Bokoch и др. отметили, что иногда, когда происходит избыточная экспрессия укороченного GEF-H1, то также возникают заметные изменения клеточной морфологии, включая образование актиновых стрессовых волокон (рис.: акин показан красным, а избыточно экспрессирующийся укороченный GEF-H1 зеленым. Scale bar, 20 μm). Они нашли, что nucleotide-exchange активность необходима для этого эффекта, также как и нижестоящий эффектор, специфичный для передачи сигналов Rho. Когда они проверяли способность укороченной конструкции GEF-H1 активировать нижестоящую передачу сигналов in vivo, то они выявили строгую корреляцию между способностью конструкции локализоваться на микротрубочках и снижением способности активировать Rho. Они предположили, что ассоциация GEF-H1 с микротрубочками каким-то образом меняет активность GEF-H1. Кроме того они установили, что деполимеризация микротрубочек, напр., nocodazole, достаточна, чтобы запустить эндогенную передачу сигналов Rho — эффект, который нуждается в GEF-H1. дикого типа
Как соединение с микротрубочками снижает активность GEF-H1 activity неясно, но интересно знать, является ли это общим механизмом, гаранитирующим координацию между между соседними цитоскелетными сетями. Авт. полагают, что он важен для цитокинеза, когда актин-зависимая борозда дробления должна сформироваться по центру, базирующегося на микротрубочках веретена.
Регуляция актинового цитоскелета с помощью микротрубочек обеспечивается Rho семейством GTPases. Установлено, что Rho guanine nucleotide exchange factor (GEF)-H1 регулируется за счет взаимодействия с микротрубочками. Мутанты GEF-H1, которые неспособны связывать микротрубочки обнаруживают более высокие уровни активности, чем связанные с микротрубочками формы. Эти мутанты кроме того вызывают Rho-зависимые изменения в морфологии клеток и организацмм актина. Более того индуцированная лекарствами деполимеризация микротрубочек вызывает изменения в морфологии клеток и экспрессии генов, которые сходны с изменениями, индуцируемыми экспрессией активных форм GEF-H1. Кроме того, эти эффекты ингибируются с помощью доминантно-негативныхй версий GEF-H1. Следовательно, GEF-H1 связывают изменения в интегральности микротрубочек с Rho-зависимой регуляцией актинового цитоскелета.
Миграция клеток важна для многих физиологических процессов. Миграция клеток подкрепляется актиновым цитоскелетом, полимеризацией актина, управляющей выпячиванием ведущего края и акто-миозиновой контрактильностью, способствующей перемещению тела клетки. Хотя микротрубочки непосредственно не участвуют в генерации сил, управляющих клеточной миграцией, но потеря микротрубочек препятствует направленному движению клеток , следовательно, они м. участвовать в регуляциии актин-зависимой подвижности. Помимо влияния на полимеризацию актина микротрубочки м модулировать также организацию актиновых филамент и контрактильность миозина в теле клетки.
GEFs, мышиная Lfc и ее человеческий гомолог GEF-H1, и p190RhoGEF относятся к семейству Dbl Rho активаторов и содержат характерные тандемные образования, Dbl homology (DH) домен и pleckstrin homology (PH) домен. В работе представлены экспериментальные доказательства того, что GEF-H1 ответственна за регуляцию активности Rho в ответ на деполимеризацию микротрубочек.
(Рис.1.) | GEF-H1 constructs and their localization.
Effects of GEF-H1 on cell morphology and actin organization.
(Рис.2.) | Changes in cell morphology and actin organization induced by the expression of GEF-H1 constructs.
(Рис.3.) | The in vitro guanine nucleotide exchange activity of GEF-H1.
Activation of Rho family GTPases by GEF-H1 in vivo.
(Рис.4.) | Activation of Rho by GEF-H1 constructs in vivo.
GEF-H1 mediates the effects of microtubule depolymerization on Rho activity and cell morphology.
(Рис.5.) | The effect of microtubule depolymerization on SRE activation and cell shape.
(См , на Рис. S1).
(Рис.1.) | GEF-H1 constructs and their localization.
Effects of GEF-H1 on cell morphology and actin organization.
(Рис.2.) | Changes in cell morphology and actin organization induced by the expression of GEF-H1 constructs.
(Рис.3.) | The in vitro guanine nucleotide exchange activity of GEF-H1.
Activation of Rho family GTPases by GEF-H1 in vivo.
(Рис.4.) | Activation of Rho by GEF-H1 constructs in vivo.
GEF-H1 mediates the effects of microtubule depolymerization on Rho activity and cell morphology.
(Рис.5.) | The effect of microtubule depolymerization on SRE activation and cell shape.
(См , на Рис. S1).
В работе проанализирована регуляция и функция GEF-H1, a microtubule-associated nucleotide exchange фактора, который является членом семейства Dbl. Установлено, что делеция N- или C-терминальной части GEF-H1 ведет к потере локлаизации микротрубочек, указывая тем самым, что эти области м. участвовать во взаимодействии с микротрубочками и/или MAPs. Однако, изолированные N- или C-терминальные области не локализуют микротрубочки, указывая, что комбинация белковых доменов необходима для связывания микротрубочек. Известно, что PH домен Lfc мыши связывается с тубулином. Однако, не выявлено взаимодействия между изолированным PH доменом GEF-H1 и тубулином или микротрубочками. Поэтому неясно, участвует ли PH домен GEF-H1 в связывании микротрубочек. Инактивации N-терминального zinc finger домена GEF-H1 достаточно для индукции потери локализациии микротрубочек. Следовательно, zinc finger домен м. играть важную роль во взаимодействии GEF-H1 с микротрубочками.
Экспрессия GEF-H1 конструкций, дефицитных по связыванию микротрубочек, вызывают изменения в морфологии клеток, включая клеточную ретракцию и образование актиновых стрессовых волокон. Это напоминает изменения, индуцируемые постоянно активной RhoA и подтверждают, что экспрессия non-microtubule-associated GEF-H1 вызывает активацию RhoA. Показано, что GEF-H1способстввует обмену нуклеотидов на RhoA, но не Rac или Cdc42 (Рис. 3). Подтверждено, что GEF-H1 активируется RhoA, но не Rac1, в клетках, экспрессирующих GEF-H1 конструкции. Следовательно, GEF-H1 является фактором обмена нуклеотидов для Rho. Это подтверждается и тем, что эффекты GEF-H1 на морфологию клеток и экспрессию генов опосредуются Rho, но не Rac или Cdc42.
Хотя все GEF-H1 конструкции имеют сходную guanine nucleotide exchange активностьin vitro, версии GEF-H1, дефицитные по связыванию микротрубочек, были более активны в обеспечении экспрессии SRE и реорганизации актина in vivo. Следовательно, потеря способности связывания микротрубочек индуцирует активацию GEF-H1. Альтернативным объяснением м.б. то. что N- и C-концы GEF-H1 м. функционировать вместе как аутоингибирующий модуль и что удаление этих областей устраняет ацтоингибирование. Однако, это кажется маловероятным, т.к. укороченные и интактные GEF-H1 конструкции обладают одинаковой активностью in vitro. В соответствии с нашей гипотезой, что связывание микротрубочек (или непосредственно или через ассоциированный белковый компонент) подавляет активность GEF-H1, деполимеризация микротрубочек способствует экспрессии SRE репортернго гена и меняет клеточную морфологию идентично той, что индуцируется активным GEF-H1 фактором. Эффекты деполимеризациии микротрубочек ингибируются с помощью RBD и GEF-H1(DHmut). Хотя GEF-H1(DHmut) способен функционировать доминантно-негативным способом в сигнальном пути, активируемом деполимеризацией микротрубочек , он не ингибирует SRE активацию, которая обеспечивается с помощью Dbl или постоянно акт ивного Gα12 и Gα13, которые функционируют через др. Rho GEFs, такие как p115RhoGEF или PDZ RhoGEF. Установлено, что GEF-H1(DHmut) лишь слабо связывается с RhoA, чего недостаточно, чтобы осуществить его доминантно-негативный эффект просто за счет секвестрации Rho. Следовательно, доминантно-негативный эффект GEF-H1(DHmut), по-видимому, специфичен для активации Rho, индуцируемой разборкой микротрубочек, которая активрует сигнальный путь с участием GEF-H1 и Rho.
Регуляция активности GEF-H1 путем ассоциации с микротрубочками представляет механизм модуляции активности Rho в ответ на изменения в динамике микротрбуочек. Деполимеризация микротрубочек м активировать Rho благодаря увеличению количества сбвободного, активного GEF-H1, тогда как сборка микротрубочек подавляет Rho за счет секвестрирования и инактивирования GEF-H1 (Рис. 6).
(Рис.6.) | A model for the regulation of GEF-H1 activity by microtubules
Этот регуляторный механизм м.б. важным в процессе, который влияет на координацию активностей актина и системы цитоскелетных микротрубочек, таких как направленная миграция клеток и цитокинез. В мигрирующих клетках, деполимеризация микротрубочек м. локально активировать Rho в теле клетки, обусловливая высокую активность myosin II и т.о. способствуя ретракции хвоста клетки во время локомоции. С др. стороны, превалирование растущих микротрубочек вблизи ведущего края должно снижать Rho активность во фронте клеток, делая возможной экспансию ведущего края , котороф не будет препятствовать контрактильность миозина. Инактивация GEF-H1 с помощью полимеризации микротрубочек м. также служить молекулярной основой для механизма, с помощью которого митотическое веретено определяет позицию акти-миозиновой борозды деления. Борозда всега располагается между двумя полюсами веретена, а модель 'astral inhibition' подтверждает, что присутствие растущих микротрбуочек вблизи полюсов веретена локально инактиврует миозин и способствует накоплению контрактильных акто-миозиновых ансамблей в месте наиболее удаленном от микротубулярных звезд. Т.к. цитокинез базируется на активности Rho, то кажется очень вероятным, что локальное ингибирование GEF-H1 или родственного белка с помощью астральных микротрубочек м. участвовать в предопределении места активности Rhoи контрактильности миозина в длелящихся клетках.
(Рис.6.) | A model for the regulation of GEF-H1 activity by microtubules
Этот регуляторный механизм м.б. важным в процессе, который влияет на координацию активностей актина и системы цитоскелетных микротрубочек, таких как направленная миграция клеток и цитокинез. В мигрирующих клетках, деполимеризация микротрубочек м. локально активировать Rho в теле клетки, обусловливая высокую активность myosin II и т.о. способствуя ретракции хвоста клетки во время локомоции. С др. стороны, превалирование растущих микротрубочек вблизи ведущего края должно снижать Rho активность во фронте клеток, делая возможной экспансию ведущего края , котороф не будет препятствовать контрактильность миозина. Инактивация GEF-H1 с помощью полимеризации микротрубочек м. также служить молекулярной основой для механизма, с помощью которого митотическое веретено определяет позицию акти-миозиновой борозды деления. Борозда всега располагается между двумя полюсами веретена, а модель 'astral inhibition' подтверждает, что присутствие растущих микротрбуочек вблизи полюсов веретена локально инактиврует миозин и способствует накоплению контрактильных акто-миозиновых ансамблей в месте наиболее удаленном от микротубулярных звезд. Т.к. цитокинез базируется на активности Rho, то кажется очень вероятным, что локальное ингибирование GEF-H1 или родственного белка с помощью астральных микротрубочек м. участвовать в предопределении места активности Rhoи контрактильности миозина в длелящихся клетках.
Авт. идентифицировли GEF-H1 как критический биосенсор, который связывает полимеризацию и контрактильность клеточного актина, чтобы изменять динамику микротрубочек. Эти данные подтверждают регуляторную модель, в которой динамика микротрубочек активно регулируется механизмами передачи клеточных сигналов, включая локальную активацию Rho GTPases. Вклад GEF-H1 в др. зависимые от микротрубочек сигнальые события и альтернативные механизмы регуляции активности GEF-H1 исследуются.
Авт. удалось восстановить локализаци микртрубочек у GEF-H1 zinc finger мутантов (GEF-H1C53R) путем слияния с областью, связывающей микротрубочки, у MAP2c. Хотя этот слитый белок обладает нормальной guanine nucleotide exchange активностью in vitro , его способность активировать экспрессию SRE-регулируемых генов in vivo существенно снижена, это говорит о том, что форсированное связывание микротрубочек вызывает снижение активности GEF-H1 в направлении Rho.
Сайт создан в системе uCoz