Adhesion assembly, disassembly and turnover in migrating cells – over and over and over again
Donna J. Webb, J. Thomas Parsons and Alan F. Horwitz
nature cell biology
DOI:10.1038/ncb0402-e97
april 2002 volume 4 issue 4 pp E97 - E100
nature cell biology
DOI:10.1038/ncb0402-e97
april 2002 volume 4 issue 4 pp E97 - E100
Клеточная миграция является интегрированным процессом, который нуждается в постоянном, скоррдинированном формировании и расформировании адгезий (слипчивых соединений). Эти процессы сложны и нуждаются в регулируемых взаимодействиях многочисленных молекул и в активации специфических сигнальных путей.
(Рис.1.) | Assay for measuring adhesion turnover in migrating cells.
(Рис.1.) | Assay for measuring adhesion turnover in migrating cells.
Миграция клеток является центральной во многих биологических и патологических процессах. Понимание этого процесса затруднено, т.к. требуется интеграция и и временная координация многих отличающихся процессов, которые происходят в пространнственно разделенных местах клетки.
Миграцию м. рассматривать как многоступенчатый цикл. Основой миграторного цикла является расширение выпячивания, образование стабильного прикрепления рядом с ведущим краем выпячивания, транслокация тела клетки вперед, освобождение адгезий (слипчивых соединений) и ретракций на задней части клетки. Полимеризация сети актинового цитоскелета управляет инициальным расширением плазматической мембраны по фронту клетки. Взаимодействие трансмембранных рецепторов семейства интегринов с внеклеточнм матриксом стабилизирует адгезии путем рекрутирования сигнальныхи цитосклетных белков. Эти малые, формирующиеся адгезивные соединения м. передавать большие силы и служить тягловыми точками для движущих вперед сил, которые и перемещают тело клетки вперед. Устранение адгезий и ретракция задней части клетки завершает миграторный цикл.
Свыше 50 белков выявлено в адгезивных соединениях. Классификация адгезий (слипчивых соединений), которая включает focal adhesions, fibrillar adhesions, focal complexes и podosomes, базируется в первую очередь на морфологии и способе образования адгезий. Напр., фибриллярные адгезии являются центральными структурами, которые содержат α5β1 интегрин, tensin и actopaxin, тогда как фокальные комплексы являются малыми адгезиями, индуцируемыми с помощью активации Rac на периферии клеток. Эти малые адгезии располагаются по фронту клетки, они не обнаруживаются в некоторых типах клеток, которые быстро перемещаются. Под давлением Эти малые адгезии м. созревать в большие, более организованные адгезии, такие как фокальные адгезии, которые являются относительно стабильными структурами и стремятся подваить миграцию клетки. Они, по-видимому, участвуют в генерации контрактильных сил, которые функционируют в процессах, не связанных с миграцией, таких как формирование и ремоделиенование ВКМ.
Механизмы, с помощью которых осуществляется смена аогезий и механизмы, которые регулируют эти процессы, изучены недостаточно. Формирование и разборка адгезий процесс сложный и нуждается в координированном взаимодействии актина или актин-связывающих белков, сигнальных молекул, структурных белков, интегринов, адапторных молекул и микротрубочек (Рис. 1).
The leading edge
Образование выпячивания инициирует миграционный цикл; но прежде всего выпячивание должно быть стабилизировано за счет закрепления на субстрате. Ведущий край, т.е. мембрана и соседняя обасть, содержащая кортикальный актин по фронту выпячивания, по-видимому, является местом действия как образования, так и стабилизации выпячивания. Когда флюоресцентно меченный G-actin микроинъецировали в фибробласты, то он прежде всего включается в ведущий край, где он полимеризуется. Полимеризация этого актина способствует расширению ламеллоподий. Белки, которые регулируют динамику и организаци актина, такие как vasodilator-stimulated phosphoprotein (VASP), Wiskott–Aldrich syndrome protein (WASP), profilin и the Arp 2/3 комплекс, располагаются по периферии выпирающих ламеллоподий. Регуляторы полиеризации актина и образования выпячивания, такие как Rac и его эффектор, p21-activated kinase (PAK), также расположны на или очень близко к ведущему краю. Кроме того, связанные с адгезиями молекулы, включая VASP, integrins, α-actinin и G-protein-coupled receptor-kinase-interacting protein 1 (GIT1) присутствуют на мембране ведущего края. Эти белки, по-видмому, необходимы для связи растущих актиновых филамент на ведущем крае с субстратом, чтобы иницировать или скоординировать сигналы, которые регулируют этот процесс. Но природа инициальной ассоциации адгезивных рецепторов с актином неясна. Возможно, что ассоциация адгезивных рецепторов происходит с кортикальным актином скорее, чем с хорошо упакованным актином, характерным для стрессовых волокон.
Имеющиеся доказательства указывают на то, что образование мест контакта nascent-cell–substratum на ведущем крае и образование выпячивания непосредственно связаны в быстро мигрирующих клетках. Важно отметить, что не все выпячивания стабилизируются с помощью адгезивных комплексов. Во время миграции in vivo, клетки выпячивают и втягивают выступы в течение длительного периода времени, указывая тем самым, что стабилизация выпячивание м. зависеть от плотности лиганда или рецепторов на ведущем крае. Сигналы, которые модулируют жадность (avidity) или сродсто интегринов м. также регулировать адгезии и стабилизацию выпячиваний.
Assembly of adhesions in migrating cells
Получены указания на последовательное рекрутирование индивидуальных, или классов, адгезивных компонентов вокруг центров нуклеации (nucleation) скорее, чем центров стабилизации больших, преформированных цитоскелетных комплексов. Polystyrene бусы, покрытые инегриновыми лигандами или антибиотиками, которые воспроизводят состояние связывания лиганда или агрегации интегринов, были использованы, чтобы показать, что агрегация интегинов индуцирует рекрутирование focal adhesion kinase (FAK) и tensin. Если фосфорилирование тирозина ингибировано, то больших скоплений сигнальных молекул не происходит. Важно, что как связывание, так и агрегация лиганда необходимы для привлечения цитоскелетных белков, таких как α-actinin, vinculin и talin. Изучение в мигрирующих клетках адгезивных компоненнтов, слитых с green fluorescent protein (GFP) или его производными, показало, что paxillin α-actinin рекрутируются последовательно в адгезии. Некоторые сигнальные компоненты, такие как PAK и PAK-interacting exchange factor (PIX), вступают в адгезии в виде малых преформированных комплексов с paxillin. Однако мало доказательств того, что вступают большие уже собранные цитоскелетные комплексы, стабилизированные за счет ассоциации с и прикрепленные к интегринам. Хотя в некоторых случаях компоненты м. поступать одновременно или индивидуально или в виде преформированных комплексов.
<р3 class=my>Adhesion disassembly and turnover in migrating cells
Разборка адгезий происходит как на тыльной сторне клетки, что способствует ретракции задней части клетки, так и во фороне клетки, где она сопровождает образование новых выпячиваний и адгезий. Из-за различий в механизмах первые обозначаются как disassembly (разборка), а последние как turnover (замена). На тыльной стороне мигрирующих клеток, устраненеие адгезий ведет к ретракции клеточных хвостов и общему перемещению тела клетки вперед. Ослабление или усиление связи между интегринами и ВКМ (extracellular matrix (ECM)), по крайней мере частично, управляется контрактилтьными силами. В этих условиях интегрины остаются ассоциированными с субстратом, а внуриклеточные адгезивные компоенты, которые находятся под давлением, скользят в направлении тела клетки и в конечном счете 'диспергируют'. Цитоскелетные компоненты, такие как paxillin α-actinin, не обнаруживаются в следах ('footprints') позади клетки, укзывая тем самым, что происходит расшепление связей с цитосклететом на или очень близко от интегрина. Транслокация адгезивных компонентов выявлена и при некоторых др. исследованиях. Недавно был использован photobleaching, чтобы показать увеличение диффузии β3 интегринов в скользящих адгезиях на тыльной стороне клетки по сравнению со стационарными адгезиями во форонте, это указывает на снижение сродства или жадности интегринов к одному или нескольким типам молеккул, с которыми они ассоциируют.
Разборка адгезий это, по-видимому, не просто обратный ход механизмов сбоки. На тыльной строне клетки paxillin α-actinin покидают адгезии примерно в одно время, тогда как эти же молекулы рекрутируются в адгезии последовательно. Zyxin и paxillin являются наиболее ранними компонентами вновь образующихся адгезий; но zyxin исчезает раньше paxillin при разборке адгезий в задней части клетки.
Во фронте клетки paxillin-содержащие адгезии в ходе цикла выпячивания превращаются в новые адгезии, образующиеся на ведущем крае (Рис. 1). Молекулярный состав этих адгезий, по крайней мере частично, предопределяет будут ли эти адгезии меняться (turn over). Напр., если α-actinin обнаруживается в этих адгезиях, то они более не будут использоваться для обмена, а m,elen направляться внутрть тела клетки. Следовательно, упорядоченная поставка различных адгезивных белков м. предопределять судьбу адгезий, turnover или maturation.
Regulators of adhesion turnover
Rho семейство малых GTPases является ключевым регулятором динамики адгезий. В мигрирубющих клетках Rac необходим для образования новых адгезий во фронте клетки, а Rho необходим для созревания имеющихся контактов. Rac м регулировать обмен адгезий или непосредственно через нижестоящие эффекторы и/или косвенно противодействуя Rho. Эффектор Rac, PAK, участвует в разборке фокальных адгезий. Т.к. PAK имеет нескоько возможных мишеней, включая myosin light-chain kinase (MLCK) и LIM kinase (LIMK), обе из которых регулируют динамику цитоскелета, то еще неясно, как PAK влияет на стабильность адгезий.
Rho участвует в разборке адгезий на тыльной сторне клетки. Rho и его эффектор, Rho kinase (p160ROCK), способствуют ретракции хвостов мигрирующих моноцитов, возможно благодаря изменению сродвста и/или жадности интегринов. Ингибирование Rho киназы или MLCK ведет к удлиннению клеточных хвостов. Активация PAK также вовлечена в ретракцию через свои эффекты на контракцию и отсоединение на тыльной стороне клетки.
Клетки от нокаутных мышей используют различные молекулы для обмена адгезий. Фибробласты от мышей без FAK (FAK null mice) имеют сниженную скорость миграции клеток, пониженную скорость распространения и увеличение числа и резмеров локализованных на периферии адгезий. Предполагается, что увеличение адгезий на периферии возникает в результате подавления обмена в FAK-/- клетках, что м.б. результатом постоянной активации Rho. Установлено, что FAK имеет сайт аутофосфорилирования (Tyr 397), киназную активность и первую богатую пролином SH3-связывающую область, все они необходимы для FAK-enhanced миграции. Фибробласты от мышей без Src (Src knockout mice) также обнаруживают снижение подвижности, скорости распространения клеток и дефицит по трем членам семейства Src, Fyn и Yes. Следовательно, FAK и Src участвуют в обене адгезии.
Тирозин фосфатазы также участвуют в обмене адгезий. У нейтрофилов ингибирование Ca2+/калмодулином-активируемой протеин фосфатазы (calcineurin) препятствует отсоединению клеток и уменьшает миграцию. Фибробласты с дефицитом SHP-2 phosphatase обнаруживают увеличенные количества адгезий и нарушение распрсостранения и миграции клеток. Фенотипы SHP-2-/- и FAK-/- очень сходны, это указывает на то, что эти молекулы модулируют общий путь регуляции миграции клеток и динамики адгезий. Эта гипотеза подтверждается тем, что фосфорилирование FAK усилено в SHP-2-/- клетках. Фибробласты без protein tyrosine phosphatase (PTP)-PEST имеют серьезные нарушения миграции и повышенные количества и размеры алдгезий. Дефекты, по-видимому, являются результатом гиперфосфорилирования p130Cas, субстрата PTP-PEST. Cas-/- фибробласты также обнаруживают серьезные дефекты в распределении и миграции клеток.
В дополнение к сигнальным компонентам calpain и микротрубочки участвуют в разбеорк и обмене адгезий. Calpain кальций-зависимая потеаза, которая имеет несколько связанных с адгезией субстратов, включая интегрины, FAK и talin. Клетки, обработанные ингибиторами, и calpain-/- фибробластя имеют длинные хвосты, задержку миграции и большие периферические адгезии. Микротрубочки, по-видимому, способствуют разборке адгезий в задней части клеток за счет модулирования контрактильности и и высвобождения relaxing субстанций, природа которых неизвестна. Вклад механических сил в процессы разборки и обмена адгезий не м.б. переоценен. Контрактильные силы м. способстсовать устранению адгезий на тыльной стороне клеток за счет физического разрыва слабых или ослабленных молекулярных взаимодействий. Следовательно, механические силы вместе с химическими модификациями управляют разборкой адгезий.
Intracellular transport of adhesion molecules
Признаком мигрирующих клеток является выраженная полярночть, отражающаяся в широких ламелоподиях, часто подчеркивающих ретракцию задних чатей клеток. Суммарное движение веред по стабильным адгезиям ведет к накоплению адгезивных компонентов в задней части клеток вдали от ведущего края. В поляризованных мигрирующих клетках существует механизм, который движет эти компоненты из задней части клетки во фронт, где они используются для формирования новых выпячиваний а адгезий. Несколько механизмов м. транспортировать интегрины по этому пути. Эндоцитотические пузырьки м. перемещать матриал непосредственно во фронт или пузырьки м. проходить через путь эндосомного рециклинга.
Установлено, что интегрин-содержащие пузырьки движутся от задней части клетки в околоядерную область. Показано также, что затем из околоядерной области они движутся к основанию ламеллоподий фибробластов и в компартмент эндосомного рециклинга вблизи клеточного фронта в нецтрофилах. Но везикулярный транспорт интегринов во фронт клетки наблюдается в мигрирующих фибробластах, хотя такое движение м.б. маскировано высокими конц. интегрин-содержащих пузырьков в околядерной области. Обнаружено перемещение таких пузырьков и от ведущих ламеллоподий к околоядерной области. Неясно направляются ли такие пузырьки для деградации или рециклинга. Др. пути, такие как направленный ток вдоль элементов цитоскелета, которые направляют к сайтам контакта с субстратом и м. перемещать различные адгезивные молекулы во фронт клетки.
Имеются доказательства, что сгнальные молекулы транспортируются в комплексах в и из функциональных регионов клетки по пути больших околоядерных цитоплазматических компартментов. Семейство ADP-ribosylation factor (ARF) малых GTPases и их GAPs участвует в этом процессе. ARF-GAP белок p95-APP1 улучшает образование выпячиваний с помощью механизма, зависящего от Rac и ARF6. p95APP1 локализуется вместе с Rac в эндосомных компартментах, указывая тем самым, что этот ARF-GAP участвует в высвобождении Rac в плазматическую мембрану. Распределение p95APP1 между эндосомным компартментом и мембраной регулируется с помощью ARF-GAP домена. ARF1 обеспечивает рекрутирование paxillin из околоядерной области к адгезиям. PAG3, который является белком, связывающим ARF-GAP и paxillin binding protein, ингибирует привлечение paxillin в адгезии.
GIT1, др. ARF-GAP белок, совершает циклы междв адгезиями, ведущим краем и цитоплазматическими комплексами. Цитоплазматические структуры, которые также содержат paxillin, PAK и PIX, являются не везикулярными, а представлены мультивезикулярными комплексами. GIT1 направляется постоянно активируемой PAK в адгезии и ведущий край благодаря его взаимодействию с paxillin. Это указывает на то, что эти мультимолекулярные комплексы м. регулировать внутриклеточное распределение сигнальных молекул, таких как PAK, между адгезиями, цитоплазмой и ведущим краем мигрирующих клеток. Участвует ли ARF-GAP активность GIT1 в таргетинге, неизвестно.
Conclusions
Миграция клеток является сложным процессом, который нуждается в постоянной скоординированной сборке и разборке адгезий. Идентифицированы адгезивные компоненты и молекулы, которые регулируют этот процесс. Локальная активация и инактивация этих регуляторов и механизмы, с помощью которых они модулируют формирование и разборку адгезий, ключевой вопрос. Как регуляторные молекулы влияют на добавление или удаление адгезивных компонентов - кардинальный вопрос.
Conclusions
Миграция клеток является сложным процессом, который нуждается в постоянной скоординированной сборке и разборке адгезий. Идентифицированы адгезивные компоненты и молекулы, которые регулируют этот процесс. Локальная активация и инактивация этих регуляторов и механизмы, с помощью которых они модулируют формирование и разборку адгезий, ключевой вопрос. Как регуляторные молекулы влияют на добавление или удаление адгезивных компонентов - кардинальный вопрос.
Наконец, механизмы, с помощью которых молекулы находят формирующиеся адгезивные соединения и удаляются из распадающихся адгезий, еще одиннерешенный вопрос. Имеющиеся доказательства ограничены путями прежде всего интегринов и их относительный вклад все еще нуждается в подтверждении. Выявлен дополнительный механизм транспорта через подвижные сигнальные комплексы, содержащие членов ARF-GAP, paxillin, PAK и PIX.