Microarray Analysis
Greg Gibson (ggibson@unity.ncsu.edu) PLoS Biology, Volume 1 | Issue 1 | October 2003 DOI: 10.1371/journal.pbio.0000015 | |
) Рис.1. | Flow Diagram of Gene Expression Profiling |
Mикромассивы (microarrays) используются для инспекции тысяч генов в одном экспреименте. Использованные творчески, они м. применяться для тестирования, а также выдвижения новых гипотез. Т.к. данная технология становится все более доступной, то анализ микромассивов используется в разных областях биологии. Микромассивы являются простым методом для визуализации, какие гены скорее всего используются в определенной ткани при определенном наборе условий. Результатом являются т.наз. “gene expression profile.” Fundamental Microarray Technology Все эксперименты с микромассивами базируются на стержневом принципе, что количество транскриптов м.б. измерно с помощью дедукции величины гибридизации меченной РНК с комплементраным зондом. Идея микромассива проста, чтобы получить поле из тысяч таких зондов на в общем-то в 5 см2 площади, где каждый зонд предсставлен комплементом из, по крайне мере, части транскриптов, которые м.б. экспрессированы в ткани. После того как сконструирован микромассив, популяция мишеней мРНК метится, обычно флюоресцентным красителем, так что гибридизация с точкой зонда м.б. выявлена, когда сканируется лазером. Интенсивность сигнала, продуцируемая 1,000 молекулами определенного меченного транскрипта д.б. вдвое ярче сигнала, продуцируемого 500 молекулами и сходным образом, сигнал от 10,000 молекул наполовину менее ярок, чем сигнал от 20,000 молекул. Итак, микромассив является массивным параллельным инспектированием экспрессии тысяч генов из разных популяций клеток. Тривиально, если флюоресценция наблюдается для гена в одной популяции, но отсутствует в др., то ген м.б. расценен как включенным и выключенным, соотв. При соотв. репликации, нормализации и статистике м.б. выявлены различия в количестве величиной в 1.2-крат. Исход гибридизаций всего массива будет представлен серией цифр в пределах почти 4-х порядков величин, вообще от одного транскрипта на клетку до нескольких тысяч транскриптов на клетку. ().
Это и есть сравнение профилей экспрессии генов, которое наиболее интересно. Благодаря визуализации определяется уровень данного транскрипта, но это еще не гарантирует, что с этой мРНК будет продуцироваться белок или что он функционален.
Общий подход по оценке экспериментов по профилированию генной экспрессии показан как flow диаграмма на . Когда эксперимент выполнен, то проводится контроль качества, статистический анализ и data-mining. Всё больше исследователей заинтересовано узнать, насколько велика величина отличий экспрессии , является ли она достоверной и каковы источники вариаций в эксперименте. Сходным образом мы м. оценить, обнаруживает ли определенный субнабор генов сходный профиль экспрессии и образуются ли естественные кластеры функционально родственных генов. Или мы м. комбинировать изучение экспрессии с генеотипированием и оценкой регуляторных последовательностей, чтобы изучить механизмы, которые ответственны за сходные профили экспрессии генов. Наконец, все из взаимовлияний экспрессий м.б. интегрированы с чем-то ещё, что известно о генах, отобранных из text базы данных и протеомных экспериментов и собственно исследователями исходя из своих собственных биологичесеких интересов. Fishing for Hypotheses Способность оценивать величины транскриптов среди всё увеличивающегося спектра условий позволяет генетикам взглянуть по новому на их клеточные системы, во многих случаях позволяет составить более целостное мнение о биологии и в то же самое время вернуться обогащенным к классическому гипотетическо-дедуктивному научному пониманию. Технология быстро развивается помимо простого использования для отлавливания генов-кандидатов, сегдодя эта техника м.б. использована для различных клинических предсказаний, мониторинга экосистемы, количественного картирования и вычленения эволюционных механизмов.
Два хорошо известных примера взаимодействия между профилированием микромассива и тестируемой гипотезой описаны в исследованиях и . В последнем случае авт. устанавливали профили различий в экспрессии между линиями мух, которые были селективно отобраны по позитивному и негативному геотаксису, по очень сложному поведенческому комплексу, связанному с предпочтениями личинок мух выбираться наверх или оставаться глубоко в грунте (ground). Они идентифицировали два десятка дифференциально экспрессирующихся генов, некоторые из которых были представлены мутантными или трансгенными линиями, которые позволили тестировать эффект дозы генов на поведение. По крайней мере 4 гена-кандидата на самом деле количественно влияли на геотаксис. использовали подобный подход на одну ступень дальше в своём 4-ступенчатом интерактивном feedback между профилированием, идентификацией генов-кандидатов, нокаутом их и затем дальнейшим профилированием. Они показали, как продуманное экспериментирование м. существенно увеличить шансы нашего понимания путей генетической регуляции, таких как реакция галоктозы у дрожжей.
Большой резонанс получила недавно попытка клинического использования профилирования генной эксрессии в связи со сложными заболеваниями, такими как рак,диабет, старение и реакция на токсины. Превые исследования в этом направлении были проведены , которые продемонстрировали, что диффузные большие В-клеточные лимфомы имеют два основных субтипа, выявляемые при молекулярном профилировании. Было довольно трудно предсказать клинический исход на базе гистологии, а эти профили выявляют набор генов, которые являются совершенно строгими индикаторами долговременного выживания. Сходным образом описали признаки “неблагоприятного прогноза” в биоптатах рака груди от молодых женщин до появления метастазов в лимфатические узлы. Большая статистическая и эмпирическая работа ещё необходима прежде чем этот подход станет клиническим инструментом, но идея, что экспрессия генов интегрирует сигналы от генотипа и среды, создаёт мощную мотивацию для изучения болезней с помощью микромассивов.
Хорошим примером способности анализа микромассива является описанное в данном номере PLoS Biology DeRisi и др (). Они предположили, что профилирование количеств транскриптов в течение всей эритроцитарной фазы жизненного цикла малярийного паразита Plasmodium falciparum позволит идентифицировать гены, которые индуцируются в критическое время и , следовательно, м.б. мишенями для новых лекарств. Используя точно выверенные стадии развития, платформу с низкими экспериментальными шумами и соотв. статистисескую обработку, они открыли чрезвычайно сжатый молекулярный жизненный цикл внутри организма. Семейства функционально родственных генов индуцируются как единое, одно за др. в точно соркестрированном ритме, который свидетельствует о невероятной интеграции физиологии паразита. Они показали, что с помощью анализа микромассива возможно смоделировать физиологию и биохимию путей вместо уже известных тех немногих генов.
В предстоящие годы ожидается разработка микромассивов для широкго круга организмов и для широкого круга вопросов от паразитологии до nutritional геномики. Будут решены задачи оптимальной статистики и будут созданы базы качественных стандартов. Приложения будут нацелены на определение функции генов; на взаимодействие функционалных сетей и путей; понимание того, как изменчивость распределяется между индивидами, популяциями и видами; на разработку клинических протоколов, связанных с прогнозами рака и на выявление действия токсинов. References Alizadeh AA, Eisen MB, Davis RE, Ma C, Lossos IS, et al. (2000) Distinct types of diffuse large B-cell lymphoma identified by gene expression profiling. Nature 403: 503–511.
Bozdech Z, Llinas M, Pullium BL, Wong ED, Zhu J, et al. (2003) The transcriptome of the intraerythrocytic developmental cycle of Plasmodium falciparum. PLoS Biol 1: . Ideker T, Thorsson V, Ranish J, Christmas R, Buhler J, et al. (2001) Integrated genomic and proteomic analyses of a systematically perturbed metabolic network. Science 292: 929–934. Find this article online
van't Veer LJ, Dai H, van de Vijver MJ, He YD, Hart AA, et al. (2002) Gene expression profiling predicts clinical outcome of breast cancer. Nature 415: 530–536. Velculescu VE (1999) Tantalizing transcriptomes: SAGE and its use in global gene expression analysis. Science 286: 1491–1492.
|