
Partha Roy, Zenon Rajfur, Pawel Pomorski and Ken Jacobson Microscope-based techniques to study cell adhesion and migration nature cell biology DOI:10.1038/ncb0402-e91 april 2002 volume 4 issue 4 pp E91 - E96
Современная световая микроскопия используется для проведения различных количественных imaging techniques, а также для нарушения структурно-функциональных взаимотношений в живых клетках. Эти прогрессивные методы осоенно пригодны для изучения клеточной адгезии и миграции (Рис.1.) \| Techniques to determine dynamic composition, molecular association and transport/exchange for adhesive components. (Рис.2.) \| Light-directed molecular perturbation techniques. (Рис.3.) \| Traction force microscopy	Функционально, слипчивые соединения (adhesions), особенно focal adhesions, сложны. В ответ на внеклеточные механические сигналы эти адгезивные структуры функционируют также как молекулярные передатчики, генерирующие каскад внуриклеточных биохимических сигналов (outside-in signalling), которые влияют на критические клеточные процессы, включая реорганизацию цитоскелета, ход клеточного цикла, экспрессию генов и запрограммированную гибель клеток. Ratiometric microscopy to determine the compositional dynamics of adhesive structures Fluorochrome-conjugated антитела и с green fluorescent protein (GFP)-слитые белки дают картины высокого разрешения распределения белков в клетке. Множественное окрашивание позволяет ко-локализовать различные белки в клетке (с разрешением 300 nm). Fluorescence ratio imaging (FRI) метод недавно удалось приложить для semiquantification множественно окрашенных флюоресцентных картин. Этот метод особенно пригоден для изучения белков, формирующих четкие, хорошо выявляемые структуры, такие ка фокальные адгезии (схематическое избражение на Рис. 1a). Относительные изменения в конц. белков м.б. подсчитаны как функция времени. Напр., соотношение изображений phosphotyrosine (PY)-содержащих белков и тензина в фокальных адгезиях и фибрилярных полосках показывает, что низкое соотношение PY к тензину вдоль богатых тензином фибриллярных адгезий происходит в основном в центре клетки. Fluorescence resonance energy transfer (FRET): assessing intramolecular association in vivo FRET все шире используется для изучения интимных межбелковых взаимодействий in vivo. Non-radiative перенос энергии м. происходить от возбужденной флюоресцентной молекулы, донора, ко второй ближайшей невозбужденной флюоресцентной молекуле, акцептору, так что акцептор флюоресцирует, а эмиссия донора снижается (Рис. 1b). Однако, процесс переноса происходит только когда имеют место определенные строгие условия. Эффективность переноса энергии зависит от удаленности акцептора от донора и снижается на 50% при т.наз. Forster расстоянии (в пределах 2–7 nm), выявляются лишь интимные межбелковые или внутрибелковые ассоцииации. Напр., внутримолекулярный FRET выявил детеали процесса сборки фибронектиновых (FN) фиьбрилл. Когда несобранный FN впервые появляется на клеточной поверхности донорская и акцепторные молекулы оказываются в тесной близи в результате конформационной гибкости и в результате выявляется внутримолекулярный FRET. Однако, со временем увеличивается разделение между донором и акцептором FN в фибрилах и сигнал FRET исчезает. Использование вариантов GFP, которые действуют как пары переноса энергии является важной тенденцией в применении FRET. Сyan–yellow fluorescent protein (CFP–YFP) и blue–green fluorescent protein (BFP–GFP) тандемы наиболее часто используются в качестве пар для FRET. FRET анализ является основой для некоторых важных биосенсорных методов изучения передачи сигналов, включая цАМФ, кальций и активированный Rac. Он используется также для изучения пространственно-временного распределения индуцированных ростовыми факторами Ras и Rap1 Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) to measure molecular transport and exchange Техника photobleaching пригодна для измерения транспорта молекул на повержности и внутри живых клеток, а также скорости обмена молекул с существующими структурами. Такие методы базируются на фотообесцвечивании (photobleaching) определенных областей( 0.5 μm) клетки, нарушая испускаемую флюоресценцию этой областью; затем восстановление флюоресценции в данной области отражает тип работающих транспортных процессов (Рис. 1c). Восстановление м.б. вызвано или диффузией и/или притоком флюоресцентных молекул из unbleached резервуара в обесцвеченную область мембраны или цитоплазмы. В самом деле, техника FRAP возрождена в результате использования слитых с GFP белков. Разработаны подходы, напр., для изучения переноса белков в одиночных клетках. В относительно статичных структурах, восстановление м. отражать обмен определенными меченными компонентами, такими как α-actinin, между цитоплазматическим пулом и стрессовыми волокнами/фокальными адгезиями. Photo-activation and CALI: The perturbation of molecular function within single cells Использование управляемых светом методов,таких как фотоактивация и Chromophore Assisted Laser Inactivation (CALI), вызывают почти немедленные пертурбации в функциональной активности специфических белков или во всей клетке или в определенной области. Техника фотоактивации зависит от фотолитического высвобождения УФЛ-абсорбирующих nitrobenzyl-based caging половин, которые ковалентно прикреплены к или вблизи активного сайта белка, так что ею плененная (caged) форма активности белка ингибируется (Рис. 2a). Абсорбция 360-nm света вызывает фотолизис связей между упаковывающей (caging) группой и избранным реагентом, это ведет к немедленной активации различных физиологических модуляторов, включая высвобождение кальция или буферных агентов, ингибиторных пептидаз, протеин киназ и актина или актин связывающих белков. Установлены, напр., специфические изменения в направлении локомоции кератоцитов в результате локального высвобождения caged thymosin β4 ( actin-секвестрирующий белок) в одном 'wing' клетки (Рис. 2b). CALI успешно используется для локальной инактивации белков в живых клетках и является альтернативой генетический делеции и инактивации антителами. A CALI chromophore (malachite green/fluorescein)-меченные антитела, внесенные в клетку, находят интересующий белок. Интересующая область облучается интенсивным лазерным лучом на длине волны, соответствующей абсорбционному максимуму хромофора. Облученный хромофор фотохимически продуцирует высоко реактивные свободные радикалы, которые, в свою очередь, инактивируют белки-мишени (Рис. 2c). Т.к. радикалы живут недолго, то радиус инактивации очень ограничен, в большинстве случаев оказывается инактивированным только антиген. In vitro GFPs м. функционировать как CALI хроматофоры. В самом деле, лакальная CALI иррадиация enhanced GFP (EGFP)–α-actinin-содержащих фокальных адгезий часто нарушает связь между стрессовыми волокнами, прикрепленными к облучаемым фокальным адгезиям (Рис. 2d). Эффект специфичен, т.к. CALI of EGFP–focal adhesion kinase (FAK), локализованных в фокальных адгезиях, не вызывает отсоединения стрессовых волокон и ретракции, указывая тем самым, что FAK выполняет скорее регуляторную функцию. . Measurement of forces exerted by cells Клеточные движущие силы впервые были визуализованы качественно в виде морщин на деформируемом силиконовом каучуковом субстрате, отражающими движущие силы, генерируемые жвижущимися фибробластами. Теперь движущие силы м. изучать или с помощью двумерных смещений отправного beads, внедренного в деформируемый субстрат (Рис. 3a) или с помощью реакции индивидуальных элементов, чувствительных к силе. Такие методы дают дискритезированное приближение к паттерну непрерывных тракционных усилий. Так, кератоциты рыбных чешуек движутся на силикон каучуковом субстрате и приводят к неожиданным заключениям, что большинство наблюдаемых тракций являются перпендикулярными направлению движения, а движущие вперед тракции приложимы к крыльям кеатоцитов. Этот подход привел к выявлению выталкивающий тракций вблизи ведущего края движущихся фибробластов (Рис. 3b). Так, флюоресцентные кусочки м.б. использованы в качестве маркеров в геле, а dual channel fluorescence микроскопия позволяет определять корреляцию тракционных усилий по отношению к пространственно локализации или GFP-слитого или fluorescently-меченных белков фокальных адгезий. Напр., используя GFP–zyxin в качестве адгезивного маркера, неожиданно обнаружили, что малые формирующиеся фокальные аогезии под ведущим краем мигрирующих клеток осуществляют более значительные тракционные усилия, чем большие зрелые фокальные адгезии. Напротив, субстраты, содержащие набор force-sensing элементов, м.б. microfabricated. В одном из подходов получен силиконовый субстрат, который содержит флексибельные консоли известных bending stiffness, на верхушках которых имеются маленькие подушечки. которые м.б. покрыты белками ВКМ, чтобы облегчить прекрепление клетки. Силы, генерируемые дивижущимися по этим подушечкам клетками, м.б. подсчитаны (computed) непосредственно по отклонениям beams консолей. Альтернативный подход использует силиконовый эластомерный субстрат, который micropatterned (меняет микрорисунок), давая регулярный набор или поверхностных углублений или выпячиваний субмикроновых размеров. Изменение поверхности micropattern, вызываемое клетками м.б. компьютером переведено на клеточные движущие силы аод отдельными фокальными адгезиями. Комплементарный подход оптического слежения заключается в подсчете локальных дорсальных поверхностных тракций путем измерения сил на полистереновых кусочках, прикрепленных к поверхности клеток (покрытых или лигандами ВКМ или др. антителами). Все это позволяет определять корреляции усилий с молекулярными force-transmitting составляющими адгезивных структур. Микроскопическая техника начинает выявлять некоторые из сигнальных событий в слипчивых соединениях. Разные типы микроманипуляций демонстрируют, что приложение физического стресса к клеткам вызывает рекрутирование актиновых филамент в местах силового воздействия, увеличивая цитоскелетную жесткость и рост фокальных контактов, назависящий от Rho-обеспечиваемой контрактильности. Клетки также чувствительны к степени механической резистентности окружающего матрикса и в ответ регулируют цитоскелет, активность выпячиваний и миграцию. Исследования с помощью оптических пинцетов демонстрируют, что тракционные силы, передваемые через cytoskeleton–integrin связи, скорее всего осуществляются в прямой пропорции к ригидности внкелточного окружения и что прикрепление цитоскелета к плазматической мембране регулируется с помощью пути phosphoinositide-метаболизма. Ригидность локального механического окружения м. пространственно регулировать адгезию клеток с матриксом как в терминах сил, так и молекулярной композиции, продуцируя пространственно дифференцированные адгезии и соотв. миграцию клеток в направлении регионов с высокой ригидностью. Outlook Техника single molecule imaging GFP–cadherins идентифицировала олигомеры, которые м.б. предшественниками слипчивых соединений. Техника single-molecule fluorescence используется для измерения латеральной диффузии и кинетики связывания лиганда индивидуальных G protein-coupled рецепторов, участвующих в хемотаксисе. Стоящие ниже инициального события связывания лиганда одиночные молекулярные пары FRET обладают потенциалом детекции передачи сигнала между партнерами пары. Так, если индивидуальные GFP–H-Ras молекулы встречают своих партнеров по сигнальной трансдукции, таких как Alexa-conjugated Ras связывающий домен Raf-1,то FRET сигнал обнаруживается в течение нескольких сотен миллисекунд. В будущем м.б. наблюдатьпоследовательне реакции, связанные с избранными путфми, которые передают сигналы, возникающие в результате адгезивных событий. Техника image correlation spectroscopy (ICS), тип fluorescence correlation spectroscopy (FCS). ICS позволяет коррелировать пространственные флюктуации, которые возникают в разных структурах образца; следовательно, м.б. извлечена информация о кластрировании различных компонентов. Получая серии картин, временные флюктуации также м.б. скоррелированы, давая локальный коэффициент диффузии флюоресцентного компонентаи абсолютное количество диффундирующих единиц. Т.о., если данный белок ассоциирует с др. белками, то м. б. увидеть не только уменьшение их коэффициента латеральной диффузии, но и снижение количества diffusants. Напр., с помощью этой техники выявлено раннее присоединение интегринов к различным структурным и регуляторным партнерам в мигрирующих клетках прежде чем эти комплексы становятся видимыми микроскопически. Фактически, сканирование two-photon microscopy measurements of GFP–integrin fusion белков демонстрирует возможности этого подхода. С помощью two-photon возбуждения, некоторые fluorophores зачастую м.б. легко возбуждены (co-excited), позволяя разным адгезивным компонентам быть взаимно скореллированными, чтобы определить какая молекула ассоциирует и с какой. Значительно улучшено пространственно-временное разрешение определенных механических свойств живых клеток. Способ force-mapping с помощью atomic force microscope, это точная 'pixel by pixel' cell-poking техника, позволяет определять кортикальную жесткость с субмикроновым пространственным и субсекундным временным разрешением. Техника используется для мониторинга различий в жесткости между выпячивающимся и стабильным краем подвижных фибробластов и для пространственно-временного картирования изменений кортикальной жесткости во время клеточных делений. Возможна точная запись изменений кортикальных механических свойств после передачи механохимических сигналов или пертурбаций. Equally important are the advances in so-called 'active' substrates. Субстраты теперь м.б химически приспособлены к определенным пространственным паттернам, чтобы осуществить дифференциальные адгезивные паттерны в клетках, дающие обнаружимые функциональные последствия. Однако, адгезивные и\или механические свойства субстрата м. варьировать во времени и пространстве запрограммированным образом. Используя фотоактивацию или CALI м.б. изменены адгезивные свойства субстратов (или адгезивные комплексы клеток) light-addressable образом, даже при super-optical разрешении (<100 nm) с помощью nearfield scanning optical microscopy (NSOM). Возможно также, что сфабрикованная система piezo-resistive консолей в силиконе м.б. запрограммирована для создания различных субклеточных механических препятсвий миграции, чтобы симулировать естественные вариации, обнаруживаемые в тканях или структурах ВКМ.

Функционально, слипчивые соединения (adhesions), особенно focal adhesions, сложны. В ответ на внеклеточные механические сигналы эти адгезивные структуры функционируют также как молекулярные передатчики, генерирующие каскад внуриклеточных биохимических сигналов (outside-in signalling), которые влияют на критические клеточные процессы, включая реорганизацию цитоскелета, ход клеточного цикла, экспрессию генов и запрограммированную гибель клеток.

Ratiometric microscopy to determine the compositional dynamics of adhesive structures

Fluorochrome-conjugated антитела и с green fluorescent protein (GFP)-слитые белки дают картины высокого разрешения распределения белков в клетке. Множественное окрашивание позволяет ко-локализовать различные белки в клетке (с разрешением 300 nm).

Fluorescence ratio imaging (FRI) метод недавно удалось приложить для semiquantification множественно окрашенных флюоресцентных картин. Этот метод особенно пригоден для изучения белков, формирующих четкие, хорошо выявляемые структуры, такие ка фокальные адгезии (схематическое избражение на Рис. 1a). Относительные изменения в конц. белков м.б. подсчитаны как функция времени. Напр., соотношение изображений phosphotyrosine (PY)-содержащих белков и тензина в фокальных адгезиях и фибрилярных полосках показывает, что низкое соотношение PY к тензину вдоль богатых тензином фибриллярных адгезий происходит в основном в центре клетки.

Fluorescence resonance energy transfer (FRET): assessing intramolecular association in vivo

FRET все шире используется для изучения интимных межбелковых взаимодействий in vivo. Non-radiative перенос энергии м. происходить от возбужденной флюоресцентной молекулы, донора, ко второй ближайшей невозбужденной флюоресцентной молекуле, акцептору, так что акцептор флюоресцирует, а эмиссия донора снижается (Рис. 1b). Однако, процесс переноса происходит только когда имеют место определенные строгие условия. Эффективность переноса энергии зависит от удаленности акцептора от донора и снижается на 50% при т.наз. Forster расстоянии (в пределах 2–7 nm), выявляются лишь интимные межбелковые или внутрибелковые ассоцииации. Напр., внутримолекулярный FRET выявил детеали процесса сборки фибронектиновых (FN) фиьбрилл. Когда несобранный FN впервые появляется на клеточной поверхности донорская и акцепторные молекулы оказываются в тесной близи в результате конформационной гибкости и в результате выявляется внутримолекулярный FRET. Однако, со временем увеличивается разделение между донором и акцептором FN в фибрилах и сигнал FRET исчезает.

Использование вариантов GFP, которые действуют как пары переноса энергии является важной тенденцией в применении FRET. Сyan–yellow fluorescent protein (CFP–YFP) и blue–green fluorescent protein (BFP–GFP) тандемы наиболее часто используются в качестве пар для FRET.

FRET анализ является основой для некоторых важных биосенсорных методов изучения передачи сигналов, включая цАМФ, кальций и активированный Rac. Он используется также для изучения пространственно-временного распределения индуцированных ростовыми факторами Ras и Rap1

Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) to measure molecular transport and exchange

Техника photobleaching пригодна для измерения транспорта молекул на повержности и внутри живых клеток, а также скорости обмена молекул с существующими структурами. Такие методы базируются на фотообесцвечивании (photobleaching) определенных областей( 0.5 μm) клетки, нарушая испускаемую флюоресценцию этой областью; затем восстановление флюоресценции в данной области отражает тип работающих транспортных процессов (Рис. 1c). Восстановление м.б. вызвано или диффузией и/или притоком флюоресцентных молекул из unbleached резервуара в обесцвеченную область мембраны или цитоплазмы. В самом деле, техника FRAP возрождена в результате использования слитых с GFP белков. Разработаны подходы, напр., для изучения переноса белков в одиночных клетках. В относительно статичных структурах, восстановление м. отражать обмен определенными меченными компонентами, такими как α-actinin, между цитоплазматическим пулом и стрессовыми волокнами/фокальными адгезиями.

Photo-activation and CALI: The perturbation of molecular function within single cells

Использование управляемых светом методов,таких как фотоактивация и Chromophore Assisted Laser Inactivation (CALI), вызывают почти немедленные пертурбации в функциональной активности специфических белков или во всей клетке или в определенной области.

Техника фотоактивации зависит от фотолитического высвобождения УФЛ-абсорбирующих nitrobenzyl-based caging половин, которые ковалентно прикреплены к или вблизи активного сайта белка, так что ею плененная (caged) форма активности белка ингибируется (Рис. 2a). Абсорбция 360-nm света вызывает фотолизис связей между упаковывающей (caging) группой и избранным реагентом, это ведет к немедленной активации различных физиологических модуляторов, включая высвобождение кальция или буферных агентов, ингибиторных пептидаз, протеин киназ и актина или актин связывающих белков. Установлены, напр., специфические изменения в направлении локомоции кератоцитов в результате локального высвобождения caged thymosin β4 ( actin-секвестрирующий белок) в одном 'wing' клетки (Рис. 2b).

CALI успешно используется для локальной инактивации белков в живых клетках и является альтернативой генетический делеции и инактивации антителами. A CALI chromophore (malachite green/fluorescein)-меченные антитела, внесенные в клетку, находят интересующий белок. Интересующая область облучается интенсивным лазерным лучом на длине волны, соответствующей абсорбционному максимуму хромофора. Облученный хромофор фотохимически продуцирует высоко реактивные свободные радикалы, которые, в свою очередь, инактивируют белки-мишени (Рис. 2c). Т.к. радикалы живут недолго, то радиус инактивации очень ограничен, в большинстве случаев оказывается инактивированным только антиген. In vitro GFPs м. функционировать как CALI хроматофоры. В самом деле, лакальная CALI иррадиация enhanced GFP (EGFP)–α-actinin-содержащих фокальных адгезий часто нарушает связь между стрессовыми волокнами, прикрепленными к облучаемым фокальным адгезиям (Рис. 2d). Эффект специфичен, т.к. CALI of EGFP–focal adhesion kinase (FAK), локализованных в фокальных адгезиях, не вызывает отсоединения стрессовых волокон и ретракции, указывая тем самым, что FAK выполняет скорее регуляторную функцию. .

Measurement of forces exerted by cells

Клеточные движущие силы впервые были визуализованы качественно в виде морщин на деформируемом силиконовом каучуковом субстрате, отражающими движущие силы, генерируемые жвижущимися фибробластами. Теперь движущие силы м. изучать или с помощью двумерных смещений отправного beads, внедренного в деформируемый субстрат (Рис. 3a) или с помощью реакции индивидуальных элементов, чувствительных к силе. Такие методы дают дискритезированное приближение к паттерну непрерывных тракционных усилий. Так, кератоциты рыбных чешуек движутся на силикон каучуковом субстрате и приводят к неожиданным заключениям, что большинство наблюдаемых тракций являются перпендикулярными направлению движения, а движущие вперед тракции приложимы к крыльям кеатоцитов.

Этот подход привел к выявлению выталкивающий тракций вблизи ведущего края движущихся фибробластов (Рис. 3b). Так, флюоресцентные кусочки м.б. использованы в качестве маркеров в геле, а dual channel fluorescence микроскопия позволяет определять корреляцию тракционных усилий по отношению к пространственно локализации или GFP-слитого или fluorescently-меченных белков фокальных адгезий. Напр., используя GFP–zyxin в качестве адгезивного маркера, неожиданно обнаружили, что малые формирующиеся фокальные аогезии под ведущим краем мигрирующих клеток осуществляют более значительные тракционные усилия, чем большие зрелые фокальные адгезии.

Напротив, субстраты, содержащие набор force-sensing элементов, м.б. microfabricated. В одном из подходов получен силиконовый субстрат, который содержит флексибельные консоли известных bending stiffness, на верхушках которых имеются маленькие подушечки. которые м.б. покрыты белками ВКМ, чтобы облегчить прекрепление клетки. Силы, генерируемые дивижущимися по этим подушечкам клетками, м.б. подсчитаны (computed) непосредственно по отклонениям beams консолей. Альтернативный подход использует силиконовый эластомерный субстрат, который micropatterned (меняет микрорисунок), давая регулярный набор или поверхностных углублений или выпячиваний субмикроновых размеров. Изменение поверхности micropattern, вызываемое клетками м.б. компьютером переведено на клеточные движущие силы аод отдельными фокальными адгезиями. Комплементарный подход оптического слежения заключается в подсчете локальных дорсальных поверхностных тракций путем измерения сил на полистереновых кусочках, прикрепленных к поверхности клеток (покрытых или лигандами ВКМ или др. антителами).

Все это позволяет определять корреляции усилий с молекулярными force-transmitting составляющими адгезивных структур. Микроскопическая техника начинает выявлять некоторые из сигнальных событий в слипчивых соединениях. Разные типы микроманипуляций демонстрируют, что приложение физического стресса к клеткам вызывает рекрутирование актиновых филамент в местах силового воздействия, увеличивая цитоскелетную жесткость и рост фокальных контактов, назависящий от Rho-обеспечиваемой контрактильности. Клетки также чувствительны к степени механической резистентности окружающего матрикса и в ответ регулируют цитоскелет, активность выпячиваний и миграцию. Исследования с помощью оптических пинцетов демонстрируют, что тракционные силы, передваемые через cytoskeleton–integrin связи, скорее всего осуществляются в прямой пропорции к ригидности внкелточного окружения и что прикрепление цитоскелета к плазматической мембране регулируется с помощью пути phosphoinositide-метаболизма. Ригидность локального механического окружения м. пространственно регулировать адгезию клеток с матриксом как в терминах сил, так и молекулярной композиции, продуцируя пространственно дифференцированные адгезии и соотв. миграцию клеток в направлении регионов с высокой ригидностью.

Outlook

Техника single molecule imaging GFP–cadherins идентифицировала олигомеры, которые м.б. предшественниками слипчивых соединений. Техника single-molecule fluorescence используется для измерения латеральной диффузии и кинетики связывания лиганда индивидуальных G protein-coupled рецепторов, участвующих в хемотаксисе. Стоящие ниже инициального события связывания лиганда одиночные молекулярные пары FRET обладают потенциалом детекции передачи сигнала между партнерами пары. Так, если индивидуальные GFP–H-Ras молекулы встречают своих партнеров по сигнальной трансдукции, таких как Alexa-conjugated Ras связывающий домен Raf-1,то FRET сигнал обнаруживается в течение нескольких сотен миллисекунд. В будущем м.б. наблюдатьпоследовательне реакции, связанные с избранными путфми, которые передают сигналы, возникающие в результате адгезивных событий.

Техника image correlation spectroscopy (ICS), тип fluorescence correlation spectroscopy (FCS). ICS позволяет коррелировать пространственные флюктуации, которые возникают в разных структурах образца; следовательно, м.б. извлечена информация о кластрировании различных компонентов. Получая серии картин, временные флюктуации также м.б. скоррелированы, давая локальный коэффициент диффузии флюоресцентного компонентаи абсолютное количество диффундирующих единиц. Т.о., если данный белок ассоциирует с др. белками, то м. б. увидеть не только уменьшение их коэффициента латеральной диффузии, но и снижение количества diffusants. Напр., с помощью этой техники выявлено раннее присоединение интегринов к различным структурным и регуляторным партнерам в мигрирующих клетках прежде чем эти комплексы становятся видимыми микроскопически. Фактически, сканирование two-photon microscopy measurements of GFP–integrin fusion белков демонстрирует возможности этого подхода. С помощью two-photon возбуждения, некоторые fluorophores зачастую м.б. легко возбуждены (co-excited), позволяя разным адгезивным компонентам быть взаимно скореллированными, чтобы определить какая молекула ассоциирует и с какой.

Значительно улучшено пространственно-временное разрешение определенных механических свойств живых клеток. Способ force-mapping с помощью atomic force microscope, это точная 'pixel by pixel' cell-poking техника, позволяет определять кортикальную жесткость с субмикроновым пространственным и субсекундным временным разрешением. Техника используется для мониторинга различий в жесткости между выпячивающимся и стабильным краем подвижных фибробластов и для пространственно-временного картирования изменений кортикальной жесткости во время клеточных делений. Возможна точная запись изменений кортикальных механических свойств после передачи механохимических сигналов или пертурбаций.

Equally important are the advances in so-called 'active' substrates. Субстраты теперь м.б химически приспособлены к определенным пространственным паттернам, чтобы осуществить дифференциальные адгезивные паттерны в клетках, дающие обнаружимые функциональные последствия. Однако, адгезивные и\или механические свойства субстрата м. варьировать во времени и пространстве запрограммированным образом. Используя фотоактивацию или CALI м.б. изменены адгезивные свойства субстратов (или адгезивные комплексы клеток) light-addressable образом, даже при super-optical разрешении (<100 nm) с помощью nearfield scanning optical microscopy (NSOM). Возможно также, что сфабрикованная система piezo-resistive консолей в силиконе м.б. запрограммирована для создания различных субклеточных механических препятсвий миграции, чтобы симулировать естественные вариации, обнаруживаемые в тканях или структурах ВКМ.