REGULATORY PHASES OF EARLY LIVER DEVELOPMENT: PARADIGMS OF ORGANOGENESIS
Kenneth S. Zaret Nature Reviews Genetics3, No 7, 499-512 (2002)
Genetic analysis, embryonic tissue explantation and in vivo chromatin studies have together identified the distinct regulatory steps that are necessary for the development of endoderm into a bud of liver tissue and, subsequently, into an organ. In this review, I discuss the acquisition of competence to express liver-specific genes by the endoderm, the control of early hepatic growth, the coordination of hepatic and vascular development and the cell differentiation that is necessary to generate a functioning liver. The regulatory mechanisms that underlie these phases are common to the development of many organ systems and might be recapitulated or disrupted during stem-cell differentiation and adult tissue pathogenesis.
(Рис. 1.) | Establishing the competence to express hepatic genes in development.
(Рис. 2.) | Signals and tissue interactions that pattern the hepatic domain.
Подобно легким, поджелудочной железе и кишечнику, печень также происходит из примордия кишки. В ее функции входит переработка итптельных веществ после переваривания пищи, поддержание концентраций метаболитов и сывороточных белков в крови, детоксикация , она тккже служит местом гематопоэза во время беременности. Мутации, затрагивающие размер, сосудистую сеть, расположение клеток или метаболические функции печени, часто ведут к эмбриональной гибели. Несмотря на это получено довольно много информации о регуляторных генах, которые являются критическими для развития печени.
первыми функциональными клетками печени являются и cholangiocytes (клетки желчных протоков). Как их общие предшественники — hepatoblasts — появляются в определенной локализации в эмбриональной энтодерме, где имеются и предшественники др. типов клеток, производные кишки, таких как pancreas, появляющиеся в соседних частях энтодермы? Как только печень млекопитающих оказывается сформированной гематопоэтические клетки проникают в нее и располагаются в ней вплоть до рождения. Как пространственный паттерн роста гепатоцитов соркестрован с ? чтобы обеспечить образование хорошо васкуляризированного гематопоэтического органа? После рождение печень переходит от гематопоэтической роли к контролю за метаболитами и сывороточными белками в кровотоке и к детоксификации. Что управляет заметными изменениями профилей экспрессии генов в печени плодов?
Hepatic pre-patterning of the endoderm
Важным вопросом морфогенеза кишки является, существуют ли различные домены онтогенетической компетентности в энтодерме — или 'pre-patterns' — которые детерминируют, где разные ткани будут возникать водоль переднезадней оси эмбриона (Box
1). Домены компетентности, если такие существуют, д. характеризоваться дифференциальной экспрессией транскрипционных факторов или молекул передающих сигналы вдоль пердензадней оси энтодермы. В этом случае паттерны дифференциальной экспрессии д. устанавливаться, когда формируюется дефинитивная энтодерма или сразу после этого. Хотя и имеются некоторые доказательства домена компетентности для образования печни, однако, мало прямых доказательств.
Foxa proteins. Первыми генетическими доказательствами важности транскрипционных факторов в установлении энтодермального домена, из которого возникнет печень, получены с помощью класических подходов идентификации белков. которые важны для печень-специфической транскрипции во взрослых гепатоцитах. биохимический подход идентификации печеночных факторов привел к клонированию трех родственных Foxa (forkhead box A; formerly Hnf3, hepatocyte nuclear factor-3) белков, каждый из которых экспрессируется в плодной и взрослой печени, а также в др. тканях, производных энтодермы. Белки Foxa регулируют, действительно, все печень-специфические гены, а также гены легких и поджелудочной железы.
Экспрессия (formerly Hnf3b) начинается в первичной полоске — предшественнике энтодермы — и в узле — энтодермы и предшественника — во время гаструляции(~6.5 день эмбриогенеза мыши; E6.5). Экспрессия (Hnf3a) инициируется в энтодерме кишки на ст. E7–E8, перед органогенезом, тогда как экспрессия ( Hnf3c) начинается в энтодерме кишки на ст. E8–E9, но ограничена областями средней и задней кишки. Foxa1 и Foxa3 гены экспрессируются также в ранней нейральной ткани (эктодерме) и в хорде (мезодерме), но все гены Foxa ограничены органами, имеющими энтодермальное происхождение. Гомозиготы по мутации Foxa1 ведут к нарушению экспрессии панкреатического и последующей постнатальной гибели, тогда как гомозиготные мутации по Foxa3 вызывают снижение уровней транскрипции некоторых печеночных генов, но не обнаруживаются фенотипически. Напротив, гомозиготность по Foxa2 мутации потери функции ведет к эмбриональой гибели вскоре после гаструляции с дефектами в первичной полоске, узле, хорде , которые нарушают развитие нервной трубки и морфогенез переденей кишки.
Tetraploid chimaera analysis in mice. Чтобы заставить дефинитивную энтодерму формировать и замещать висцеральную энтодерму у мутантных Foxa2 эмбрионов, et al. использовали агрегаты тетраплоидных embryonic stem (ES)клеток. Ранее было показано, что если тетраплоидные клетки трансплантировать псевдобеременным самкам, то возникают только внеэмбриональные ткани, такие как висцеральная энтодерма, но если они агрегированы с димим типом диплоидных ES клеток, то м.б. культивированы до стадии . 'Собственно эмбрион' м. затем возникать из диплоидных ES клеток. Dufort et al.получали тетраплоидные эмбриональные клетки, которые были маркированы постоянно активным lacZ геном и агрегированы с гомозиготными Foxa2 мутантными ES клетками. Агрегационные химеры не имели foregut- и midgut-дефинитивной энтодермы, a lacZ+ тетраплоидные висцеральные энтодермальные клетки не исчезали из областей передней и средней кишки. Однако, дефинитивная энтодерма задней кищки присутствует и замещается тетраплоидной висцеральной энтодермой. Итак, Foxa2 является обязательным для развития энтодермы передней и средней кишки у мышей. Напротив, (известный также как Madh2; MAD homologue 2) — сигнальный трансдуктор Tgf-β (transforming growth factor-β) сверхсемейства — обязателен для клеток эпибласта, чтобы конвертировть среднюю и заднюю энтодерму во время гаструляции. но не самую переднюю энтодерму, из которой и возникает печень.
Directions for the future. То, что Foxa2 и Smad2 необходимы для разных доменов дефинитивной энтодремы, доказывает, что, они ограничиваются препаттерном, который д.б. критическим для спецификации ткани, такой как печень, в пространственных доменах. Пока нет доказательств, что индивидуальные типы тканей pre-patterned. Скорее, энтодермальные домены обладают доменами широкой компетентности, которая последовательно разрешается в субнабор тканей, производных кишки.
Mechanisms for acquiring hepatic competence
Каковы молекулярные механизмы, с помощью которых энтодермальные транскрипционые факторы приобретают потенциал активировать ткане-специфические гены? Какие факторы открывают неактивные домены хроматина и какие факторы непосредственно обеспечивают транскрипционную активность?
Conserved role for Foxa proteins in gut organogenesis.
Вскоре после открытия Foxa генов у млекопитающих стало ясно, что очень сходныйгенетический контроль развития кишки существует во всем царстве животных. Первым обнаруженным гомологом оказался у Drosophila melanogaster. Его ДНК-связывающий домен имеет 90 из 110 идентичных аминокислот с таковым в белках Foxa. Степень этого сходства важна в связи с потребностью forkhead в развитии кишки мух. Ген нематоды Caenorhabditis elegans hимеет 75% идентичность в Foxa ДНК-связывающем домене, a PHA-4 белок необходим для развития кишки, особенно передней, глоточной области. Интересно, что в отсутствие PHA-4 фарингеальные клетки становятся эктодермой, которая м.б. аналогична той, которой недостает в эпибласте Foxa2-нулевых эмбрионов мыши для развития в дефинитивную энтодерму во время гаструляции. Гомологи Foxa2 обнаружены у лягушек, рыб и даже в , таких как гидра. Семейство Fox (forkhead box) очень большое и многие из его членов функционируют в разных онтогенетических и физиологических контекстах>; подгруппа Foxa и ее ближайшие родственники, однако, специфичны для развития кишки.
Temporal control of developmental activation. Идентификация генов, котрорые преимущественно экспрессируются в глотке C. elegans, выявила что все тестированные гены имеют функциональный PHA-4 (Foxa) ДНК-связывающий сайт. Интересно, что время активации генов в фарингеальном развитии коррелирует со степенью, с которой PHA-4-связывающий сайт каждого гена приближается к оптимальному связывающему консенсусу. Превращение сайта, связывающего с низким сродством, в сайт с высоким сродством ведет к более ранней активации соотв. гена, а если сайт с высоким сродством превращается в сайт с низким сродством, то происходит обратное. Следовательно, фарингеальные гены имеют временной порог отвечать на уровень PHA-4. Приняв во внимание, что если уровень PHA-4 связывания сильно зависит от сродства к сайту-мишени, тогда упакованность хроматина сайта-мишени и его потенциальное существование в разных состояниях хроматина оказываются под вопросом. Др. словами, состояние модификации нуклеосом и гистонов, которые влияют на связывание ДНК многими др. факторами, м. иметь минимальное отношение к PHA-4/Foxa белкам.
Chromatin occupancy by FoxA proteins. М. ли выявить сайт связывания транскрипционного фактора, окуппирующего мишень (occupancy) в определенном локусе in vivo с помощью и . Хотя первый метод определенно устанавливает, какой белок связан с областью ДНК, он нуждается в большом количестве материала и обычно проводится на большом количестве клеток, далеком от того, которое м.б. получено от эмбрионов. Второй метод устанавливает точко, какие ДНК последовательности оккупированы его специфическим транскрипционным фактором. Хотя и не устанавливает в точности идентичность фактора, он м.б. приспособлен к небольшому количеству клеток, которые м. получить от эмбрионов.
Используя in vivo footprinting технику было показано, что сайтом строгого связывания для фактора Foxa являются вышестоящие последоватльности печень-специфического гена в энтодерме эмбрионов мыши до того как индуцируется экспрессия альбумина (Рис. 1b). Более того, место, оккупируемое Foxa, персиститует и в дорсальной энтодерме на ст. E8.5 - E11.5, следовательно, м. думать, что домен обычно дает кишечник (Box 1), а ген альбумина остается здесь молчащим. На ст. E13.5, уровни белка Foxa снижаются в дорсальной энтодерме и сайт в альбумине больше не занят Foxa.
Далее было показано, что в периодe E8.5–E11.5, если дорсально-задняя энодерма удаляется от покрывающей ее межодермы и культивируется в течение двух дней in vitro, то в ткани активруется ген альбумина. Но на ст. E13.5 дорсально-задняя энтодерма теряет эту способность. Эти исследования показывают, что время, в течение которого хроматиновый сайт оккупируется Foxa in vivo коррелирует с компетеностью активировать печень-специфические гены.
Lfktt in vivo footprinting эксперименты показали, что на E9.5 в зачатке печени оказываются оккупированы 4 других сайта связывания транскрипционными факторами рядом с сайтом для Foxa, как только ген альбумина становится активным (Рис.
1с). Печеночные гены становятся активированными в печеночной энтодерме под влиянием различных сигналов от мезодермы; возможно активация др. транскрипционных факторов в ответ на эти сигналы представляет собой скорость-ограничивающую ступень для экспрессии печень-спейтфических генов. Основным является то, что во время спецификации ткани ген, который компетентен стать активным, экспрессируется в результате вовлечения дополнительных транскрипционных факторов.
Molecular mechanism for developmental competence. Как м. связывание Foxa белка с хроматином объяснить способность Foxa делать гены компетентными к онтогнетической активации? Чтобы ответить на этот вопрос необходимо использовать in vitro систему реконституции хроматина, так чтобы хроматин-связывающая способность транскрипционных факторов происходила в изоляции от др белков. К сяастью, сейчас возможен reconstitute arrays нуклеосом на матрицах определенных последовательностей in vitro и condense the arrays для получения структур хроматина высшего порядка, которые мимикрируют структуры молчания (silent),компактного хроматина in vivo.
Condensed nucleosome arrays были использованы при исследовании оценки внутренней способности связывать хроматин очищенного белка Foxa2. Этот транскрипционный фактор в отличие от большинства др. взаимодействует со своими последовательностями-мешенями в высоко конденсированном хроматине и меняет структуру хроматина так, что локальный нуклеосомный домен становится открытым (exposed). Активность не нуждается в АТФ-зависимых ферментах, ремоделирующих хроматин, которые, по-видимому, необходимы для разрыхления хроматина для действительной транскрипции. Ранее было показано, что Foxa2 белок соедирняется стабильно со своим сайтом на nucleosome core particle, независимо от того, гипо- или гиперацетилированы подлежащие гистоны. Напротив, большинство др. транскрипционных факторов связывается преимущественно с геперацтилированными нуклеосомами, последние обычно ассоциированы с активными генами, тогда как гипоацетилированные нуелкосомы часто ассоциированы с неактивными генами. Кроме того было показано, что Foxa2 связывание м. облегчать хроматином обусловленную репрессию транскрипции гена in vitro. Эти результаты указывают на то, что Foxa факторы м. функционировать как белки-пионеры — первые белки, вызывающие молчание, обычно гипоацетилированного хроматина. В онтогенетическом контексте раннее связывание хроматина факторами Foxa должно обеспечивать компетентность активировать экспрессию генов, позволяя др. факторам связываться с хроматином, если они не м. связываться стабильно сами.
Directions for the future. Субкласс GATA zinc-finger транскрипционных факторов также важен для развития энтодермы metazoan и для экспрессии печень-специфических генов. Как и в случае Foxa, сайт оккупирования GATA находится в локусе albumin в дорсальной энтодерме, а очищенный (GATA binding protein 4) белок м. связываться с этим сайтом в конденсированном хроматине in vitro, хотя и более слабо, чем белок Foxa2. Возможно, что и др. классы транскрипционных факторов будут вести себя сходным образом.
Возможно ли предсказать онтогенетическую компетентность любой клетке предшественнице, определив состояние ее геномной occupancy разными транскрипционными факторами? Типы локусов, которые оккупированы, должны предсказывать программы клеточной дифференцировки, которые доступны клетке. Такой тест проводился на дрожжах Saccharomyces cerevisiae, у которых microarrays всех межгенных последовательностей с большинством регуляторных ДНК были использованы, чтобы исследовать клеточный хроматин, который фрагментировался и подвергался иммунопреципитации антителами к регуляторному белку. Дрожжевые гены, которые регулировались или обладали потенциалом быть регулиуемыми с помощью galactose, вывлялись. Значительно большее количество межгенных областей высших эукариот, купировано с небольшим количеством материала, который м.б. получен из популяций клеток-предшественников, это делает microarray (микромассивов) подход непригодным для эмбриологичских исследований. Однако, недавно клонированы и секвенированы scores мишеней-последовательностей из экспериментов по иммунопреципитации хроматина млекопитающих, показавшие пригодность этого подхода.
Specifying the hepatic lineage
исследования на модельных организмах показали, что энтодермальные домены обычно закладываются (patterned) за счет взаимодействий с покрывающей ее мезодермальной тканью. Классические трансплантации тканей показали, что кардиогенная мезодерма, которая временно соприкасается с проспективной печеночной энтодермой, испускает сигналы, которые важны для индукции печеночных предшественников в энтодерме.
Интересно, что на ранних стадиях энтодерма сама является важной для индукции кардиогенной мезодермы, а в период гепатогеной фазы энтодерма способствует даленейшему созреванию сердца. Такая реципрокная передача сигналов не является редкой и, по-видимому, важна для координации времени развития органа у эмбрионов.
Fgf signalling and hepatic induction. К сожалению, неизвестны мутации у какого-либо организма. которые блокируют инициальную индукцию печеночных клеток в энтодерме. Это сочетается с возможным перекрываением (redundant) сигналов и м.б. использовано для выявления лежащих в основе механизмов. В такой системе, вентральная энтодерма передней кишки и кардиогенная меходерма выделялись из мышиных эмбрионов и культивировались in vitro в условиях, которые пермиссивны для печеночной индукции. Система использовалась, чтобы показать, что ингибиторы передачи сигналов fibroblast growth factor (Fgf) блокируют печеночную индукцию кардиогенной мезодермой. Было также показано, что при низких концентрация воздействие только Fgf индуцирует экспрессию ранних гепатических генов в энтодермальных эксплантах, культивируемых вместе с кардиогенной мезодермой. Эти эксперименты показали, что передача сигнало Fgf от кардиогенной мезодермы индуцирует печень в вентральной энтодерме передней кишки (Рис. 2).
Во время печеночной индукции кардиогенная мезодерма экспрессирует, по крайней мере, 3 из 18 известных Fgfs, а вентральная энтодерма передней кишки экспрессирует, по крайней мере, 2 из 4 tyrosine kinase Fgf receptors. Мыши с нулевыми мутациями по индивидуальным компонентам этого сигнальноо пути или летальны перед печеночной индукцией или имеют минимальный фенотип, согласующийся с функиональным перекрыванием этих молекул.
Additional hepatogenic signalling.
Перед печеночной индукцией проспективная мезенхимные клетки окружают развивающуюся кардиальную область вблизи вентральной энтодермы передней кишки. Клетки поперечной перегородки (septum transversum mesenchyme (STM)), которые происходят из , начинают привлекать все больше внимания как важный источник сигналов различных эмбриологических сигнальных путей и как предшественник сердца. Более того клетки STM присутствовали в типичных эксплантатах кардиогенной мезодермы и вентральной энтодермы переденй кишки.
Bone morphogenetic proteins 2 и 4 ( and ) строго экспрессируются в STM перед и во время печеночной индукции before and during hepatic induction (Рис. 2), а делеция Bmp4 нарушает развитие различных вентральных структур эмбриона. Bmps являются членами семейства Tgf-β сверхесмейства секретируемых сигнальных молекул и они, вместе с Fgfs, выполняют множественные морфогенетические роли в развивающемся эмбрионе. Хотя индукция печеночных генов происходит нормально в вентральной энтодерме передней кишки Bmp4-гомозиготных мутантных эмбрионов, инициальная индукция печеночных генов ингибирована в вентральных эксплантатах переденей кишки после обработки ингибиторами Bmp, . Добавление Bmp2 или Bmp4 снова к ингибированным noggin эксплантатам восстанавливает индукцию печеночных генов. Это согласуется с предположением о перекрывании Bmp сигнальных путей, критическом для гепатогенеза, усиливающим компетентность энтодермы к формированию печени. Это также хороший пример отдельных сигнальных путей (Bmp and Fgf), исходящих из разных мезодермальных источников (STM и кардиогенной мезодермы), чтобы предопределить домен энтодермы и индуцировать определенную ткань — в данном случае, печень.
Cell-type choice: liver versus pancreas.
Далее было установлено, что изолированная вентральная энтодерма передней кишки не остается недифференцированной, если культивируется без кардиогенной мезодермы или без Fgf. Скорре всего она инициирует экспрессию панкреатических генов, как самопроизвольную (default) программу. Fgf или кардиогенная мезодерма супрессруют панкреатическую программу в энтодерме, т.к. она индуцирует печеночную программу и не ведет к избирательной гибели или избытоному росту outgrowth of a предполагаемой клеточной субпопуляции, которая должна стать печеночной. Напротив, noggin усиливает экспрессию панкреатических генов в вентральных эксплантатах передней кишки, супрессируя экспрессию печеночных генов, это согласуется со скоординированной паттерн-формирующей ролью Bmps с Fgfs. Имеющиеся данные согласуются с гипотезой, что вентральная энтодерма передней кишки состоит из популяции мультипотентных клеток, которые осуществляют выбор во время формирования пространственного паттерна. Клетки вентральной энтодермы дистальные по отношению к кардиальному Fgf signalling принимают самопроизвольнопанкреатическую судьбу, тогда как клетки проксимальные к такому источнику сигналов выбирают печеночную судьбу (Рис. 2).
Панкреатическая экзокринная секреция как и печеночная направлена на перваривание пищи, а панкреатические эндокринные гормоны регулируют метаболизм. Многие беспозвоночные содержат кишечный дивертикул — слепой отросток кишки — который содержит клетки или с печеночными или панкреатическими функциями, а примитивные позвоночные содержат , которые окружают печеночный дивертикул, указывая тем самым на родственное эволюционное происхождение тканей.
Hepatocytes from non-liver cells during tissue injury.
Панкреатические экзокринные клетки обнаруживаются в печени в клинических случаях . Когда индуцируются повреждения поджелудочной железы у крыс определенными токсинами, то гепатоциты м. появляться и в поджелудочной железе. Когда генетически маркированные панкреатические клетки трансплантируются в печень др. мышей, то печеночное окружение м. привести к тому, что некоторая доля трансплантированных клеток будет развиваться в гепатоциты. Наконец, трансгенная экспрессия Fgf в поджелудочной железе мышей ведет к развитию в ней гепатоцитов. Однако, остается неясным трансдифференцируются ли клетки из одного типа в др. или дифференцируются de novo из клеток подобных стволовым, которые м. существовать в каждом взрослом органе. Было установлено, что субклон панкреатической клеточной линии м. дифференцироваться из индивидуальных клеток с характеристиками в клетки с печеночными характеристиками, что согласуется с моделью трансдифференцировки.
Directions for the future.
Чтобы понять роль передачи сигналов Fgf в печеночной индукции in vivo, необходимо иметь двойные (или множественные) и индуцибельные нулевые мутациив Fgf- и Bmp-signalling компонентах. Дальнейшие исследования путей tyrosine-kinase-activated и BMP-signalling в клетках вентральной энтодермы позволит установить, как панкреатическая онтогенетическая программа репрессируется, тогда как печеночная индуцируется. Как действуют такие сигналы, типа (Wingless-type MMTV integration site), и др, на пре-паттерн энтодермальных транскрипционных факторов, которые экспрессируются в вентральной части передней кишки приводя ультимативно к выбору определенного клеточного типа? Каковы энзимы, ограничивающие модификацию гистонов, хроматин-ремоделирующие комплексы и транскрипционные ко-активаторы, которыя являтся предварительным условием для транскрипционной активации печеночных генов?
Growth of hepatic endoderm into a liver bud
Исследования на эмбрионах кур выявили вторую стадию печеночной индукции — она осуществляется, когда производные мезодермы клетки в поперечной перегородкеспособствуют росту и дальнейшей дифференцировке внось специфицированной печеночной энтодермы (Рис. 3). Поперечная перегородка предопределяет область полости тела эмбриона, в которую будет расти печеночный зачаток. Она заполняется рыхло соединенными мезенхимными клетками в среде, богатой коллагеном. Клетки STM м. давать печени, такие как , хотя точные клональные взаимоотношения не установлены. Некоторые мутации у мышей, которые затрагивают только STM или формирующуюся печеночную энтодерму, также влияют и на рост формирующегося зачатка печени, обнаруживая некоторые дискретные морфогенетические ступени этой стадии развития.
Hex: earliest known effector of developing liver.
Две мутации, которые специфичны для печеночной энтодермы и имеют самые ранние из известных эффектов на морфогенз печеночного зачатка затрагивают локусы Hex (also known as Hhex, haematopoietically expressed homeobox) и Prox1 (prospero-related homeobox 1), кодирующие гомеодоменовые транскрипционные факторы. Hex у мышей экспрессируется в передней висцеральной энтодерме и передней дефинитивной энтодерме передней кишки перед печеночной и панкреатической индукцией. Во взрослых тканях разных позвоночных Hex экспрессируется в печени, щитовидной железе и эндотелиальных клетках и действует как репрессор транскрипции.Гомозиготная инактивация Hex ведет к эмбриональной летальности у мышей с дефектами в переднем мозге — которые очевидно обусловлены дефицитом получения сигналов от энтодермы — а также с аномалиями развития печеночного и тироидного зачатков. Относительно печеночного домена энтодерма обнаруживает нормальный столбчатый вид на ст. E8.5 (Рис. 3), но клетки неспособны пролиферировать в мезенхиму поперечной перегородки, так что на ст. E9.5 не обнаруживается признаков печеночного зачатка. Не удается обнаружить доказательств активации печеночных генов у Hex-/- эмбрионов на ст. E9.5, это м.б. обусловлено потерей или растворением клеток, т.к. активация печеночных генов выявляется на ст. E8.5. В целом, Hex, по-видимому, необходим для самых ранних ступеней возникновения зачатка печени.
Prox1 in cell–cell interactions and ECM remodelling.
Prox1-нулевой фенотип указывает на то, что Prox1 транскрипционный фактор действует непосредственно после Hex в печеночном морфогенезе. У эмбрионов Prox1-/-инициальная экспрессия печеночных генов индуцируется, печеночная энтодерма проходит стадию столбчатых клеток и клетки начинаю пролиферировать. Однако, на ст. E9.5 (~26-сомитов), albumin-позитивные гепатобласты не способны мигрировать в мезенхиму поперечной перегородки и остаются плотно упакованными вокруг кишечной трубки. Печеночные клетки мутантов Prox1 экспрессируют заметный избыток и белков базальных мембран laminin и . У эмбрионов дикого типа, значительно меньше E-cadherin обнаруживается в зачатке печени, а белки базальной мембраны исчезают, когда гепатобласты мигрируют в STM. У мутантов Prox1 гепатобласты, по-видимому, склеиваются вместе из-за слишком большого количества кадхерина, который способствует гомотипическим межклетоным взаимодействиям в эпителии, и клетки оказываются неспособными перемещаться из-за недостаточного ремоделирования клеточного матрикса. Сходные фенотипы обнаруживаются в других органных сайтах у этих мутантов. В зачатке печени, это ведет к остановке пролиферации.
Важность взаимодействий extracellular matrix (ECM) в развитии печени подчеркивается неспособностью -дефицитных гепатоцитов колонизировать печень. β1-integrin является частью гетеродимерных рецепторов для laminins и collagens,среди др. ECM белков. Итак, Prox1 мутанты выявляют события, которые необходимы для физическогоо разрыва печеночного энтодермального эпителия, которые позволяют клеткам мигрировать в STM (Рис. 3).
Distinct hepatic growth signals from the STM.
Различные мутации с фенотипами, специфичными для клеток STM обкусловливают неспособность печеночной энтодермы эффективно пролиферировать, когда должен происходить рост печеночного зачатка. Такие фенотипы выявляются за пределами стдадии, на которой функционирует Prox1, впервые выявляется этот класс мутаций у мышей около ст. E9.5–E10.5. Если мутации затрагивают и некоторые др. ткани, то такие эмбрионы гибнут от анемии на ст. E13.5–E15.5, из-за недоразвития печени, неспособной поддерживать гематопоэз.
Bone morphogenetic proteins.
Bmps продуцируют важный для роста STM сигнал. Анализ Bmp4гомозиготных мутантных эмбрионов показал, что на ст. E9.5, после индукции печеночных генов, происходит задержка роста зачатка печени. Однако, когда дикого типа эксплантаты вентральной энтодермы переденей кишки, кардиальной мезодермы и клеток мезенхимы септум трансверзум культивируются в присутствии ингибитора Bmp, noggin, то не обнаруживается эффекта на рост печеночной энтодермы in vitro. Сходным образом, эксплантаты от эмбрионов, гомозиготных по Bmp4-нулевому аллелю имеют нормальный печночный рост. Однако, когда гомозиготные или гетерозиготные по мутантному Bmp4 эксплантаты культивируются в присутствии noggin, то рост печеночной энтодермы сильно ингибирован. Очевидно noggin неспособен связываться со всеми Bmp2 и Bmp4 в относительно толстых тканевых эксплантатах и генетическое удаление, по крайней мере, одного из Bmp помогает noggin осуществлять функциональное ингибирование.
Hlx, Hgf, c-Met and Tgf-β.
На ст. E14.5 печень обычно довольно большая, васкуляризована и является гематопоэтическим органом, ноу (H2.0-like homeobox gene)-нокаутных мышей, E14.5 печень это лишь маленькая почка. Архитектура печеночного рудимента кажется нормальной у Hlx-/- эмбрионов, с соотв. балансом гепатобластов, эндотелиальных клеток и гематопоэтических клеток. Не обнаруживается доказательств апоптоза в Hlx-/- печени. Т.к. Hlx специфичен для STM, то гомеодоменовый белок Hlx, по-видимоу, позитивно регулирует синтез для роста гепатобластов.
Hepatocyte growth factor () экспрессируется в STM, a (Hgf рецептор) экспрессирутся в гепатоцитах. Инактивация любого из этих генов вызывает гипоплазию печени и последующую анемию. В отличие от Hlx-/- мутантов, апоптоз гепатобластов лежит в основе мутантных фенотипов Hgf и c-Met. Кроме того мутанты Hlx-/- имеют более тяжелый фенотип, чем Hgf мутанты, указывая тем самым, что Hlx м. активировать разные или дополнительные факторы роста. Трансгенная экспрессия укороченного постоянно активного c-Met в печени защищает клетки от апоптических стимулов, подтверждая анти-апотиическую роль Hgf сигналов.
Одновременная, гетерозиготная инактивация и Smad2 и , которые являются транскрипционными медаторами Tgf-β signalling, вызывает гипоплазию печени плода. Давно известно, что Tgf-β ингибирует пролиферацию взрослых гепатоцитов, это иллюстрирует как индивидуальные сигнальные молекулы м. вызывать продивополжные эффекты на разных стадиях развития или при комбинировании с разными факторами. Интересно, что добавление Hgf к Smad2+/-, Smad3+/- мутантным печеночным эксплантатам восстанавливает их рост in vitro, указывая, что Hgf и Тgf-β предоставлют параллельно сигналы роста. Hgf восстанавливает уровни integrin-β1, которые депрессированы в Smad2+/-, Smad3+/- печени. Следовательно, имеются различные пути для STM-зависимого роста печеночного зачатка и, по крайней мере, некоторые из них конвергируют в контроле integrin-β1 уровней и во взаимодействиях с внеклеточным матриксом.
Apoptosis, necrosis and generation of tissue
architecture.
Мутации многих генов, которые кодируют компоненты сигнальной трансдукции и транскрипционные факторы, вызывают апоптоз ранних гепатоцитов; сюда входят компоненты путей (Kirsten rat sarcoma oncogene), (Mkk4/Jnkk, mitogen-activated protein kinase kinase 4), , CREB (cyclic-AMP-responsive element binding protein)/ATF (activating transcription factor)-related protein (X-box binding protein 1) и nuclear factor-κβ
(NF-κβ). Если мыши, мутантные по tumour-necrosis factor (Tnf) или его рецептору, скрещиваются с background мутанатaми компонетов пути Nf-κβ, то печень развивается нормально, показывая тем самым, что Nf-κβ защищает против эмбриональных Tnf стимулов апоптоза. Гомозиготные мутации по гену phosphoinositide-3-kinase вызывают некроз гепатоцитов, а не апоптоз, и , следовательно, Pik3r1 функционирует в др. пути нежели Tnf/Nf-κβ.
Это указывает на то, что зачаток печени содержит различные ингибирующие сигналы, которые м. противодейстовать росту массы печени. Возможно, что локальные негативные сигналы роста являются критическими для создания формы примордия печени в функционьную ткань.
Directions for the future.
Важным вопросом для этой фазы развития является, как транскрипционные факторы способствуют росту гепатобластов в ответ на сигналы STM. Транскрипционные факторы м. индуцировать экспрессию генов сигнальной трансдукции и генов циклинов или cyclin-dependent kinases (Cdks), которые усиливают скорость пролиферации и обеспечивают рост зачатка печени. Напр., необходим для роста эпителия сетчатки и молочных желез, тогд как необходим для роста клеток островков поджелудочной железы. Важно также знать как структура клеток приобретает столбчатую форму, как разрываютс межклеточне взаимодействия и о событиях, ремоделирующих ECM, которые критические для вновь специфицированных печеночных клеток, чтобы отсоединиться от энтодермального эпителия — процесс, который ведет к образованию зачатка печени.
Coordination with vascular development
Все оргнаы нуждаются в соединении с соудистой сетью (vasculature). Для печени, которая служит местом гематопоэза в средине беременности, развитие сосудов существенно. Во взрослой печени гепатоциты непосредсвенно соседствуют с , который позволяет гепатоцитам общаться непосрественно с кровотоком. Взрослые гепатоциты и эндотелиальные клетки образуют нечто, что в общем обозначается как пластинки клеток, которые распространяется от и печоночной артерии к печеночной вене. Эндотелиальные клетки. как известно существуют в или вокруг зачатка печени на ст. E9.5, это согласуется с ожиданием, что развитие кровеносных сосудов будет скоординировано с развитием гепатоцитов. Нулевые мутации класса gp130 сигнальных рецепторов показали, что после образования печеночных кровеносных сосудов, присутсвующие гематопоэтические клетки стимулируют дальнейший рост печени. Однако стало известно, что эндотелиальные клетки до формирования функциональных сосудов продуцируют очень ранне ростовые сигналы, вообще даже раньше, чем сигналы поступают от STM.
Endothelial cells in liver-bud emergence.
Ангиобласты, которые являются предшественниками функциональных эндотелиальных клеток, обнаруживаются в посредничестве между утолщенной гепатической энтодермой и окружающей STM, еще до пролиферации гепатоцитов и инвазии в поперечную перегороду (Рис. 3). Эти ранние эндотелиальные клетки становятся перемешанными с гепатобластами, когда последние начинают формировать зачаток печени; они также. по-видимому, ограничивают STM домен, в который будут расти гепатобласты. Многие мутации у мышей нарушают позднее развитие эндотелиальных клеток, но (известная также Kdr, kinase insert domain protein receptor) мутация блокирует формирование сосудов на ангиобластной стадии с последующей летальностью на ст. E9.5–E10.5. Flk1 — ген, который экспрессируется в предшественниках эндотелиальных клеток и в их производных — кодирует рецептор для vascular endothelial growth factor 2 (Vegfr2). Образование печеночных зачатков полностью блокируется у мышей, гомозиготных по Fflk1-нклевому аллелю — клетки блокируются после индукии печеночных генов, но преждк инвазии в STM. Установлена роль Flk1-зависимых эндотелиальных клеток в спецификации гепатобластов, но не клеток STM. Итак, эндотелиальные клетки продуцируют критические ростовые стимулы для печеночного зачатка еще до того как будут сформированы локальные сосуды, поставляющие кровяные клетки и кислород.
Открытие органогенной роли эндотелиальных клеток распространяется и на др. ткани, производные кишки. Напр., взаимодействия между клетками дорсальной энтодермы и развивающейся аортой являются критическими для развития дорсальной панкреас. Эти взаимодействия способствуют дифференцировке панкреатических клеток и их росту. Анализ E10.5 мышиных эмбрионов выявил присутствие ангиобластов в начале тканевого развития зачатков легких и железистой части желудка.
Directions for the future.
Неясно рекрутируют ли гепатобласты ангиобласты из др. мест эмбриона или индуцируют их из соседних STM клеток? Каковы молекулярные сигналы исходят из эндотелиальных клеток, которые способствуют печеночному росту? Способствуют ли эндотелиальные клетки печеночной дифференцировке? Т.к. сосудистая архитектура отлична в каждом органе, то где и как м. взаимодействия между эндотелиальными и энтодермальными клетками дивергировать, вызывая различия в морфогенезе разных тканей? Наконец, обнаружены белки клеточной поверхности, экспрессируемые в эндотелии опухолей у взрослых и в печени плода, но не в обычных тканях у взрослых. Интересно было бы определить степень, с которой эндотелиальные морфогенетические события, которые критичны для органогненеза, воспроизводятся во время образования опухолей.
Division of hepatocyte and biliary lineages
Исследования экспрессии генов-маркеров показали, что ~ E13.5, субнабор ранних гепатобластов начинает давать cholangiocytes или клетки для желчных протоков. В зрелой печени, гепатоциты секретируют желчь в canaliculi, которые являются небольшими протоками, которые выстланы апикальной поверхностью соседних гепатоцитов. Сanaliculiсоединяются с протоками. которые выстланы cholangiocytes, и протоки эти несут желчь в желчный пцзырь для хранения.
Transcriptional cascade for biliary development.
The one-cut homeodomain transcription factor (hepatic nuclear factor 6) экспрессируется в ранней печени, в печеночных желчных протоках и желчном пузыре.У гомозиготных Hnf6-нулевых мутантов желчный пузырь отсутствует и печеночные желчные протоки очищаются недостаточно. Кроме того на ст. E13.5 обнаруживается больше клеток, которые экспрессируют ранние желчные маркеры, которые указывают на избыточную желную детерминацию из гепатобластов. Итак, Hnf6 по-видимому, ограничивает степень предопределения желчных клеток, а также контролирует морфогенез желчных протоков. Сходные морфологические нарушения обнаруживаются у эмбрионов, которые условно гомозиготны по homeodomain transcription factor Hnf1b (известному также как Tcf2, transcription factor 2) — эти эмбрионы обнаруживают также дисплазию эпителия крупных внутрипеченочных желчных протоков и желчного пузыря. Аномальный эпителий желчных протоков в печени мутантных Hnf1β эмбрионов, купирован с экспрессией Hnf1b в панкреатических экзокринных протоках и почечных канальцах нормальных эмбрионов, это указывает на то, что транскрипционный фактор м. в целом контролировать развитие эпителиальных канальцев во время органогенеза.
Т.к. Hnf1b не обнаруживается в желчном эпителии Hnf6-/- эмбрионов, по крайней мере, вплоть до рождения и т.к. Hnf6 трансактивирует Hnf1b промотор, то кажется, что транскрипционный каскад от Hnf6 к Hnf1β контролирует развитие желчных протоков (Рис. 4). Хотя сигналы. которые м. инициировать этот каскад, неизвесны, но показано, что экспрессия forkhead транскрипционного фактора , в STM является критической для развития внепеченочных желчных протоков и желчного пузыря. Очевидно, Foxf1 контролирует экспрессию фактора в STM, который способствует развитию внепеченочных желчных протоков, возможно супрессируя активность Hnf6/Hnf1β пути в гепатобластах.
Fetal liver cell lines to study the hepatic–biliary
split.
Использование клеточных линий из печеночных опухолей предоставляет определенные преимущества. Изолированные дедифференцированные и редифференцированные варианты гепатомных линий используются для определения, какие характерные для печени факторы коррелируют или предсказывают состояние печеночной дифференцировки. Так, линии E14 клеток печени плода иммортализованы с помощью экспрессии трансгена укороченного c-Met. Некоторые из клонированных линий обнаруживают т. наз. 'palmate' фенотип — они выглядят подбно фибробластам и являются недифференцированными по отношению к печеночным характеристикам. Эксперименты по клонированию одиночных клеток показали, что обработанные Fgf или dimethyl sulphoxide, эти palmate клетки м. давать эпителиальные клетки. которые экспрессируют функции гепатоцитов. Если же они культивируются на Matrigel, желатинозном субстрате, который содержит белки базальных мембран ECM, то palmate клетки образуют четкие проток-подобные структуры с желчными характеристиками. Следовательно, печёноночные клетки плодов м. давать и гепатоциты и клетки желчных протоков.
Directions for the future.
Важно определить точные клональные взаимоотношения между гепатоцитами и желчными клетками у эмбрионов. Существуют ли такие недифференцированные, bipotential клетки в норме в печени плодов или palmate клетки дедифференцированые варианты гепатоцитов или желчных клеток? Хотя и показано, что желчные клетки происходят из гепатобластов, которые первоначально экспрессируют маркеры гепатоцитов, но строгие генетические исследования клонов панкреатических клеток показали, что ранние клетки, которые экспрессируют и и insulin не являются предшественниками α- и β-клеток во взрослой поджелудочной железе. Это демонстрирует трудности использования паттернов экспресси ко-маркеров.
Hepatocyte differentiation after
haematopoiesis
На ст. E17, гепатоциты приобретают свою характеруню кубовидную форму. на этой стадии они отовятся к переходу от гематопоэтической роли к становлению первичных клеток для контроля уровней многих метаболитов и сывороточных белков в кровотоке. Во время этой перинатальной фазы гепатоциты начинают экспрессировать много новых генов под контролем транскрипционного фактора (CCAAT/enhancer binding protein-α). Они формируют также клеточные соединения, которые необходимы для создания поляризованного эпителия, с апикальной клеточной поверхностью, секретирующей желчь, и базальной клеточной повехностью, располагающейся рядом с эндотелиальными клетками. Гепатоциты, следовательно, делают переход от эпителия (печеночной энтодермы) к непояризованному клеточному фенотипу (гепатобластам) и затем снова к эпителию.
HNF4 control of hepatocyte differentiation.
член сверхсемейства ядерных рецепторов транскрипционных факторов, впервые выявлен в ядрах печени. Гомологи Hnf4 обнаружены у разных организмов от млекопитающих до мух. Гомозиготная инактивация гена Hnf4 у мышей вызывает раннюю эмбриональную летальность до гаструляции. Дефект специфичен для (visceral endoderm) и это подчеркивает важность этой ткани для ранего развития. Интересно, что многие из генов желточного мешка, которые не способны быть активированы в Hnf4-/- висцеральной энтодерме, обычно экспрессируются в дифференцированных гепатоцитах, это указывает на общие регуляторные роли обеих тканей. В самом деле, тетраплоидные химеры с Hnf4-/- ES клетками, чтобы преодолеть внеэмбриональные дефекты, показывают. что Hnf4 обязателен для дифференцировки гепатоцитов. Многие гены зрелых гепатоцитов неспособны активироваться у этих мутантов, включая и те. что кодируют apolipoproteins, сывороточные факторы и метаболические энзимы. Пока только два транскрипционных регулятора и (известный также как Nr1i2; nuclear-receptor subfamily 1, group I, member 2) выявлены, показывающие, что Hnf4 на самом деле отмечает терминальную фазу дифференцировки гепатоцитов (Рис. 4). Часть последнего регуляторного каскада выявляется изучением линий гепатомных клеток, которые показали, что Hnf4 активирует промоторHnf1a (Рис. 4).
Дополнительные данные о роли Hnf4 полдучены при изучении клеточных культур. Когда Hnf4 трансфицируется в дедифференцированные гепатомные клетки с фибробласной морфологией, то стабильные трансфектанты приобретают эпителиальную морфологию, характерную для гепатоцитов. Хотя морфология Hnf4-нулевых гепатоцитов не изменяется, тетраплоидные химеры не растут за пределами ст. E12–E14, когда гепатоциты начинают обычно принимать более дифференцированную морфологию. Hnf4 м. представлять один из нескольких механизмов, которые гарантируют дифференцировку эндотелиальных клеток во время развития.
Directions for the future.
принимая во внимание мощную эпителиальную морфогенетическую активность Hnfα в трансфицированных клеткаъ, интересно было бы инактивировать Hnf4в печени плодов, чтобы установить его функцию в контроле органной морфологии. Недавно получен кондициональный нулевой аллель Hnf4, но его влияние на развитие еще не проанализировано.
