RECEPTOR DOWNREGULATION AND MULTIVESICULAR-BODY SORTING
David J. Katzmann (katzmann.david@mayo.edu), Greg Odorizzi, Scott D. Emr Nature Reviews Molecular Cell Biology3, No 12, P. 893-905 (2002)>
The sorting of proteins into the inner vesicles of multivesicular bodies is required for many key cellular processes, which range from the downregulation of activated signalling receptors to the proper stimulation of the immune response. Recent advances in our understanding of the
multivesicular-body sorting pathway have resulted from the identification
of ubiquitin as a signal for the efficient sorting of proteins into this
transport route, and from the discovery of components of the sorting and
regulatory machinery that directs this complex process.
(Рис.1.) | Receptor downregulation in mammalian and yeast cells.
(Рис.2.) | Regulation of cargo entry into the multivesicular-body sorting pathway.
(Рис.3.) | Ubiquitin-recognition by trans-acting components of the multivesicular-body sorting pathway.
(Рис.4.) | Multivesicular bodies in cellular physiology and disease.
(Табл.1) | Cargoes of the multivesicular-body sorting pathway in yeast and mammalian cells
Im, Y. J. et al. Structure and function of the ESCRT II-III interface in multivesicular body biogenesis. Dev. Cell 17 Aug 2009 (doi: 10.1016/j.devcel.2009.07.008) Article
Сортировка убиквитилированных грузовых белков, таких как трансмембранные рецепторы, в мультивезикулярные тела (эндосомы, заполненные intraluminal vesicles (ILVs)) катализируется с помощью аппарата ESCRT (endosomal sorting complex required for transport). ESCRT-0, ESCRT-I и ESCRT-II связывают грузовые белки, ESCRT-III ремоделирует мембрану, а комплекс Vps4-Vta1 обеспечивает рециклинг ESCRT-III поле отсоединения пузырьков. Физическая и функциональная связь между ESCRT-II и ESCRT-III является кардинальной, но плохо изучена. James Hurley с коллегами установили кристаллическую структуру комплекса, представленную минимальными взаимодействующими компонентами из ESCRT-II и ESCRT-III, и продемонстрировали функциональное значение этих взаимодействия для активации с помощью ESCRT-II с помощью ESCRT-III-обеспечиваемое отпочкование и отшнуровку пузырьков ILVs in vitro.
Авт. картировали взаимодействующие регионы ESCRT-II и ESCRT-III в отношении вторых winged-helix доменов ESCRT-II субъединицы человека VPS25 и первой спирали helix ESCRT-III субъединицы VPS20, и определили структуру комплекса с 2.0 A* разрешением. Мутации в кристаллографических взаимодействующих остатках устраняли связывание в растворе, подтверждая тем самым взаимодействие VPS25-VPS20. Анализ последовательностей показал, что взаимодействующие остатки в VPS25 и VPS20 очень консервативны от дрожжей до человека, это указывает на то, что разные виды имеют общий способ взаимодействия ESCRT-II-ESCRT-III.
Далее Hurley с коллегами показали. что грузовые белки неправильно сортируются у линий дрожжей, которые экспрессируют дефектные по связыванию мутантные VPS20 илиr VPS25. Это указывает на то, что ESCRT-II-ESCRT-III взаимодействие существенно для сортировки грузовых белков. Напротив, связывание ESCRT-II не нужно для рекрутирования ESCRT-III на мембраны эндосом у дрожжей. Это наблюдение подтверждает исследования in vitro с использованием липосом, которые показали, что ESCRT-II и VPS20 соединяются независимо с липосомами с наномалярным сродством.
В лаб. Hurley был разработан подход к восстановлению in vitro ESCRT-III-обусловленного отпочкования и отшнуровывания ILV в гигантские unilamellar пузырьки (которые напоминают мультивезикулярные тела), используя очищенные дрожжевые компоненты ESCRT-III. Теперь они показали, что добавление ESCRT-II в in vitro assay ускоряет ESCRT-III-зависимую продукцию ILV, тогда как добавление дефектных по связыванию мутантных Vps25 не оказывало эффекта.
Наконец, было смоделировано связывание ESCRT-II с двумя молекулами VPS20, приводящее к образованию ESCRT-II-VPS202 'supercomplex' с выпуклым изгибом, который комплементарен таковому в ILV. Предполагается, что ESCRT-II-VPS202 суперкомплекс может обеспечивать негативным изгибом мембрану, действуя как каркас, тем же способом, что полумесячной формы BAR домены путем стабилизации позитивного изгиба мембраны.
Эндосомы играют критическую роль в координации везикулярного транспорта между trans-Golgi network (TGN), плазматической мембраной и лизосомными/вакульными органеллами (Рис. 1). Эндосомы представляют собой систему гетерогенных компартментов, которые в целом характеризуются как 'ранние' или 'поздние' в засисимости от кинетики, с которой компартменты загружаются эндоцитозировнным материалом. Ранние и поздние эндосомы м. также различаться по своей морфологии. В то время как ранние эндосомы стремятся быть тубулярными и располагаться по клеточной периферии, поздние эндосомы более сферические и часто располагаются вблизи ядра. Кроме того, субнабор поздних эндосом обычно имеет мультивезикулярный вид и часто обозначается как multivesicular bodies (MVBs) (Рис. 1b).
Выявлена важная роль MVBs у многоклеточных организмов в столь различных процессах как подавление рецепторов ростовых факторов, презентация антигенов и почкование ретровирусов. Однако, у одноклеточных дрожжей Saccharomyces cerevisiae обнаружены многие компоненты молекулярной кухни (machinery), которая существенна для сортировки MVB. Консервацияэтих компонентов от дрожжей до человека подчеркивает важность этого транспортного маршрута во всех клетках эукариот.
Multivesicular bodies
В начале 1950s была распознана ЭМ уникальная структура MVBs, некоторые из которых захватывают эндосомные мембраны во время инвагинации в направлении просвета компартмента. Физиологическое значение этих уникальных событий инвагинации впервые продемонстрировано на примере поступления и деградации epidermal growth factor ().
EGF является секретируемым пептидом, который стимулирует рост и деление клеток в результате связывания и активации рецепторной тирозин киназы в плазматической мембране. В свою очередь рецепторы EGF () рекрутируют и фосфорилируют внутриклеточные сиогнальные молекулы, которые активируют каскад сигнальной трансдукции mitogen-activated protein kinase (MAPK), который важен для регуляции пролиферации клеток. Клетки используют несколько механизмов для негативной модуляции их ответа на EGF, один из которых является процессом, известным как подавление рецепторов (receptor down-regulation) — EGF–EGFR комплексы деградируют посредством эндоцитоза и поставки их в лизосомы.
C помощью ЭМ отслеживали судьбу конъюгированного с ferritin EGF, и обнаружили, что на пути en route в лизосомы EGF отсортировывается в пузырьки внутри просвета MVBs. Отслеживание маршрута EGFR подтвердило, что рецептор сортируется вместе с EGF в MVB пузырьки. Слияние лимитирующей (наружной) мембраны MVB с лизосомной мембраной приводит к высвобождению внутри-просветных пузырьков и содержимого MVB внутрь гидролитиеских лизосом, где все деградирует (Рис. 1). Этот уникальный механизм позволяет клеткам деградировать трансмембранные белки, а также липиды, которые образуют внутри-просветные пузырьки MVBs. Мембранные белки, которые избегают этой судьбы, исключаются из этих внутренних пузырьков MVB и остаются в лимитирующей MVB мембране, так что они безусловно переносятся в лимитирующие мембраны лизосом и подвергаются рециклингу обратно в плазматическу мембрану или переносятся в др. места клетки.
Показана важность MVB сортировки для подавления многочисленных активированных рецепторов факторов роста. Предже чем они будут отсортированы в MVB пузырьки, интернализованные EGFRs ассоциируют с некоторыми ключевыми компонентами цитоплазматической сигналы передающей кухни (machinery). После сортировки EGFR в просветные пузырьки MVBs, активированная тирозин киназа, которая находилась в цитоплазматическом домене эффективно отделяется от цитоплазмы, где она взаимодействовала с сигнальными молекулами. Мутации у мышей, которые влияют на MVB сортировку EGFRs, ведут к туморогенезу. Сходным образом мутации у Drosophila melanogaster, которые блокируют эффективную MVB сортировку, приводят к длительной передаче сигналов, стимулируемых ростовыми факторами, и к онтогенетическим дефектам . Скорее всего, мутации, которые нарушают подавление EGFR у Caenorhabditis elegans ведут к аномалиям . Т.к. дефекты в подавлении рецепторов удлинняют действие сигналов факторов роста, то они м. влиять на контроль роста клеток и развития. Следовательно, подавление рецепторов являются ключевой регуляторной ступенью, гарантирующей правильную продолжительность и величину передачи сигналов в клетках.
Regulating entry into the MVB sorting pathway
Наряду с важностью подваления некоторых рецепторов сортировкой их в MVB столь же важно для др. интегральных мембранных белков избегать включения в пузырьки в MVB. Напр., рецепторы, которые несут железо и низкой плотности липопротеин в клетку, подвергаются посторным раундам интернализации и возвращения (recycling). Более того, многие трансмембранные белки, которые функционируют на лизосомах не высвобождаются в их гидролитический просвет, а вместо этого направляются в лимитируетие лизосомные мембраны. Сортировка в пузырьки MVB , следовательно, д. четко регулироваться.
Targeting and endosomal sorting.
Большинство белков, которые отсортировываются для специфических транспортных путей, содержат направляющую информацию в своих аминокислотных последовательностях, которая и управляет их вступлением в соотв. транспортные пузырьки. Цитоплазматический домен EGFR, напр., содержит последовательности, которые обеспечивают его сортировку после интернализации в эндосомы. Однако, мутантные EGFR, с точковой мутацией в своем киназном домене, достигают лимитирующей MVB мембраны, но исключаются из пузырьков в просвете MVB, это указывает на то, что специфическая информация, отвечающая за направление (targeting), зависит и от активности рецепторной киназы, которая также необходима для сортировки EGFR в MVB.
Подавление EGFRs и многих др. белков клеточной поверхности облегчается с помощью пост-трансляционного присоединения к их цитоплазматическим доменам (Рис. 2; Box 1). Это показано на S. cerevisiae. является G-protein-coupled receptor (GPCR), который присутствет на плазматической мембране дрожжевых клеток mating type a. Ste2 активируется в ответ на связывание пептидного гормона (α-factor), который секретируется гаплоидными клетками, которыя имеют типа спаривания α. Способом, аналогичным EGFR, Ste2 стимулирует MAPK kinase (MAPKK) каскад и затем подавляется в результате интернализации и высвобождения в вакуоли — функциональный эксвивалент лизосом у дрожжей. Ste2 отсортировывается в просветные пузырьки MVBs en route на пути в вакуоли. Однако, Ste2 не подавляется эффективно, если все лизиновые остатки в его цитоплазматическом домене мутированы. В соответствии с прямой ролью ubiquitin в интернализации и/или деградации белков клеточной поверхности, слияние in-frame убиквитина с дрожжевой плазматической мембраны — которая обычно стабильна на клеточной поверхности — дает химерный белок, который быстро подвергается эндоцитозу и деградирует в вакуоли.
Ubiquitin-обусловленная деградция в вакуоли белков клеточной поверхности не ограничена рецепторами. У дрожжей некоторые белки плазматической мембраны, которые подвергаются эндоцитозу и деградируют в вакуоли, ubiquitylated по своим цитоплазматическим доменам (). Убиквитилированые формы этих белков накапливаются в плазматической мембране у мутантных линий, дефектных по эндоцитозу, это указывает на то, что убиквитилирование ubiquitylation происходит на клеточной поверхности. Подавление некоторых из этих белков нуждается в активности E3 ubiquitin ligase . В случае Ste2, ubiquitylation участвует в интернализации, т.к. non-ubiquitylated lysine мутанты обнаруживают пониженную скорость поступления из плазматической мембраны. Однако, дефекты ubiquitylation и Ste6 и Fur4 (Табл. 1) приводят к их накоплению в pre-vacuolar
эндоцитотических компартментах, это указывает на то, что убиквитин является важным для их сортировки в вакуоли после интернализации. Кроме того, и amino-acid permease Gap1 м. ubiquitylated таким же способом, зависящим от Rsp5, и затем перенаправляется на MVB путь, не посещая плазматическую мембрану в условиях, когда высвобождение на клеточной поверхности не гарантируется. В некоторых случаях, таких как Gap1, имеются доказательтсва того, что сигналом для деградации в вакуоли м.б. polyubiquitylation. Пока неясно, как этот сигнал избегает обнаружения (Box 1) и вместо этого направляет груз по MVB пути.
Ubiquitin and post-internalization sorting.
В клетках млекопитающих, ubiquitin играет роль в сортировке после интернализации G-protein-coupled chemokine receptor . Мутации лизинов, акцептирующих убиквитин, в цитоплазматическом конце этого рецептора не вызывают дефектов интернализации его из плазматической мембраны, но его деградация полностью ингибируется. Сходным способом, на базе изучения ubiquitin ligase , ubiquitylation оказывается важным и для сортировки после интернализации EGFR. Cbl является E3 ubiquitin ligase с нешаблонным Src-homology-2 (SH2) доменом. Этот SH2 домен участвует в направлении связывания Cbl с фосфорилированным EGFR, тогда как у Cbl координирует перенос убиквитина с E2 энзима на цитоплазматический домен рецептора. Избыточная экспрессия дикого типа Cbl усиливает скопрость деградации EGFR, но не скорость его интернализации, это указывает на то, что ubiquitylation рецептора необходимо в первую очередь для сортировки рецептора после интернализации из плазматиеской мембраны. Избыточная экспрессия мутантной формы Cbl, которая дефактна по лигазной активности, не индуцирует EGFR ubiquitylation или деградации. Естественно возникшая вирусная онкогенная форма Cbl (v-cbl) у мышей, в которой отсутствует RING домен, конкурирует с эндогенной дикого типа Cbl за связывание активированного EGFR и тем самым обусловливают доминантно-негативное ингибирование подавления EGFR, что и обусловливает возникновение опухолей. EGFRs, которые неспособны быть ubiquitylated, возвращаются обратно в плазматическую мембрану. Их постоянное возвращение ведет к продолжительной стимуляции нижестоящего сигнального каскада. У дрожжей GPCR для a-factor mating
феромона, Ste3,по-вилдимому, испытывает и ubiquitin-независмую интернализацию и ubiquitin-зависимую потребрность для вступления на путь MVB. Все это указывает на то, что убиквитин важен для перенаправления белков с обычного пути, который возращает их назад в плазматическую мембрану на путь MVB сортировки и деградации.
Ubiquitin and receptor downregulation.
Ubiquitin модификации регулируют также подавление growth hormone receptor (GHR)-tyrosine kinase. Подобно EGFR, цитоплазматический домен GHR ubiquitylated в ответ на свзфвание лиганда. Т.к. правильное функционирование клеточной ubiquitin ligase кухни необходимо для подавления GHR, то ubiquitylation of GHR само по себе несущественно для этого процесса. Это указывает на то, что trans-действующий компонент(ы) кухни (machinery) подавления убиквитилируется в ответ стимуляцию growth hormone (GH). Двумя потенциальными мешенями являются (EGFR-pathway substrate 15), который функционирует в clathrin-обеспечиваемом эндоцитозе и mono-ubiquitylated в ответ на EGF стимуляцию, и (hepatocyte growth factor-regulated tyrosine kinase substrate), который также mono-ubiquitylated, но участвует в MVB сортировке.
Подавление β-adrenergic рецепторов нуждается в функции β-arrestin, который сам ubiquitylated. У дрожжей trans-действующие компоненты эндоцитотической кухни т.акже м. регулироваться с помощью ubiquitinовой модификации. Ste2–ubiquitin химеры интернализуются с почти нормальнй кинетикой в клетках дикого типа, но интернализация существенно замедлена в клетках, которые обладают ubiquitin-ligase-дефектной формой Rsp5.
Итак, ubiquitylation важна для подавления белков клеточной поверхности в лизосомах/вакуолях, но точная стадия (или стадии), на которых убиквитин необходим, не совсем ясны. В то время как убиквитилирование необходимо для быстрой интернализации некоторых белков с клеточной поверхности (напр., Ste2), в случае др. (напр., EGFR, Ste6 и Fur4) оно, по-видимому, действует после интернализации. Следовательно, убиквитин играет несколько ролей, не тоько как метка для сортировки в качестве эндосомного груза (или грузов клеточной поверхности), но и также в качестве регулятора подавляющей кухни (machinery).
Ubiquitin and MVB sorting.
Непосредственное участие ubiquitin в MVB вортировке показано и в случае carboxypeptidase S () — дрожжевого трансмембранного белка, который высвобождается прямо из Golgi в эндосомы, где она вступает на MVB путь (Рис. 2). Лизиновый остаток 8 (Lys8) в цитолпзматическом домене в 19 аминокислот у CPS функционирует как акцепторный сайт lzk присоединения ubiquitin. Мутация Lys8 в аргининовый остаток блокирует убиквитилирование CPS, это приводит к тому, что мутантная CPS высвобождается неправильно в ограничивающую мембрану вакуоли. Итак, ubiquitinовая модификация CPS не является необходимой для ее траспорта в вакуоль, но необходима для сортинга CPS в пузырьки просвета MVBs, так что CPS м. высвобождаться в просвет вакуоли скорее, чем в мембрану вакуоли.
Аминокислотные последовательности, которые окружают Lys8 в CPS, по-видимоу важны для распознавания убиквитиновоай лигазой. Др. белки мембраны вакуоли, которые ни убиквитилируются, ни сортируются в пузырьки MVB, также имеют лизиновые остатки в своих цитоплазматических доменах. Однако, когда пептидная последовательность в 7 аминокислот, которая окуржает Lys8 у CPS трансплантировалась в один из этих non-MVB cargo белков, то образующаяся химера и убиквитилировалась и сортировалась в пузырьки MVB. Более того, in-frame слияния убиквитина с non-MVB cargo белками было достаточно для направления этих белков на путь MVB.
Однако, не все MVB грузы убиквитилируются (напр., Sna3; Табл. 1), это указывает на то, что альтернативные типы sorting информации также м. направлять белки на путь MVB. Неизвестно, играет ли Rsp5 какую-либо роль в сортировке биосинтетических грузовых белков на путь MVB. Трансмембранная ubiquitin ligase (Tul1) идентифицирована в качестве трансмембрнного белка с RING доменом, который яволяется общим большинству E3 ubiquitin ligases. Делеция гена TUL1, по-видимому, нарушает сортировку MVB груза и вызывает частичный дефект в убиквитилировании грузовых белков. Следовательно, несколько ubiquitin ligases м. участвовать в этом процессе.
Ubiquitin removal.
Хотя безусловно ubiquitin функционирует как детерминант для отбора белков в качестве груза MVB, но он, по-видимому, удалется из этих белков преджде чем они вступают в пузырьки MVB. Мутантные линии дрожжей, у которых отсутствует энзим de-ubiquitylating, Doa4 (degradation of alpha-2), имеют пониженные уровни свободного убиквитина, это является результатом заметного снижения периода полу-жизни убиквитина.
Установлено, что Doa4 м. функционировать как энзим, ассоциированный с эндосомами, который отвечает за удаление убиквитина из субстратов, которые предназначены для деградции в вакуоли (Рис. 2). Прямой анализ статуса ubiquitylation грузов MVB, CPS, Fur4 и Ste6, согласуется с ролью Doa4.
Ubiquitin recognition by trans-acting
factors
В грузовых белках большинство сортинг-детерминант, которые непосредственно направляют на определнный транспортный путь, распознаются компонентами транспортной организации (machinery). Ubiquitin, не является исключением из этого правила. Polyubiquitin цепочки, которые находятся на субстратах, предназначенных для деградации, непосредственно связываются с помощью субединиц протеасом (Box 1). Описано несколько доменов, которые взаимодействуют с убиквитином (Box 2). Помимо локализациии в протесомных субъединицах и в ubiquitin-metabolizing энзимах, эти мотивы м.б. обнаружены в некоторых компонентах кухни эндоцитотической сортировки.
Class E Vps proteins in yeast.
Продукты более 50 генов участвуют в vacuolar protein sorting (Vps) на разных стадиях транспорта белка в вакуоль. Все 17 классов E Vps белков (Табл. 2) необходимы для сортировки грузовых белков в MVB и функциональная потрея любого индивидуального class E Vps белка ведет к уродству поздних эндосом/MVB, которые известны как 'class E compartment'. В дополнение к MVB грузам, др. белки en route к вакуолям накапливаются в class E компартменте, это уазывает на то, что эффективный транспорт через эндосомы базируется на функции class E Vps белков.
Vps23.
У дрожжей белок класса E Vps23 (известный также как Stp22) имеет ubiquitin-conjugating (UBC)-подобный домен, который свфы\язывает убиквитин. Этот домен гомологичен с таковым у UBCэнзимов, но в активном сайте отсутствует уистеин, который необходим для его функции в качестве bona fide UBC энзима. Этот домен называется также как ubiquitin E2 variant (UEV) домен и является гомологом млекопитающих Tsg101, который прямо связывает ubiquitin in vitro. Vps23 образует ансамбли с двумя др. классами E Vps белков — Vps28 и Vps37 — в виде комплекса в 350-kDa, который рекрутируется временно в эндосомную мембрану из цитоплазмы. Этот белковый комплекс необходим для сортировки грузовых белков в MVB и поэтому был назван ESCRT-I (endosomal sorting complex required for transport-I). UBC-подобный домен Vps23 необходим ESCRT-I для связывания ubiquitin in vitro. In vivo, ESCRT-I взаимодействует с CPS, но не с мутантной Lys8 формой CPS, которая не ubiquitylated. Следовательно, ESCRT-I непосредственно участвует в распозновании и сортировке MVB cargo белков (рис. 3).
The mammalian homologue of Vps23.
Гомолог Vps23 мелекопитающих является генным продуктом чувствительности к опуходям, Tsg101. Подобно Vps23, Tsg101 собирается в 350-kDa комплекс с Vps28 (гомолог Vps37 млекопитающих неизвестен), а этот комплекс ассоциирует также временно с эндосомными мембранами. Функциональная инактивация Tsg101 в фибробластах мыши ведет к повышению возвращения EGFR. В результате Tsg101-мутантные клетки обладают продолжительной EGF-стимулированной активацией внеклеточными сигналами регулируемых MAPKKs, ERK1 и ERK2. Tsg101-мутантные фибробласты дают метастазирующие опухоли у . Это скорее всего является следствием повышения количества EGFRs в плазматической мембране , следовательно, в усиленной передаче сигналов EGFR мутантными клетками.
Vps27 and its mammalian homologue Hrs.
Vps27 имеет две копии ubiquitin-interacting motif (UIM; Box 2). Одна или больше копий UIM присутсвуют в белках, которые функционируют в широком круге убиквитином-опосредованных клеточных процессов. И Vps27 и его гомолог у млекопитающих — Hrs — соединяются с убиквитином в зависимости от своих UIMs. Точковые мутации в UIMs у Vps27 снижают связывание ubiquitin и обусловливают дефекты сортировки MVB нрузов CPS и Ste2. Однако, остается неясным связан ли фенотип с неспособностью Vps27 взаимодействовать с ubiquitylated грузовыми белками. Vps27/Hrs существуют в комплексе со вторым белком, содержащим UIM, Hse1/STAM (Табл.2). В некоторых иниях дрожжей делеция HSE1 дает фенотип class E. Помимо, сайт-специфичных мутаций в UIMs и в Vps27 и в Hse1 известны MVB-специфические дефекты сортировки.
Альтернативная функция UIMs в Vps27/Hrs м.б. связана с ubiquitin-модифицированными компонентами кухни эндосомной сортировки. Hrs сам ubiquitylated, т.к. является Eps15, которая участвует в эндоцитозе во время интернализации из плазматической мембраны. UIMs у Hrs и Eps15 необходимы для ubiquitylation обоих этих белков, а в случае Eps15, UIM, по-видимому, взаимодействует непосредственно с ubiquitin ligase комплексом. Следовательно, убиквитин функционирует не только как элемент распознавания, который приаттачен к MVB переносимым белкам, но и как модификация, которая регулирует сборку и активность различных компонентов сортирующей machineries. Известно, что клатрин формирует уникальную слоеную решетку на субнаборе эндосом и что Hrs локализуется именно в этих областях.
Other trans-acting sorting components
VHS-domain-containing proteins. имеют VHS ('Vps27, Hrs, STAM') домен. Домен VHS обнаружен также в GGA ('Golgi-localizing, γ-adaptin ear homology domain, ARF-binding') семействе белков, которые функционируют в TGN. Домен VHS белков GGA взаимодействует с кислым dileucine мотивом в цитоплазматических хвостах sorting-рецепторов, таких как mannose 6-phosphate receptor (M6PR). Отдельная область GGA белков соединяется с клатрином, это указывает на то, что GGA белки функционируют как адапторы между белками-грузами и клатриновой оболочкой. Однако, домен VHS у Hrs неспособен связывать кислый dileucine мотив и M6PR и sortilin, др. sorting-рецептора.
Кристаллографический анализ выявил незначительные, но достоверные отличия в VHS доменах GGA белков по сравнению с VHS доменами non-GGA белков. таких как Hrs. Следовательно, функция VHS домена в белках, таких как Vps27/Hrs остается неясной. существует возможность, что он является средством, с помощью которого эти белки м. взаимодействовать или с эндосомными грузами или с компонентами эндосомного сортирующегго аппарата.
Additional ESCRT complexes.
Недавно у дрожжей идентифицирована еще два ESCRT комплекса, состоящие из class E Vps белков, оба участвуют в сортировке MVB грузов (Рис. 3). ESCRT-II это 155-kDa комплекс, который состоит из Vps22, Vps25 и Vps36 и который рекрутируется временно в эндосомные мембраны. Показано, что ESCRT-II действует ниже ESCRT-I, т.к. избыточная экспрессия ESCRT-II м.б. частично супрессировать потерю ESCRT-I функции, но не наоборот. ESCRT-III состоит из двух функциональных субкомплексов: membrane-proximal
субкомплекса из (известного также как Vps32) и Vps20, и с периферией ассоцированного субкомплекса, состоящего из Vps2 (известного также как Did4, Ren1 и Grd7 ) и Vps24. Ассоциация membrane-proximal Snf7–Vps20 субкомплекса ESCRT-III с эндосомами не зависит от периферического Vps2–Vps24 субкомплекса, тогда как Vps2–Vps24 субкомплекс нуждается в Snf7–Vps20 для ассоцииации с эндосомами. Очевидно, что ассоциация с мембранами ESCRT-III стабилизируется частично с myristoylation Vps20.
Весь ESCRT-III комплекс неспособен локализоваться правильно в поздних эндосомах в клетках с отсуствием ESCRT-II компонентов, это указывает на роль ESCRT-II в рекрутировании и сборке Snf7–Vps20 на соответ. эндосомных мембранах. ESCRT-II и ESCRT-III м. очищаться вместе из эндосомных мембран, но не из цитозоля, это указывает на то, что два комплекса м. формировать комплекс высшего порядка на эндосомах.
Vps4 and membrane dissociation of class E Vps proteins.
Др. класс E Vps белков , . Vps4 не является компонентом ESCRT, но она играет роль в катализе диссоциации всех трех ESCRT комплесов с эндосом. ESCRT-I, -II и -III все накапливаются на class E компартменте в vps4-мутантных клетках. ATФ-нагруженный Vps4 собирается в виде гомо-олигомера и рекрутируется на эндосомы с помощью периферического Vps2–Vps24 субкомплекса ESCRT-III. Мутантный Vps4, который неспособен связывать ATФ остается в цитоплазме, это указывает на то. чтоt ATФ-связывание регулирует его ассоциацию с эндосомами. Vps2–Vps24 также необходим для рекрутирования de-ubiquitylating энзима, Doa4, на эндосомы. Периферический субкомплекс ESCRT-III, следовательно, важен для поставки акцессорных белков, которые обеспечивают de-ubiquitylation грузов MVB (Doa4) и высвобождение class E Vps белков с эндосомных месбран (Vps4).
В большинстве class E vps-мутантных клеток, просветная часть CPS отщепляется протеолитически с помощью активных гидролаз, которые присутствуют в class
E компартменте. Известно, что CPS защищена от протеолиза в компартменте class E, если Snf7–Vps20 субкомплекс отлавливается эндосомной мембраной (напр., у vps2-, vps24- или vps4-мутантных клеток). Non-MVB белки-грузы остаются чувствительынми к протеолитическому расщеплению в этих условиях, это указывает на то, что Snf7–Vps20 субкомплекс ESCRT-III играет спецфическую роль в секвестрировании или концентрации MVB грузов.
Phospholipids and regulators of the MVB
pathway
The role of lysobisphosphatidic acid and cholesterol.
По сравнеию с др. клеточными компартментами поздние эндосомы имеют уникальный липидный состав. В то время как ранние эндосомы в целом состоят из одиних и тех же липидов, что и плазматическая мембрана — включая выского уровня glycosphingolipids и cholesterol — поздние эндосомы обогащены нейтральными фосфолипидами, включая триоглицериды и холестроловые эфиры. В клетках млекопитающих неконвенциональный фосфолипид — lysobisphosphatidic acid (LBPA) — локализуется практически исключительно на просветных мембранах MVBs.
LBPA является необычным липидом, он содержит инвертировнную конусо-образную структуру, конформация которой м. благоприятствовать внутренней деформации лимитирующей MVB мембраны. Интересно, что некоторые пациенты страдающие от antiphospholipid синдрома, продуцируют антитела против LBPA. Эти анти-LBPA антитела накапливаются в поздних эндосомах и разрушают их мультивезикулярную мофрологию — это согласуется с ролью LBPA в управлении образования (просветных) lumenal-пузырьков. Анти-LBPA антитела вызывают также накопление в культивируемых клетках холестерола в поздних эндосомах, фенотип, который воспроизводится в клетках пациентов с болезнью накопления холестерола . Поздние эндосомы/MVBs м. , следовательно, играть критическую роль в регуляции распределения холестерола в эндоцитотических компартментах.
The role of phosphoinositides.
Известна ключевая роль в MVB пути phosphoinositides, которые являются фосфорилированными производными мембранного фосфолипида, phosphatidylinositol (PtdIns). PtdIns выдающийся среди фосфолипидов тем, что его inositol headgroup характеризуется гидроксильными группами, которые м.б. модифицированы обратимо с помощью фосфорилирования в 3', 4' или 5' позиции, или по одиночке или в комбинации, с помощью семейства PtdIns kinases, которые локализуются в цитоплазме. Phosphoinositides , следовательно, синтезируются в цитоплазматическом листке клеточной мембраны и как результат их фосфорилированне головные группы ориентируются в направлении цитоплазмы. Phosphoinositides рекрутируют и/или активируют эффекторные белки в сторого локализованных областях клетки. Среди семи уникальных phosphoinositides, синтезируемых в клетках, PtdIns(3)P наиболее непосредственно участвует в переносе эндосомных мембран.
PtdIns(3)P обильно представлен в эндосомных мембранах, где он функционирует, рекрутируя цитоплазматические эффекторные белки, которые имеют или FYVE ('Fab1,YOTB, Vac1, EEA1') домен или PX ('Phox homology') домен. Некоторые из этих эффекторов являются транспортными факторами (напр., Vps27/Hrs), тогда как др. явлются сигнальными молекулами (напр., SARA (smad anchor for receptor activation). Блокирование синтеза PtdIns(3)P (напр., у мутантов vps34) вызывает нарушения MVB
сортировки. Часть клеточных PtdIns(3)P обнаруживается также на просветных пузырьках в MVBs. Пул просветных PtdIns(3)P в конечном счете высвобождется в просвет вакуоли/лизосомы, где он деградируется. LBPA также преобладает во внутренних мембранах MVBs. Однако, LBPA учтойчива к деградации. Следовательно, имеется две разные популяциивнутренних MVB мемьбран — те, которые содержат PtdIns(3)P, которые м. направляться на деградацию и те, которые содержат LBPA, и которые м. сохраняться как резервуар для холестерола и возможно др. ассоциированных с мембранами компонентов.
PtdIns(3)P v/ играть и боле прямую роль в инвагинациях мембран во время образования пузырьков за счет рекрутирования эффекторных белков, которые учатсвуют в образованиии везикул. У дрожжей, единственная PtdIns 3-kinase (PI3K) кодируется vps34, и функционирует как критический энзим для коррекции сортировки в вакуоли.
Микроинъекции anti-human Vps34 антител в культивируемые клетки человека или воздействие wortmannin, который ингибирует активность PI3K, блокируют образование MVB-пузырьков, это подтверждает роль PtdIns(3)P в биогенезе MVB пузырьков. Кроме того, PtdIns(3)P является субстратом для PtdIns(3)P 5'-kinase, Fab1, которая продуцирует PtdIns(3,5)P2. У дрожжей, мутации, которые инактивируют Fab1-kinase, блокирован сортинг CPS, но не Ste2, в просвет вакуоли. Показано также, что биосинтетические энзимы все еще м. сортироваться с помощью MVB пути, если груз экспрессируется translational слияние с убиквитином. CPS, по-видимому, ubiquitylated, когда достигает эндосомного компартмента, тогда как Ste2, по-видимому, ubiquitylatedна плазматической мембране. Следовательно, возможно, что PtdIns(3,5)P2 необходим специфически для отбора только субнабора биосинтетических MVB грузов, т.к. MVB путь, очевидно, все еще функционален в линиях с отсутствием PtdIns(3,5)P2.
MVBs in cellular physiology and disease
A role in regulating Notch signalling.
Путь MVB важен в нескольких аспектах клеточной физиологии. Подавление активированных рецепторов ростовых факторов наиболее важно не только для модуляции контроля роста, но и в широком контексте развития. В дополнение к контролю передачи сиганлов Torso рецепторов у Drosophila MVBs играют роль в модуляции сигнального пути Notch (Рис. 4a). У некоторых видов, Notch является рецептром, который участвует на разных стадиях развития, включая ингибирование нейрональной дифференцировки в эбмриональных эпидермальных клетках, выросты нейритов у Drosophila, и нейрональное латеральное ингибирование и нейрональную дифференцировку во время развития вульвы у C. elegans.
Notch трансмембранные рецепторы активируются в результате взаимодействия с трансмембранными белками Delta, Serrate и Lag-2 (DSL), которые экспрессируются соседни клетками. Delta экспрессируется также и в Notch-содержащих клетках, так что он м. ингибировать передачу сигналов Notch путем ассоциации с Notch в cis положении на клеточной поверхности (Рис. 4a). Активация Notch с помощью Delta приводит к протеолитическому высвобождению внутриклеточного домена Notch из плазматической мембраны, это позволяет домену Notch перемещаться в ядро, где он регулирует экспрессию различных генов-мишеней. Мутации в ubiquitin ligase, которая кодируется геном neuralized вызывает дефекты в подавлении Delta и увеличивает уровни Delta в плазматической мембране, тогда как повышенная экспрессия neuralized увеличивает оборот Delta. Итак, Delta , по-видимому, является мишенью для Neuralized ubiquitin ligase. Delta, по-видимому, mono-ubiquitylated, это указывает на то, что после того как он интернализуется, то сортируется с помощью MVB пути и затем деградирует.
A role in activating the immune response.
MVBs также, по-видимому, важны для активации иммунного ответа (Рис. 4a). Незрелые дендритные клетки cells упаковывают молекулы major histocompatibility complex (MHC) class II в просветные пузырьки MVB-подобных компартментов, которые известны как MHC class II compartments (MIICs). В ответ на стимуляцию клеток антигеном просветные MIIC сливаются с лимитирующей MIIC мембраной, MHC class II молекулы загружаются антиогенными пептидами и MHC class II–пептидные комплексы транспортируются в плазматическую мембрану для презентации нативным T клеткам. Т.к. LBPA устойчива к деградации, то она играет роль в предупреждении разрыва просветных пузырьков внутри MIICs, которые сами богаты гидролитическими энзимами, которые участвуют в протеолизе антигенов и тем самым поддерживают стабильный пул люминальных пузырьков, которые нагружены молекулами MHC class II.
Стимулирование антигенами дендритных клеток м. также вызывать докирование лимитирующих мембран MIICs и их сливание в плазматической мембраной, это обеспечивает высвобождение просветных пузырьков MIICs из клетки. Секретируемые пцзырьки — известные как exosomes — содержат MHC молекулы и CD86, ко-стимулирующий факто для T клеток. Очищенные экзосомы вызывают мощное противо-опухолевое действие, если инъецируются мышам. Экзосомы секретируются также др. типами гематопэтических клеток — которые включают незрелые ретикулоциты, В клетки и тромбоциты — но их точне физиологические мишени неизвестын.
A role in viral budding.
Выявлена связь между клеточной MVB machinery почкованием вирусных частиц в клетках от инфицированных immunodeficiency virus-1 (HIV-1) людей (Рис. 4a). Хотя точная роль убиквитина при этом несовсем ясна, HIV-1 оболочечный белок Gag ubiquitylated и это коррелирует с эффективным размножением вирусных частиц. Топологически, почкование инвагинирующих MVB пузырьков в эндосому и высвобождение вирусных частиц с клеточной поврехности эквивалентны, в обоих случаях имеет место отпочковывание пузырьков от цитоплазмы. Интерсно заметить, что ubiquitin играет роль в селекции MVB грузов и вообще в упаковке Gag в вирусных частицах.
Показано, что вирусное почкование зависит от функции ортологов у млекопитающих различныхбелков class E Vps. Снижение уровней клеточного Tsg101 вызывает дефекты и упаковки Gag и почкования вирусных частиц. Сродство Tsg101 в отношении Gag белка увеличивается заметно, если Gag убиквитилирован, идентифицирована область, которая включает β-hairpin в UBC-подобном домене Tsg101, это существенно для данного взаимодействия. Кроме того, Tsg101 меняет локализацию из эндосом на плазматическую мембрану в ответ на избыточную экспрессию специфической пептидной последовательности из Gag белка. Все это указывает на то. что модель, согласно которой HIV-1узурпирует MVB machinery, чтобы сортировать ubiquitylated груз в формирующиеся вирусные частицы. В соответствии с этой моделью, избыточная экспрессия ATPase-defective мутанта (SKD1 является ортологом у млекопитающих Vps4) также блокирует HIV-1 размножение из инфицированных клеток. Было бы интресно понять, использует ли вирус целиком MVB sorting machinery или только субнабор этих компонентов these components.
Conclusion and future directions
Неожиданные связи между передающими сигналы рецепторами и убиквитином-обусловленнгом подавлением рецепторов, между MVB сортировкой и болезнями. такими как рак и ВИЧ инфекция выявлены недавно (Рис. 4b). Большинство клеточных компонентов которые управляют путями MVB-sorting открыты, но предстоит еще много работы. чтобы понять механизм их действия. Возможно, что известна только часть клеточной кухни изветна, котрая управляет путфми MVB сортировки. What mechanisms might there be, other than ubiquitylation, to mark cargo proteins for entry into MVB vesicles? What is the mechanism that enables MHC class II-containing vesicles to re-fuse with the limiting MIIC membrane? How is MVB cargo recognized? And, in the case of cargo proteins that are ubiquitylated, how are they identified by the ubiquitin
ligase? What is the mechanism by which this unusual vesicle formation occurs? We can look forward to new and exciting discoveries as the molecular details of these processes are revealed.
