Гистоновые N-концы (хвосты) подвергаются разнообразным пост-трансляционным модификациям, включая ацетилирование, фосфорилирование, метилирование, ubiquitination и ADP-ribosylation. Открытие энзимов, которые осуществляют эти модификации, и ассоциированных с хроматином белков, которые селективно связывают позиционно-специфические гистоновые модификации, показало, что модифицированные гистоновые N-концы м. существенно расширять информационный потенциал генетического кода. Более того, они появляются, чтобы индексировать хроматиновые области, облегчать эпигенетический контроль, детерминировать клоны и обеспечивать общую функциональную организаци. хромосом.

Ацетилирование и arginine метилирование связаны в основном со стимулированием транскрипции. Тогда как фосфорилирование является маркером активации непосредственно ранних генов и передает сигнал к конденсации митотического хроматина. В работе основное внимание обращается на метилирование гистоновых лизинов. Роль ацетилирования, фосфорилирования и метилирования суммирована в Табл. 1. , а связанные с ними модификации обсуждаются в работах Zhang and Reinberg, 2001; Berger, 2002; Kouzarides, 2002.

Табл. 1 | Histone acetylation, phosphorylation and methylation

По крайней мере существует 5 позиций лизинов на N-концах гистонов H3 (K4, K9, K27, K36) и H4 (K20), способных к метилированию; ещё один обнаруживается в histone-fold домене гистона H3 (K79) (Feng et al., 2002; Lacoste et al., 2002; Ng et al., 2002; van Leeuwen et al., 2002). Авт. сконцентрировались на метилировании H3-K4, H3-K9 и H3-K27.

Энзимы Suv39h млекопитающих и их S. pombe гомолог, Clr4, были первыми идентифицированными histone lysine methyltransferases (HMTases) (Rea et al., 2000). Законсервированный SET-домен у Su(var)3-9-related HMTases катализирует метилирование H3-K9, создавая сайт связывания высокого сродства с chromodomain белков heterochromatin protein 1 (HP1) (Lachner and Jenuwein, 2002). Др., способные к метилированию, позиции лизинов м.б. также маркированы с помощью position-specific SET-domain HMTases для methyl-binding chromodomain белков. Геномы мыши и человека кодируют по 50 предполагаемых SET-доменовых белка (Kouzarides, 2002) и по 30 chromodomain-содержащих последовательностей (A. Schleiffer and F. Eisenhaber, personal communication). Тогда как, S. pombe имеют только 10 предполагаемых SET доменовых HMTases, a S. cerevisiae имеет не более 7 (Briggs et al., 2001). Лизиновые остатки являются mono-, di- и tri-метилированными in vivo (Paik and Kim, 1971; van Holde, 1988; Waterborg, 1993). Прогрессивные превращения в направлении tri-methylation м. вносить вклад в очевидную стабильность метилирования гистоновых лизинов и это идеально подходит к наделению дополнительными слоями комбинаторного контроля, который делает возможными как кратовременные, так и долговременные хроматиновые imprints.

На Рис. (poster) показан динамический цикл метилирования гистоновых лизинов при стимуляции или репрессии транскрипции. Маршруты выхода (`Exit routes') из этого цикла обнаруживают более широкое репрограммирование структуры хроматина – напр., во время старения клеток, Polycomb-обеспечиваемой транскрипционной памяти, инактивации Х хромосомы и образования конституитивного гетерохроматина. В такой `road map', различные предназначения для областей хроматина показаны с помощью дорожных знаков (road signs), которые отражают разные позиции и состояния метилирования.

Transcriptional regulation – going around with H3-K4 and H3-K9

В эухроматиновых регионах, соединение транскрипционных факторов со специфическими последовательностями promoter/enhancer является инициальной ступенью в изменении naive хроматиновой матрицы. Если превалируют позитивно действующие комплексы, то соединение promoter-proximal nucleosomes постепенно принимает специфичный для активации модификационный прорфиль (Urnov and Wolffe, 2001; Zhang and Reinberg, 2001; Berger, 2002; Daujat et al., 2002). Полностью активированные промоторы, очевидно обогащены tri-methylated H3-K4 (Santos-Rosa et al., 2002); Базовое состояние транскрипции коррелирует с деметилированием H3-K4, хотя потенциал метилирования вовлекаемых HMTases необходимо ещё определить (Briggs et al., 2001; Nishioka et al., 2002a; Wang et al., 2001a; Santos-Rosa et al., 2002).

Метилирование H3-K9 напротив представляет собой в основном молчащие хроматиновые домены (Noma et al., 2001; Litt et al., 2001), a `activated genome' у S. cerevisiae обнаруживает обильное метилирование H3-K4, но отсутствуют признаки H3-K9 di-methylation (Briggs et al., 2001). Рекрутирование некоторых H3-K9-специфических HMTases индуцирует репрессию генов внутри эухроматина (Tachibana et al., 2001; Nielsen et al., 2001; Vandel et al., 2001; Ogawa et al., 2002; Schultz et al., 2002; Tachibana et al., 2002; Yang et al., 2002). G9a и близко родственный энзим несомненно являются эухроматическими HMTases, которые формируют комплексы с HP1 и субнабором E2F транскрипционных факторов (Ogawa et al., 2002). Эти энзимы м. сами по себе репрессировать промоторы-цели, которые неспособны привлекать дополнительные активационные комплексы.

В пролиферирующих клетках и для G9a-обеспечиваемого метилирования in vivo, репрессивный сигнал в первую очередь появляется как H3-K9 di-methylation (Tachibana et al., 2002) (A. H. Peters, S. Kubicek, L. Perez-Burgos et al., unpublished), хотя in vitro G9a метилирует и H3-K9 и H3-K27. Различия между паттернами H3-K9 di- и tri-methylation д. базироваться на более сильной ассоциации ингибирующих комплексов с промоторами некоторых генов клеточного цикла, в результате чего клетки начинают стареть (S. Lowe, personal communication) или их рост сильно ограничивается с помощью опухолевого супрессора Rb, который м. рекрутировать дополнительные репрессивные HMTases (Nielsen et al., 2001).

Для метилирования гистоновых лизинов не описано прямой (`direct') demethylase. Хотя промежуточные энзимы д. дестабилизировать amino-methyl связи путём окисления или атак радикалов (Chinenov, 2002; Falnes et al., 2002; Trewick et al., 2002), но реверсия ангажированной области хроматина в более naive состояние м. вместо этого запускаться с помощью связанного с транскрипцией замещения гистонов, при котором вариант H3.3 гистона помещается на место модифицированного гистона H3 (Ahmad and Henikoff, 2002a). Подобный механизм не оперирует в транскрипционно молчащих доменах, это м.б. объяснено оборотом метилированных гистонов в эухроматиновых областях, т.к. это позволяет сохранению метилированных гистонов в конституитивном гетерохроматине (Ahmad and Henikoff, 2002b).

Polycomb and trithorax – keeping on track with H3-K27 and H3-K4

Во время дифференцировки `transcriptional memory' поддерживает статус экспрессии определеённых ключевых регуляторных генов в течение многих циклов клеточных делений. Это зависит от антогонистической функции polycomb (Pc-G) и trithorax (trx-G) групп белков (Orlando and Paro, 1995; Pirrotta, 1998). Pc-G protein enhancer of zeste [E(z)] содержит SET домен и становится HMTase, когда образует комплекс с др. рано действующим Pc-G белком, extra sex combs (Esc). У Drosophila E(z)-Esc комплекс (Czermin et al., 2002; Muller et al., 2002) и его аналог Ezh-Eed у млекопитающих (Cao et al., 2002; Kuzmichev et al., 2002) обнаруживают очевидное предпочтение в отношении H3-K27, но м. также находить H3-K9. Ezh/Eed-обусловленное метилирование нуклеосом увеличивает in vitro связывание chromodomain белка polycomb (PC) (Czermin et al., 2002; Kuzmichev et al., 2002). У E(z) мутантов метилирование H3-K27, и возможно также H3-K9, нарушено – способом, указывающим на то, что расширенное H3-K27 di- и tri-methylation вдоль нескольких нуклеосом (Cao et al., 2002) или dual tri-methylation H3-K27 и H3-K9 [(Czermin et al., 2002) R. Paro, personal communication] м. вызывать стабильное рекрутирование комплексов Pc-G. E(z) HMTase комплекс м. онтогенетически регулироваться так, что di-methylating активность подготавливает гистоны к tri-methylating активности, которая умножает транскрипционную память. Однако полное выявление in vivo methyl mark(s) нуждается в разработке высоко специфических H3-K27 и H3-K9 антител.

Длительное поддержание активного состояния транскрпции регулируется с помощью trx-G белков. Белки trx-G Trx/MLL (Milne et al., 2002; Nakamura et al., 2002) и Ash-1 каждый содержит SET домен и обладает HMTase активностью. В то время как Trx комплекс обеспечивает H3-K4 di-methylation (Czermin et al., 2002; Milne et al., 2002; Nakamura et al., 2002), Ash-1 м. метилировать H3-K4, H3-K9 и возможно H4-K20 (Beisel et al., 2002). Ash-1-обусловленное метилирование, по-видимому, предупреждает связывание репрессивных PC и HP1 белков, но облегчает ассоциацию ко-активатора Brahma (Beisel et al., 2002) – др. trx-G белка и компонента nucleosome-mobilising машины. В самом деле метилирование H3-K4 м. запускать Brahma-related ISWI ATPase (T. Kouzarides, personal communication). Т.о., trx-G HMTases делает возможным расширение активированного состояния хроматина с помощью `neutralising' репрессивных меток (напр., метилирования H3-K9 и H4-K20) (Fang et al., 2002; Nishioka et al., 2002b), при этом одновременно купирует позитивный сигнал (H3-K4 метилирование) с ремоделированием хроматина.

X-inactivation – choosing an exit with H3-K9 and H3-K27

Дозовая компенсация у самок млекопитающих связана с инактивацией по всей одной Х хромосоме (Avner and Heard, 2001). H3-K9 метилирование ассоциировано с неактивной Х хромосомой (Xi) (Boggs et al., 2002; Peters et al., 2002; Heard et al., 2001; Mermoud et al., 2002), но и H3-K27 tri-methylation также м.б. значительным, если не главным,признаком (Silva et al., 2003; Plath et al., 2003) (A. H. Peters, S. Kubicek, L. Perez-Burgos et al., unpublished). Выраженное H3-K27 tri-метилирование в Xi согласуется с находкой того, что X-инактивирование явлфется независимым от Suv39h HMTases и не нуждается в HP1 белках (Peters et al., 2002). HMTases, которые нацелены на Xi, осоенно при случайной инактивации Х, неидентифицированы. Наиболее вероятным кандидатом на инициациию раннего метилирования imprints является комплекс Ezh-Eed, т.к. и Ezh2 (Mak et al., 2002) и Eed (Wang et al., 2001c) накапливаются на Xi во время импринтированной X-инактивации. Однако в противположность Pc-G-обусловленному молчанию генов нет доказательств стабильной ассоциации PC или др. Pc-G комплексов с Xi (Silva et al., 2003). Различия в метилировании H3-K27 и H3-K9 должны позволять делать различия между Pc-G-зависимой репрессией (расширенное H3-K27 di- и tri-methylation или комбинация H3-K9 tri- и H3-K27 tri-methylation?) и X-инактивацией (комбинация H3-K9 di- и H3-K27 tri-methylation?). Или возможно. что Xist РНК м. продуцировать дополнительные сигналы для рекрутирования др. Xi-ограниченных HMTases и ассоциированных silencing комплексов. Это м.б. сходно с Xist-зависимым накоплением BRCA1 (Ganesan et al., 2002) и предотвращением оккупации с помощью PC системы и HP1 белков. Незначительные различия в состоянии метилирования lysine positions также м.б. связано с аллель-специфическим импринтингом (Xin et al., 2001; Fournier et al., 2002; Xin et al., 2003).

Constitutive heterochromatin – a one-way street to H3-K9 tri-methylation?

В отличие от эухроматина конституитивных гетерохроматин лишен очевидных транскрипционных единиц, а вместо этого содержит н наборы сателлитных повторов (Karpen and Allshire, 1997; Csink and Henikoff, 1998). Такие повторы, по-видимому, дают – посредством RNAi кухни (machinery) – small heterochromatic RNAs (shRNAs) (Volpe et al., 2002; Hall et al., 2002; Partridge et al., 2002; Mochizuki et al., 2002; Taverna et al., 2002). Эти и др. РНК (Maison et al., 2002) м. спариваться с подлежащими последовательностями ДНК и соединяться с chromodomain-подобными адапторными белками (Akhtar et al., 2000a), которые м. рекрутировать Su(var)3-9-related HMTases (Jenuwein, 2002). Сигнал к H3-K9 метилированию д. затем стабилизироваться и расширятьxcz с помолщью `interlocking' HP1 молекул, чтобы сформировать расширенные домены гетерохроматина (Nakayama et al., 2001; Hall et al., 2002). Более того, H3-K9 метилирование м. запускать метилирование ДНК у Neurospora crassa (Tamaru and Selker, 2001) и Arabidopsis thaliana (Jackson et al., 2002)и сходным образом управлять метилированием ДНК в перицентрических сателлитных повторах у млекопитающих (B. Lehnertz, Y. Ueda, A. A. Derijck et al., unpublished). Комбинация систем гистон- и ДНК-метилирования (Fahrner et al., 2002; Nguyen et al., 2002; Fuks et al., 2003), по-видимому, стабилизирует молчащие домены хроматина, защищая программы генной экспрессии и защищая интеграцию генома.

Перицентрический гетерохроматин обогащен tri-methylated H3-K9. Этот профиль селективно устраняется при разрушении Suv39h HMTases, тогда как центромерные области обладют Suv39h-независимым H3-K9 di-метилированием (A. H. Peters, S. Kubicek, L. Perez-Burgos et al., unpublished). Интересно, что в Suv39h dn клетках, перицентрический гетерорхроматин обнаруживают существенное H3-K9 mono-метилирование (A. H. Peters, S. Kubicek, L. Perez-Burgos et al., unpublished). Suv39h HMTases являются т.о. tri-methylating энзимами, которые м. превращать промежуточные состояния метилирования (mono- или di-methylation) в безусловно более стабильное tri-methylation конечное состояние. Региональное H3-K9 tri-methylation транскрипционно инертных доменов хроматина, следовательно, д.б. прекрасным показателем конституитивного гетерохроматина.