нашли, что p110δ необходима для развития marginal-zone (MZ) B клеток и перитонеальных B1 клеток. Отсутствие MZ и B1 клеток особенно интересно, т.к. этот фенотип наблюдается также у Cd19 –/– мышей^35,36 (FIG. 1). CD19 является одним из главных регуляторов активности PI3K в B клетках³⁷ (FIG. 2), а мыши, экспрессирующие tyrosine-to-phenylalanine мутацию CD19, которая не позволяет связывать PI3K. также лишены B1 и MZ B клеток³⁸. Эти результаты указывают на то, что PI3K-передаваемый сигнал от CD19 управляет дифференцировкой B1 и MZ B клеток. Альтернативно, MZ B клетки м. развиваться независимо от CD19 и PI3K, но затем они быстро погибают, если CD19 и PI3K отсутствуют, поэтому их невозможно выявить³⁹. Хотя CD19 м. действовать ниже рецептора комплемента CD21, вряд ли он способствует развитию MZ B клеток, т.к. Cd21 –/– мыши имеют повышенные количества MZ B cells⁴⁰. Итак, возможно, что CD19 взаимодействует с еще неустановленным лигандом, чтобы способствовать развитию MZ B клеток. Важность CD19 для развития B1 и MZ B клеток м.б. связана со способностью CD19 понижать порог для активации с помощью BCR более чем в 100 раз (REF. 41), это м. каким-то образом способстовать развитию B1 и MZ B клеток. CD19 не являются абсолютно необходимыми для активации PI3K с помощью BCR^42,43, но он, по-видимому, необходим для поддержания активации PI3K после стимуляции BCR⁴². В контексте передачи сигналов инсулина, Tengholm et al.⁴⁴ недавно показали, что временная по сравнению с устойчивой передачей сигналов PI3K м. приводить к количественно различным реакциям клеток. Следовательно, существует возможность, что устойчивая передача сигналов PI3K необходима для развития MZ B клеток и что это зависит как от CD19, так и p110. Этот вывод подтверждается наблюдением, что дефицит phosphatase and tensin homologue (PTEN) м. восстанавливать развитие MZ B и B1 клеток у Cd19 –/– мышей⁴⁵. PTEN является липидной фосфатазой, которая удаляет D3 фосфат из PtdInsP ₃, это указывает на то, что ее отсутствие ведет к накоплению PtdInsP₃, а , следовательно, к устойчивой передаче сигналов PI3K (BOX 2).

В согласии с дефектами активации и развития B клеток, p85α-дефицитные и p110δ-дефицитные мыши имеют пониженную концентрацию антител в сыворотке. p85α одиночно-нокаутные мыши обнаруживали увеличение нормального иммунного ответа на THYMUS-DEPENDENT ANTIGENS (TD антигены), но оказывались неспособными отвечать на THYMUS-INDEPENDENT TYPE-2 ANTIGEN (TI-2 антигены)¹³. Нпротив, p110δ-мутантные мыши имели нарушенную реакцию и на TD и на TI-2 антигены^24–26. Однако, иммунные ответы не были зарегистрированы у p85α, p55α и p50α тройных-нокаутных мышей, это, учитывая их в общем более тяжелый фенотип, м. приводить к ослаблению реакций на TD и TI. Интересно было бы выяснить связь между CD19 и PI3K в В клетках в контексте В-клеточной ответной реакции. TD гуморальные иммунные реакции дефицитны у Cd19 –/– мышей³⁵. Более того, в развитии MZ B клеток способность CD19 обеспечивать TD иммунный ответ связана с его способностью рекрутировать и активировать PI3K ³⁸.

PI3Ks in B-cell signalling.

В клетках B PI3K активируется в течение нескольких секунд при запуске реакции антиген-рецептор^46,47. Тирозин киназа SYK активируется и фосфорилирует ко-рецепторы CD19 и B-cell PI3K adaptor (BCAP), которые создают сайты связывания для PI3Ks^37,48 (FIG. 2). В клетках В Cd19 –/– мышей IgM-специфическими антителами стимулированное фосфорилирование AKT/PKB снижено, это указывает на то, что CD19 играет важную, но не обязательную роль в активации PI3K^42,43. Однако, передача сигналов PI3K, по-видимому, важна для функционирования CD19, т.к. экспрессия мутантной формы CD19, которая не м. больше связывать PI3K, экспрессируемая на Cd19 –/– фоне, не м. восстанавливать CD19-дефицитный фенотип³⁸. Роль BCAP в активации PI3K менее ясна. Хотя продукция PtdInsP₃ и фосфорилирование AKT/PKB нарушены в Bcap –/– DT40 B клетках кур^48,49, IgM-специфическими антителами стимулированное фосфорилирование AKT/PKB неизменено в Bcap –/– B клетках мышей⁵⁰. Единственная возможность, что BCAP необходим только для передачи сигналов PI3K в определенном субнаборе В клеток. Возможно также, что дополнительные изоформы BCAP экспрессируются в В клетках мышей⁵⁰. Недавно было высказано предположение, что guanine nucleotide-exchange factor (GEF) VAV3 вносит вклад в активацию PI3K в B клетках с помщью механизма, который м.б. вовлечен в активацию RAC, который затем соединяется с p85α посредством его RHO-GAP домена. Это ставит VAV выше передачи сигналов PI3K скорее. чем ниже, как это предполагалось до сих пор^51,52.

IgM-специфическое антитиелами стимулированное фосфорилирование AKT/PKB почти исчезает в p85α- и p110δ-дефицитных В клетках, это указывает на то, что они являются основным классом IA регуляторной и каталитической изоформ, действующих ниже BCR^24,25,53. В самом деле, использовав новый подход⁵⁴ для измерения продукции PtdInsP₃ в первичных, немеченных клетках Clayton et al.²⁵ подтвердили полное отсутствие продукции PtdInsP₃ в p110δ-дефицитных В клетках в ответ на IgM-специфическими антителами обусловленную стимуляцию. Более того, антителами стимулируемый ток кальция был ослаблен в p110δ-дефицитных В клетках^24–26. Антителами стимулированная пролиферация также была заметно ослаблена у p85α- и p110δ-дефицитных мышей. Пролиферация В клеток, стимулированная с помощью IL-4, липополисахаридов или CD40-специфических антител, была редуцирована, но не столь заметно по сравнению с редукцией, стимулированной с помощью IgM-специфических антител^{12,13,24–26}. Необходимо отметить, однако, что в то время когда p85-дефицитные В клетки пролиферируют нормально в ответ на ко-стимуляцию IL-4 и CD40-специфическими антителами¹², p110δ-дефицитные В клетки не пролиферируют^24,25. Это открывает возможность того, что IL-4 и CD40 вместе м. привлекать p110δ независимо от p85α, в общем с помощью привлечения p85β-ассоциированной p110δ.

PI3K-mediated regulation of BTK

TEC-семейство киназ, как полагают, связано с активацией PI3K для передачи сигналов кальция. BTK, киназа из TEC-семейства, экспрессируется В клетками и содержит PH домен, который связывает PtdInsP₃ с высоким сродством. Мутации в BTK PH домене, которые нарушают связывание PtdInsP SUB>3, обусловливают фенотип Xid у мышей, который является столь же тяжелым, что и Btk –/– фенотип и сходен с p85α- и p110δ-дефицитными фенотипами, указывая тем самым, что PI3K-зависимая регуляция транслокации BTK в плазматическую мембрану является существенной для функционирования BTK^55,56. Фосфорилирование phospholipase Cγ (PLCγ) с помощью BTK, как полагают, необходимо для достижения пороговых уровней InsP₃, это делает возможным приток кальция из внеклеточных хранилищ в цитозоль, который необходим для устойчивого кальциевого ответа⁵⁷. После рекрутирования BTK в клеточную мембрану, обеспечиваемого путем ассоциации PH домена BTK с PtdInsP₃, тирозины 551 и 223 (Tyr551 и Tyr223) в BTK последовательно фосфорилируются с помощью LYN и с помощью аутофосфорилирования. соотв.^58,59 . В самом деле, Clayton et al.²⁵ обнаружили ослабление фосфорилирования Tyr551 и Tyr223 в BTK IgM-specific antibody-stimulated p110δ-дефицитных В клеток, используя сайт-специфические фосфопептид-специфические антитела, подтвердив тем самым роль PI3K в регуляции активации BTK. однако, Jou et al.²⁶ не выявили эффекта p110δ недостаточности фосфорилирования BTK, используя общие фосфотирозин-специфические антитела 4G10. Сходным образом, фосфорилирование BTK выглядело нормальным при использовании 4G10, в p85α-дефицитных B клетках, также как и в В клетках дикого типа, ингибированных с помощью iwortmannin или LY294002 (REF. 53). Более того, киназная активность BTK выглядит не измененной в результате ингибирования PI3K⁵³, а фосфорилирование PLCγ2 не затрагивалось у p110δ-дефицитных клеток^25,26. Эти результаты м. выверить, по крайней мере частично, с помощью наблюдения, что фосфорилирование Tyr551 в BTK частично ингибируется с помщью предварительной обработки клеток wortmannin, тогда как фосфорилирование, выявляемое с использованием 4G10, не ингибируется, это указывает на то, что сайты иные, чем Y233 и Y551 м.б. доминантно распознаваемы с помощью 4G10 (REF. 60). Несмотря на это фенотип BTK и p85α дважды дефицитных мышей более тяжел, чем каждого из нокаутов в отдельности⁵³ и BTK необходим для транскрипции небольшого субнабора генов, которые не регулируются с помощью PI3K⁶¹. Следовательно, хотя и имеются многочисленные доказательства роли PI3K в регуляции BTK, PI3K-независимое функционирование BTK исключить нельзя.

В противоположность p110δ-дефицитным мышам, Btk –/– мыши все еще формируют MZ B клетки, а их TD иммунные ответы менее затронуты, чем у p110δ-дефицитных мышей³⁶. Следовательно, уместно рассмотреть роль дополнительных эффекторов PI3K в передаче сигналов BCR. B-cell adaptor molecule of 32 kDa (BAM32) является адапторным белком с высоким сродством PtdInsP₃-связывания PH домена, которое, по-видимому, играет роль в BCR-зависимом токе кальция, хотя механизм, с помощью которого это происходит, неизвестен^62,63.

Роль др. эффекторов PI3K, включая AKT/PKB, в передаче сигналов в В клетках также предполагается⁶⁴, хотя еще не продемонстрирована in vivo. VAV м. регулироваться, частично, с помощью активации PI3K, т.к. PtdInsP₃ м. регулировать активность VAV GEF in vitro^51,65. Более того, BCR-стимулируемый ток кальция зависит от VAV, это указывает на то, что VAV м. обеспечивать связь между активацией PI3K и PLC. Однако, в противоположность PH доменам BTK, AKT/PKB и BAM32, VAV PH домен не содержит критических остатков, необходимых для связывания PtdInsP₃ с достаточным сродством, чтобы обеспечить поставку VAV в мембрану^66,67. В этом контексте интересно отметить, что T-cell lymphoma invasion and metastasis 1 (TIAM1), родственная VAV GEF, как было предположено регулируется скорее PtdIns(3)P, чем PtdInsP₃ (REF. 68). Точная роль VAV PH домена, однако. остается неизвестной^{65б 69}.

Вовлечение в кластер BCR и FcγRIIB с помощью антиген-антитело комплексовингибирует активацию B клеток. Это ингибирование обеспечивается с помощью FcγRIIB, которая использует липид фосфатазу SH2-DOMAIN-CONTAINING INOSITOL POLYPHOSPHATE D5 PHOSPHATASE (SHIP) чтобы превратить PtdInsP₃ в PtdIns(3,4)P₂, модулируя тем самым передачу сигналов PI3K. Совместное связывание FcγRIIB ингибирует фосфорилирование как AKT/PKB ^70,71, так и BTK ^72,73, это указывает на то, что обе эти киназы необходимы для активации PtdInsP₃ in vivo. У Ship –/– мышей отсутствие ингибирования B-клеточной передачи сигналов вносит вклад в развитие аутоиммунных заболеваний (аномальная активация миэлоидных клеток также вносит вклад в автоиммунные болезни в этой модели)^74–76. Амплитуда непрерываной фазы IgM-специфического антителами-стимулированного тока кальция в В клетках от этих мышей заметно повышена и это не м.б. ингибировано с помощью передачи сигналов FcγRIIB^73,74. Необходимо подчеркнуть, однако, что хотя конверсия PtdInsP₃ в PtdIns(3,4)P₂ м. прекращать BTK- и AKT/PKB-зависимую передачу сигналов сигнал PI3K м.б. затем превзойден (‘taken over’) с помощью недавно открытого tandem PH-domain-containing protein 1 (TAPP1) и TAPP2 адапторных белков, которые обладают связывающей специфичностью в отношении PtdIns(3,4)P₂ (REFS 77,78). Могут ли эти белки распространяться негативными сигнальными путями или обладают др. функциями, необходимо определить.

Numerous roles for PI3Ks in T cells

Развитие Т клеток происходит в тимусе, где предшественники тимоцитов отбираются с помошью собственных пептидов, представленных молекулами MHC. CD4⁺ и CD8⁺ T клетки, которые избегают элиминации за счет слишком сильной реакции с собственными пептидами, мигрируют в лимфатические узлы и селезенку, где пептиды презентируются с помощью dendritic cells (DCs). Распознавание self-пептидов в селезенке и лимфатичеких узлах, как полагают, держит Т клетки в в состоянии боевой готовности (alert) за счет субопитимальной передачи сигналов через T-cell receptor (TCR)⁷⁹. После презентации чужеродных пептидных антигенов активированными DC, T клетки начинают секретировать IL-2, подвергаются быстрой пролиферации и дифференцировке. T клетки, подвергнутые действию IL-12, стремятся дифференцироваться в interferon-γ-секретирующие T helper 1 (T_H 1) клетки, тогда как T клетки, под воздействием IL-4 стремятся дифференцироваться в T_H 2 клетки,которые м. секретировать IL-4, IL-5 и в некоторых случаях IL-10 (REF. 80). После пролиферативного взрыва, большинство Т клеток погибает в результате апоптоза, но некоторые выживают как Т клетки с долговременной памятью⁸¹. CD28 играт критическую роль во время активации Т клеток благодраря тесной ассоциации с TCR в interface между T клеткой и antigen-presenting cell (APC)⁸². APCs экспрессируют B7 молекулы (включая CD80 и CD86), которые являются лигандами для CD28, а способность APC активировать Т клетки зависит, в значительной степени, от их экспрессии B7 (или родственных ко-стимулирующих) лигандов⁸³.

PI3Ks in T-cell development and differentiation.

Развитие T-клеток в тимусе, по-видимому, не нарушается у p85α-дефицитных, p110δ-дефицитных или p110δ^D910A/D910A мышей, хотя позитивная и негативная селекция специально не проверялись ^24,26,84. Если сравнивать с Т клетками от сибсов дикого типа, то периферические p110δ^D910A/D910A T клетки экспрессируют более низкие уровни CD44 и более высокие уровни CD62L, это согласуется с их более naive фенотипом²⁴. Более того, p110δ^D910A/D910A мыши развивают среднюю форму воспалительного заболевания толстого кишенчика, характеризующегося инфильтрацией лейкоцитами в сегменты толстого кишечника. Т.к. флора кишечника с точки зрения иммунной системы является чужеродной, то необходим механизм, чтобы супрессировать ненужное воспаление кишечника. Это обеспечивается частично с помощью регуляторных Т клетоа, которые секретируют IL-10 или transforming growth factor-β (TGF-β ), которые супрессируют иммунную реакцию на безвредную кишечную флору⁸⁵. У p110 ^D910A/D910A мышей очевидно или IL-10- или TGF-β-секреция в регуляторных клетках не активируется и это приводит к неконтролируемой инфильтрации толстого кишечника лейкоцитами. В терминах Т-клеточной дифференцировки необходимо отметить, что два PI3K эффекторных белка, AKT/PKB и ITK, как полагают, регулируют дифференцировку и T_H 1- и T_H 2-клеточных клонов, соотв.^86–88. Вместе эти результаты указывают на возможную роль PI3K в дифференцировке naive T клеток в эффекторные. регуляторные и memory T клетки.

PI3Ks in T-cell signalling.

PI3K активация осуществляется в течение нескольких сек. активации Т клеток^89,90, и даже предшествует току кальция⁹¹. В одном исследовании, в котором PtdInsP₃ репортерная конструкция green fluorescent protein (GFP)–AKT/PKB-PH экспрессировалась в Т клетках TCR-трансгенных мышей⁹⁰, получены неожиданные результаты: после столкновения Т клетки с APC, PI3K остается активным в течение 9 ч. или более⁹⁰. Более того, используя PI3K ингибитор LY294002, было показано, что PI3K активация во время первых 9 ч. стимуляция Т клеток является существенной для пролиферации Т клеток, после чего PI3K становится больше ненужным. М. предположить, что накопление PtdInsP₃ будет локализоваться в области контакта между Т клеткой и APC^90,91. Непредвиденным результатом оказалос то, что PtdInsP₃ также накапливается на задней стороне Т клетки, отдаленной от APC ⁹⁰. Механизм или значени е такого накопления PtdInsP₃ неясен.

Имеется несколько возможных механизмов активации PI3K в T клетках⁹². TCR-interacting molecule (TRIM) является трансмембранным белком, который имеет короткий внеклеточный домен, который вряд ли соединяется с лигандом, но которы содержит также цитоплазматический домен, содержащий Tyr-Xaa-Xaa-Met мотивы, которые м.б. фосфорилированы после стимуляции TCR⁹³(FIG. 3). Трансмембранный адаптор linker for activation of T cells (LAT) м. также соединяться с PI3K, хотя возможно непрямо, т.к. не содержит Tyr-Xaa-Xaa-Met мотив⁹⁴ . Аналогично ситуации в В клетках, VAV1 , как полагают, регулирует активацию PI3K в тимоцитах, это ставит VAV скорее выше, чем ниже передачи сигналов PI3K⁹⁵. Ко-стимулирующие рецепторы CD28 и inducible T-cell co-stimulator (ICOS) также содержат Tyr-Xaa-Xaa-Met мотив, который м. функционировать как место постановки в док (docking) для SRC-HOMOLOGY 2 DOMAINS (SH2 доменов) p85 и м. также вносить вклад в активацию PI3K⁸³.

p85α-дефицитные Т клетки T развиваются нормально и не обнаруживают дефектов пролиферации в ответ на стимуляцию с помощью CD3-специфических антител¹². CD3-специфическими антителами стимулированная пролиферация тем не менее ингибируется с помощью LY294002, это указывает на то, что PI3Ks играет роль в TCR-зависимой пролиферации¹². Фактически отсутсвуют доказательства. указывающие что связанная с TCR активация PI3K нарушена у p85α-дейицитных T клеток; следовательно, компенсаторная роль p85β, напр., не м.б. исключена. В p110δ^D910A/D910A T клетках фосфорилирование AKT/PKB почти отсутствует в ответ на стимуляцию TCR²⁴ . CD3-специфическими антителами стимулированная пролиферация очищенных p110δ^D910A/D910A CD4⁺ T клеток редуцируется примерно на 50% (REF. 24). Куртьезно, но p110δ^D910A/D910A T клетки, стимулированные CD3-специфическими и CD28-специфическими антителами обнаруживают нормальную и даже усиленную пролиферацию и секретируют нормальные уровни IL-2. Следовательно, эти результаты подтверждают исследования, показавшие важную роль PI3K в передаче сигналов TCR независимо от CD28 (REFS 96,97). Jou et al.²⁶ наблюдали менее заметное снижение пролиферации в ответ на стимуляцию с помощью CD3 в p110δ-дефицитных T клетках по сравнению с p110δ^D910A/D910A T клетками. Это наблюдение м. отражать очень значительную способность p110α и p110β компенсировать в отсутствие экспрессии p110δ по сравнению с тем, когда экспрессируется ‘kinase-dead’ p110δ. Однако, различия экспериментальных протоколов также м. иметь значение. Jou et al. использовали культуры нефракционированных селезеночных келток в своем подходе, в котором ко-стимулирование осуществлялось с помощью B7 лигандов, экспрессируемых В клетками, макрофагами и DCs²⁶. В этих условиях p110δ^D910A/D910A T клетки также были слабо повреждены, это согласуется с несущественной ролью p110δ в CD3-зависимой пролиферациив присутствии ко-стимуляции.

Также как BTK в B клетках родственная тирозин киназа ITK соединаяет передачу сигналов TCR с притоком кальция в T клетки⁹⁸. Интересно, что Itk –/– мыши невосприимчивы к стимуляции с помощью CD3-specificантител, но гиперпролиферируют в ответ на ко-стимуляцию с помощью CD28 (REF. 99), это согласуется с результатами, полученными для p110&delta-дефицитных мышей²⁴. T клетки также экспрессируют еще одну киназ из семейства TEC, RLK (resting lymphocyte kinase; известна также как TXK), которая лишена PH домена и не связана с регуляцией с помощью PI3K¹⁰⁰. Способность RLK активироваться независимо от PI3K м.б. одной из причин того, что пролиферация Т клеток в ответ на antigen-receptor стимуляцию менее нарушена у p85α- и p110δ-мутантных мышей, чем пролферация В клеток¹⁰¹ .

Shi et al.¹⁰² показали, что продукция IL-2 T клетками чувствительна к wortmannin в ответ на стимуляцию антигеном с помощью APCs, независимо от того, передаются ли ко-стимулирующие сигналы через CD28, но она не зависит от PI3K, когда индуцируется антителами, специфичными к CD3. Было предположено, что PI3K необходим для образования APC–T-cell конъюгатов. Однако, недавно было показано, что образование таких комплексов не зависит от PI3K ⁹⁰. Несмотря на это, TCR-трансгенные p110δ^D910A/D910A T клетки стимулируются пептидным лигандом, представляемым В клетками дикого типа, действующими как APCs, но имеют заметно сниженную пролиферативную реакцию и пониженную способность продуцировать IL-2, даже в тех условиях, когда ко-стимуляция осуществляется с помощью APCs²⁴. Все это указывает на то, что T клетки скорее всего зависят от p110δ, чтобы амплифицировать сигналы, стимулированные с помощью пептидного антигена, но что сильные стимулы, оказываемые с помощью CD3-специфических антител совместно с ко-стимулированием через CD28 м. обходить эту потребность.

Один механизм, согласно которому сигналы через TCR амплифицируясь вызывают накопление липидных платформ на T-клетка–APC interface¹⁰³. Липидные плотики являются микродоменами, богатыми sphingolipid и холестеролом, в плазматической мембране. Липидные плотики обогащены киназами SRC-семейства и малыми GTPases, а , следовательно, их накопление на месте соединения Т клетки с APC м. обеспечивать высокую локальную концентрацию критических сигнальных молекул, которые ведут или к амплификации или устойчиваости передачи сигналов¹⁰⁴. Накопление липидных плотиков м.б. также индуцировано с помощью CD3-специфических и CD28-специфических антител, соединенных с polystyrene кусочками размером в клетку и оно м.б. видимо при использовании флюоресцентно меченного холерного токсина, который связан с GM1-glycosphingolipid, который обнаруживается в плотиках¹⁰³. Интересно, что p110 D910A/D910A T клетки имеют пониженную способность формировать такие липидные плотики в ответ на стимуляцию CD3-специфическими и CD28-специфическими антителами²⁴. Хотя этот дефект не влияет на способность Т клеток пролиферировать или продуцировать IL-2 в ответ на стимуляцию антителами (которая использует взаимодействия рецепторов высокого сродства), однако взаимодействия низкого сродства, осуществляемые между TCR и peptide–MHC на APC, м. критически зависеть от рекрутирования плотиков для обеспечения или поддержания передачи сигналов. В соответствии с этим p110δ-дефицитные Т клетки T отвечают слабо на петидные антигены, прдставляемые APCs ²⁴ или на стимуляцию с помощью phytohaemagglutinin, который является относительно слабым агонистом TCR для Т клеток мышей²⁶.

PI3K and CD28 co-stimulation

CD28 обеспечивает судщественный ко-стимулирующий сигнал во время активации Т клеток, который усиливает продукцию IL-2, увеличивает пролиферацию Т клетоки предупреждает индукцию отсутствие защитных реакций (anergy) и гибель клеток. Много внимания было уделено потенциалу CD28 стимулировать PI3K в Т клетках. Наблюдение, что CD28 м. активировать PI3K независимо от TCR⁸⁹ и что CD28 содержит Tyr-Xaa-Xaa-Met мотив в своем цитоплазматическом домене, которые м. связывать SH2 домены p85, привело некоторых исследователей к вопросу, м. ли ко-стимулирование через CD28 быть связано с активацией PI3K¹⁰⁵. Первоначальные эксперименты, с использованием различных T-клеточных линий, трансфицированных мутантными формами CD28, дали противоречивые результаты в отношении роли PI3K ниже CD28 (REF. 105). Некоторые из этих результатов трудно интерпретировать, т.к. использованы трансформированные Т-клеточные линии, частично потому. что они больше не экспрессировали PtdInsP ₃ phosphatase PTEN⁷. Без PTEN, клетки накапливали высокие уровнеи PtdInsP₃, даже в отсутствие стимуляции и как таковая передача сигналов PI3K постоянно включена (switched on). также, в противоположность первичным Т клеткам трансформированные T-клеточные линии пролиферируют независимо от сигналов от TCR и CD28. Кроме того, трансфоримрованные T-клеточные линии не м.б. использованы для изучения роли CD28 в предупреждении anergy. Недавно стали использовать трансгенные подходы для изучения роли передачи сигналов PI3K ниже CD28 в первичных T клетках. Замещение тирозина в Tyr-Xaa-Xaa-Met мотиве на фенилаланин устраняет PI3K соединение с CD28 (REF. 106). Получены трансгенные мыши, экспрессирующие такую мутацию CD28(Tyr170Phe) на Cd28 –/– фоне^107,108. Альтернативно, ретровирусная трансдукция была использована для экспрессии CD28(Tyr170Phe) белков в Cd28 –/– первичных T клетках in vitro¹⁰⁹. Эти эксперименты показали, чтоt CD28 м. ко-стимулировать пролиферацию Т клеток и продукцию IL-2 независимо от его ассоциации с PI3K^107–109, хотя одна из групп полагает, что пролиферация и продукция IL-2 были задержаны у мутантных мышей¹⁰⁸. Однако, способность CD28 вызывать ко-стимуляцию in vivo не затронута, как показывает способность CD28(Tyr170Phe)-экспрессирующих Т клеток обеспечивать помощь В клеткам во время антивирусного иммунного ответа и предупреждать индукцию anergy ¹⁰⁷. В противоположность продукции IL-2 способность CD28 обеспечивать выживаемость благодаря экспрессии BCL-X_L исчезала из CD28(Tyr170Phe)-экспрессирующих Т клеток^107,109, это м. приводить к неспособности CD28(Tyr170Phe)-экспрессирующих Т клеток выживать после пересадки (engraftment) на необлученных хозяев¹⁰⁸. Эти результаты согласуются с важной ролью AKT/PKB в продвижении экспрессии BCL-X_L ниже после активации PI3K в T клетках¹¹⁰. Т.о., способность CD28 усиливать экспрессию BCL-X_L помогает обеспечивать выживаемость T клеток^{107,108,111,112}, CD28 очевидно использует дополнительные сигналы для обеспечения пролиферации и предупреждения анэргии Т клеток.

Избыточная экспрессия активрованной формы AKT/PKB в Cd28 –/– CD4⁺ первичных Т клетках выявляет их способность секретировать IL-2 в ответ на пептидный антиген⁸⁶. Это исследование, по-видимому. находтся в конфликте в наблюдением, что CD28(Tyr170Phe)-экспрессирующие CD4⁺ T клетки, которые не м. стимулировать фосфорилирование AKT/PKB²⁴, продуцируют нормальные уровни IL-2 в ответ на стимуляцию пептидным антигеном¹⁰⁹. Однако, хотя способность CD28 рекрутировать PI3K м.б. несущественна для регуляции продукции IL-2, однако все еще возможно, что CD28 м. влиять на способность TCR to couple с PI3K и AKT/PKB активацией независимо от Tyr170 сайта. В цитоплазматическом домене CD28 имеются две богатые пролином области дистальнее Tyr-Xaa-Xaa-Met PI3K-связывающего сайта, которые м. связывать белки с SRC-HOMOLOGY 3 DOMAINS (SH3 доменами)^113–116 (FIG. 4). Наиболее С-терминальный из них достаточен для обеспечения способности CD28 ко-стимулировать пролиферацию и продукцию IL-2 первичными CD4⁺ T клетками¹⁰⁹. Хотя и было предположено, что эта богатая пролином область облегчает рекрутирование p85 посредством их SH3 домена ¹¹⁷, это не согласуется с полной потерей CD28-ассоциированной активности PI3K у CD28(Tyr170Phe) мутантов^{106,118–120}, с неспособностью Tyr170Phe мутантов активировать AKT/PKB¹⁰⁷ и с отсутствием взаимодействия между рекомбинантным p85 SH3 доменом и CD28 белком in vitro¹¹⁴. Однако, CD28 С-терминальная богатая пролином область, по-видимому, не нужна для пролонгированной активации LCK в ответ на стимуляцию TCR¹²¹, возможно за счет связывания LCK SH3 домена и , следовательно, облегчения ингибирующего эффекта, который LCK SH3 домен оказывает на LCK киназный домен^121,122. В самом деле, этот механизм активации тирозин киназ был показан для CD28-опосредуемой регуляции ITK, который зависел от наиболее проксимального к мембране богратого пролином мотива CD28 и от ITK SH3 домена^116,123. Устойчивая активация LCK и/или ITK м. , следовательно, вносить вклад непрерывную tyrosine-kinase-зависимую активацию PI3K с помощью TCR, напр., с помощью фосфорилирования TRIM или др. белка, содержащего Tyr-Xaa-Xaa-Met мотив(s). Следовательно, экспрессии AKT/PKB в Cd28 –/– T клетках не обязательно обходить потребность в CD28, чтобы рекрутировать и активировать PI3K непосредственно, вместо этого м. обеспечиваться TCR-зависимая PI3K активация за счет поддержания LCK или ITK в активной конфигурации (FIG. 4). Для подтверждения этой модели, PI3K д., по-видимоу, обладать интегральной ролью в передаче сигналов TCR^24,96,97. Более того, потребность в ко-стимулировании через CD28 обходится в устаревших Т клетках (которые имеют дефекты в гене, который кодирует SH2-домен-содержащий белок tyrosine phosphatase 1, SHP1), в которых отсутствие SHP1-ассоциированной tyrosine-phosphatase активности ведет к постоянной тирозин-киназной активности независимо от CD28 (REF. 124).

Относительные вклады TCR и CD28 в передачу сигналов PI3K еще предстоит определить. Кроме того, PI3K м. играть важнцю роль в передаче сигналов от др. ко-стимулирующих рецепторов и цитокиновых рецепторов на разных стадиях иммунного ответа⁹². В частности, PI3Ks м. оказаться важными для регуляции клетоыного цикла и выживаемости клеток за счет IL-2 рецепторов⁹² (FIG. 3), хотя специфические PI3K субъединицы, которые необходимы для передачи сигналов IL-2-рецептор in vivo необходимо еще идентифицировать. Frauwirth et al.¹²⁵ предположили, что PI3K м. играть важную роль ниже CD28 в регуляции метаболизма глюкозы по типу, аналогичному с тем, как инсулиновые рецпепторы используют путь передачи сигналов PI3K. Является ли эта функция уникальной для CD28 остается установить, но эти исследования м. открыть часто незанчительные аспекты активации Т клеток, в которых PI3K м. играть оглавнцю роль.

Следствием несдержанной PI3K передачи сигналов PTEN, PtdInsP₃ phosphatase, которая удаляет фосфатную группу из D3 позиции кольца инозитола, является частое мутаирование в опухолях^126,127. Pten –/– мыши погибают на ст. эмбриона, а Pten +/– гетерозиготные мыши выживают и у низ возникает аутоиммунитет, который. как полагают, является результатом, частично, повышенной резистентности к Fas-обусловленному апоптозу¹²⁸. Cre-обусловленные делеции PTEN ограниченные Т клетками вызывают фатальную lymphoproliferative болезнь, со 100% смертностью к 17 недельному возрасту¹²⁹. Такие мыши также страдают аутоиммунностью как следствием нарушения негативной селекции в тимусе¹²⁹. Хотя PTEN делетирован и в CD4⁺ и CD8⁺ T клетках, однако в основном CD⁺ T клетки подвергаются неконтролируемому росту¹²⁹. Эти исследования показали, что конституитивная активация PI3K защищает T клетки от апоптоза, как в тимусе во время негативной селекции, так и на периферии в результате неспособности их подвергаться активацией индуцирвуемой гибели клеток. В согласии с этим заключением находится и фенотип мышей с ограниченной Т клетками экспрессией трансгена p85α-делеционного мутанта, у которого отсутствуют негативные регуляторные последовательности¹³⁰. Эти мыши обнаруживают средней степени выраженности lymphoproliferative болезнь, которая развивается с возрастом, и они предрасположены к возникновению лейкемии. В противоположность выраженным дефектам PTEN недостаточности на Т клетки, Т клетки от мышей с отсутствием SHIP, др. PtdInsP₃ фосфатазы (но которая, в отличие от PTEN, удаляет D5-фосфат их кольца инозитола), выглядят нормальными, за исключением незанчительного увеличения количества CD4 T клеток⁷⁴. Тем не менее возможно, что эта SHIP м. регулировать активацию T клеток до некоторой степени^131,132.

Concluding remarks

In summary, PI3Ks are important regulators of adaptive immunity. Too little PI3K activity leads to immunodeficiency, whereas too much activity leads to autoimmunity and leukaemia. The molecular basis for the preferential requirement for p110δ in B and T cells is not known. Possible explanations include distinct subcellular localization, different capacities to interact with RAS or other small GTPases, and different kinetics of activation compared with p110α and p110β. The molecu-lar basis for PI3K activation in B and T cells needs to be further elucidated before such questions can be answered. In addition, tissue-specific knockouts will probably provide information about any roles for p110α and p110β in the regulation of adaptive immunity, as the phenotype of p110δ-deficient mice does not exclude compensatory or complementary functions for these kinases. The precise role of p110γ in B and T cells has also yet to be carefully examined, particularly in the context of chemotactic responses, which involve GPCRs. Finally, virtually nothing is known about the function, if any, of the class II and class III PI3Ks in lymphocyte biology. Considerable progress has been made in understanding the contributions of PI3Ks to lymphocyte biology since their initial description nearly 15 years ago ¹³³ . It is hoped that, in the next 15 years, this knowl-edge will contribute to the development of treatments for immune-related diseases, including autoimmunity, leukaemia and graft rejection. Indeed, the development of PI3K isoform-selective inhibitors is currently being pursued by several pharmaceutical companies ¹³⁴ . In this context, it is particularly encouraging to note the recent development of p110δ-specific inhibitors ^{^135,136}.

PI3K IN LYMPHOCYTE DEVELOPMENT, DIFFERENTIATION AND ACTIVATIONKlaus Okkenhaug and Bart VanhaesebroeckNATURE REVIEWS IMMUNOLOGY, VOLUME 3 | APRIL 2003 |P. 317

PI3K IN LYMPHOCYTE DEVELOPMENT, DIFFERENTIATION AND ACTIVATION
Klaus Okkenhaug and Bart Vanhaesebroeck
NATURE REVIEWS IMMUNOLOGY, VOLUME 3 | APRIL 2003 |P. 317