Wienholds, E. et al. The microRNA-producing enzyme Dicer1 is essential for zebrafish development. Nature Genet. 5 October 2003 (10.1038/ng1253) | | |
Bernsten, E. et al. Dicer is essential for mouse development. Nature Genet. 5 October 2003 (10.1038/ng1251)
FURTHER READING Hannon, G. J. RNA interference. Nature418, 244–251 (2002) | | | |
Houbaviy, H. B. et al. Embryonic stem cell-specific microRNAs. Dev. Cell5, 351–358 (2003) | | |
Adding to the growing evidence for the biological significance of RNA interference (RNAi), two recent reports in Nature Genetics show that Dicer, an enzyme that cleaves longer RNAs to produce microRNAs and small interfering RNAs (siRNAs), has an essential function in development. Ronald Plasterk and colleagues, and Gregory Hannon and colleagues, show that knocking out Dicer in zebrafish and mice results in early embryonic arrest.
Первоначально полагали, что RNAi предназначена для защиты от вирусов и transposition. Однако растет число работ, показывающих, что компоненты RNAi machinery участвуют в важных кдеточных функциях.
Используя in vivo рекомбинационную стратегию Hannon и др. нашли Dicer's первый RNase III каталитический домен для инактивации энзимов у мышей. В самом деле, авт. нашли, что эквивалентная мутантная человека неспособна расщеплять предшественников siRNA в тканевой культуре. Развитие мышей -/- арестовывается на ст. E7.5. Отсутствие экспрессии гена brachyury — маркёра первичной полоски — in эмбрионов указывает на то, что мутантны останавливаются в развитии до того, как будет заложен план тела во время гаструляции.
Компоненты RNAi machinery участвуют в поддержании плюрипотентности в развитиии у растений беспозвоночных. Несмотря на многочисленные попытки авт. не удалось выделить embryonic stem (ES) клетки, то указывает на то, что Dicer м.б. существенным для поддержания стволовых клеток. Они использовали — регулятор поддержания и пролиферации ES клеток — в качестве маркёра, чтобы обнаружить стволовые клетки у мышей. Итак, резкое снижение экспрессии x у этих эмбрионов указывает на то, что они теряют стволовые клетки и подчёркивают, что потенциальной причиной их летальности является истощение стволовых клеток. Является ли действительно прямой мишенью для Dicer1 остаётся ещё определить.
Онтогенетические эффекты Dicer м. обеспечиваться за счёт microRNAs (miRNA) — ранее уже сообщалось о том, что м. существовать специфичные для стволовых клеток микроРНК у мышей. Технические трудности воспрепятствовали авт. определить, действительно ли снижаются уровни miRNA у эмбрионов. Однако это было продемонстрировано Plasterk и др., получившими рыбок данио, нокаутных по dicer1.
Мутантные dicer1 эмбрионы рыбок данио становились вялыми и начавшийся рост останавливался на 8-й день после оплдотворения (dpf), a на 15 dpf все эмбрионы погибали. Эффекты начинали обнаруживаться раньше, если dicer1 подвергалися нокдауну с помощью morpholinos, возможно благодая материнскому вкладу, который в данном случае также подвергался нокдауну. Используя Northern blot анализ, авт. показали, что miRNAs возникают во время первых дней развития и хотя они персистируют у дикого типа и гетерозиготных рыб, они снижаются у гомозиготных мутантов.
Роль Dicer в развитии установлено без всякого сомнения и то, что она осуществляется посредством miRNAs. Задача идентифицировать имеющие к делу отношение виды miRNA и описать функцию каждой из них.
Tang, F. et al. Maternal microRNAs are essential for mouse zygotic development. Genes Dev. 21, 644–648 (2007)
Murchison, E. P. et al. Critical roles for Dicer in the female germline. Genes Dev. 21, 682–693 (2007)
RNase III Dicer энзим, превращающий РНК в small interfering (si)RNAs и micro (mi)RNAs. Предыдущие исследования на нескольких организмах показали участие Dicer в защите от вирусов и транспозонов, в регуляции хроматина, целостности центромер и в контроле генной экспрессии. Новая информация о функции Dicer и miRNAs в развитии мыши получена в двух исследованиях.
В первой работе Hannon and Schultz исследовали потенциальные роли Dicer в зародышевой линии млекопитающих. Присутствие пика экспрессии Dicer в полностью выросших ооцитах в купе с ассоциированным с созреванием снижением указывает на роль Dicer в развитии и созревании ооцитов. Нарушения в локусе Dicer в ооцитах не оказывают влияния на морфологию ооцитов, но самки, лишенные экспрессии Dicer, неспособны продуцировать потомство, т.к. Dicer-/- ооциты арестованы в мейозе I. Этот фенотип ассоциирован со множественными дизорганизованными веретенами и тяжелыми дефектами конгрессии хромосом. Dicer-дефицитные ооциты имеют разные фенотипы веретен, включая множественные веретена, неправильно сопоставленные хромосомы и очевидные монополярные прикрепления к веретену. В второй работе Lao and Surani показали, что Dicer-дейицитные ооциты почти полностью истощены по всем miRNAs.
Dicer is required for meiotic spindle integrity, chromosome congression and oocyte maturation. Metaphase II Dicer+/+ (top) or equivalently matured Dicer-/- (bottom) oocytes were stained with an anti-beta-actin antibody (red); DNA was counterstained with DAPI (green). Image courtesy of E. P. Murchison, Cold Spring Harbor Laboratory, NY, USA.
Ооциты транскрипционно неактивны во время мейотического созревания. Это состояние персистирует в течение оплодотворения вплоть до эмбриональной стадии, когда зиготический геном становится активным - период развития от ооцита до двухклеточной стадии, следовательно, поддерживается исключительно за счет материнских мРНК. Какова же роль Dicer и Dicer-продуцируемых miRNAs в регуляции материнских транскриптов?
Оба исследования включают сравнительный анализ микромассивов из Dicer-дефицитных и контрольных ооцитов, которые обнаруживают разные уровни экспрессии определенных транскриптов, которые, по-видимому, важны для раннего развития. Являются ли изменения, наблюдаемые между двумя разными генетическими фонами прямым или косвенным следствием устранения Dicer ещё предстоит определить. Hannon, Schultz с сотр. затем занялись поиском сайтов мишеней для miRNA среди транскриптов, которые позитивно регулируются в Dicer-дефицитных ооцитах и идентифицировали предполагаемые сайты мишени для miRNA среди наиболее многочисленных семейств позитивно регулируемых транскриптов. Они также показали, что Dicer возможно регулирует большие количества транскриптов в ооцитах посредством последовательностей транспозона, внедренных в их нетранслируемые регионы.
Lao and Surani также изучали профили экспрессии miRNA у зигот и показали, что она подвергается драматическим изменениям; общее количество miRNA негативно регулируется на 60% между одно- и двуклеточной стадией эмбриогенеза и затем увеличивается в 2.2-раза между двухклеточной и 4-клеточной стадией эмбриогенезе. Наиболее многочисленные miRNAs в зиготе относятся к семейству let-7, в то время как miRNAs из miR-290 кластера находятся среди наиболее важных miRNAs, которые позитивно регулируются у эмбрионов 4-клеточной стадии. Выявление профилей miRNA на разных эмбриональных стадиях показало также, что индивидуальные бластомеры на 3-клеточной и 4-клеточной стадии имеют сходные, но не идентичные профили экспрессии miRNA. Как эти miRNAs регулируют материнские транскрипты, предстоит выяснить.
Детальный анализ miRNAs в ооцитах и их эффекты на материнские транскрипты может помочь выяснить их точную роль в раннем развитии мышей.
Maternally Imprinted microRNAs Are Differentially Expressed During Mouse and Human Lung Development A.E.Williams (a.williams@imperial.ac.uk), S.A. Moschos, M.M.Perry, P.J.Barnes, M.A.Lindsay Dev. Dyn. - 2007. - V.236, No 2, P. 572-580
Более 300 miRNAs открыто у человека, хотя функция большинства из них пока неизвестна. С помощью высоко чувствительного полуколичественного метода real-time PCR изучали дифференциальную экспрессию некоторых микроРНК в ходе развития легких. Было установлено, что кластер микроРНК, позитивно регулируемый в легких новорожденных мышей и плодов человека, локализуется на хромосоме человека 14q32.31 (мыши 12F2), который включает miR-154 и miR-335 семейства и располагается внутри Gtl2-Dio3 домена. Напротив некоторые miRNA позитивно регулировались во взрослых по сравнению с легкими новорожденных и плодов, включая miR-26a и miR-29b. Различия в паттернах пространственной экспрессии miR-154, mir-29a и miR-26a продемонстрированы с помощью гибридизации in situ, используя LNA зонды. Интересно, что miR-154 локализуется в строме легких плодов, но не взрослых. В целом профили экспресси были сходными для тканей мышей и людей, что указывает на консервацию экспрессии микроРНК в процессе развития.
Dicer is required for meiotic spindle integrity, chromosome congression and oocyte maturation. Metaphase II Dicer+/+ (top) or equivalently matured Dicer-/- (bottom) oocytes were stained with an anti-beta-actin antibody (red); DNA was counterstained with DAPI (green). Image courtesy of E. P. Murchison, Cold Spring Harbor Laboratory, NY, USA.