Посещений:
MicroRNA Shows Macro Potential
МикроРНК

MicroRNA Shows Macro Potential

The Scientist Volume 17 | Issue 12 | 22 | Jun. 16, 2003


Researchers seek targets and functions of a large new class of small RNAs

References
1. J. Brennecke et al., "Bantam encodes a developmentally regulated microRNA that controls cell proliferation and regulates the proapoptotic gene hid in Drosophila," Cell, 113:25-36, April 4, 2003.

2. P. Xu et al., "The Drosophila microRNA mir-14 suppresses cell death and is required for normal fat metabolism," Curr Biol, 13:790-5, April 29, 2003.

3. J.E. Abrahante et al., "The Caenorhabditis elegans hunchback-like gene lin-57/hbl-1 controls developmental time and is regulated by microRNAs," Dev Cell, 4:625-37, May 2003.

4. S.-Y. Lin et al., "The C. elegans hunchback homolog, hbl-1, controls temporal patterning and is a probable microRNA target," Dev Cell, 4:639-50, May 2003.

5. R.C. Lee et al., "The C. elegans heterochromic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14," Cell, 75:843-54, 1993.

6. B.J. Reinhart et al., "The 21-nucleotide let-7 RNA regulates developmental timing in Caenorhabditis elegans," Nature, 403:901-6, 2000.

Другие Мишени для микроРНК

MicroRNAs linked to cancer

Cancer genomics: Small RNAs with big impacts


Рис.1. MicroRNA production  |  The precursor of an miRNA (pri-miRNA) is transcribed in the nucleus. It forms a stem?loop structure that is processed to form another precursor (pre-miRNA) before being exported to the cytoplasm. Further processing by the Dicer protein creates the mature miRNA, one strand of which is incorporated into the RNA-induced silencing complex (RISC). Base pairing between the miRNA and its target directs RISC to either destroy the mRNA or impede its translation into protein. The initial stem?loop configuration of the primary transcript provides structural clues that have been used to guide searches of genomic sequence for candidate miRNA genes

РНК рассматривается в основном как перевалочный пункт (conduit) между генами и белками. Ее статус был расширен с обнаружением каталитической РНК 20 лет тому назад. Теперь microRNAs, от 20- до 24-нуклеотидов транскрипты, которые лежат в основе эндогенных interference, по-видимому, обладают большим биологическим занчением, чем это предполагалось.
Известно было об участии микроРНК в развитии червей Caenorhabditis elegans и в дифференцировке растений Arabidopsis thaliana. Теперь сообщается, что микроРНК затрагивают также апоптоз, тканевой рост, метаболизм жира и формирование паттерна нервной системы.1-4 Известна локализация сотен генов, кодирующих микроРНК.
В настоящее время РНК прадигма должна включать неожиданные находки более легко, чем раньше. Sidney Altman, биолог из Yale University biologist, который параллельно открыл каталитическую РНК, натолкнувшись на "extreme resistance" что привело его к получению Нобелевской премии по химии в 1989. Victor Ambros, который идентифицировал lin-4 в качестве первого гена, кодирующего микроРНК, и предоставил постер о lin-4 в 1992 на Gordon Conference, получил предложение от редактора Cell 'When it's ready, send it to us.'"
LOLLIPOP-LIKE STRUCTURES Ambros, проф. генетики в Dartmouth Medical School, клонировал lin-4 у C. elegans т.к. ген обнаруживал интригующие свойства будучи мутантным: Он вызывал постоянное повторение первой личиночной стадии. "The gene turned out not to encode a protein," заявляет он. "So we were forced to figure out what the gene product was, and it ended up being a little RNA." Этот отрезок связывался с почти комплементраным мРНК транскриптом и репрессировал его трансляцию в белок.

Ambros' публикация о lin-4 появилась в 1993.5 Спустя 7 лет, генетик Gary Ruvkun из Harvard Medical School, сообщил о let-7 как еще одном гене, кодирующем микроРНК у C. elegans.6 Большинство исследователей рассматривало такие гены как реликты, уникальные для мира молекулярной биологии червей. Но в 2001 в нескольких лабораториях выявленны гены, сходные с let-7 и lin-4 у многих видов животных и растений.

Число предполагаемых генов микроРНК преувеличено. David P. Bartel, асс. проф. биологии из Whitehead Institute for Biomedical Research, подсчитал, что существует 90-120 таких генов у C. elegans и 200-255 у человека. Примерно 40 генов, кодирующих 19 microRNAs было локализовано у Arabidopsis.
Гены микроРНК кодируют первичные транскрипты, содержащие комплементарные участки, которые сворачиваются в lollipop-подобные stem-loop структуры. Энзим Dicer затем расщепляет эти транскрипты на короткие двунитчатые РНК, одна из нитей которой и становится микроРНК. (МикроРНК не нужно путать с short interfering RNAs или siRNAs. Два вида РНК, генерируемых расщеплением с помощью Dicer, м. иметь сходные эффекты, тогда как siRNAs не транскрибируются с дискретных генов.)

ZAPPING PLANT TRANSCRIPTION Предложена неполная модель того, как оперируют микроРНК, "supported by a lot of bits and pieces" доказательств, говорит проф. Gregory J. Hannon из Cold Spring Harbor Laboratory. После транскрипции и процессинга - большинство деталей которого неизвестны - РНК гнездятся в белковых комплексах, известных как RISCs (RNA-induced silencing complexes). RISCs ассоциируют с рибосомами в бесклеточных экстрактах, но м. и не быть in vivo. RISCs в клетках, однако, определенно свзаны с мРНК за счет спаривания оснований между микроРНК и мРНК.

мРНК расщепляется, если участки нуклеотидов в точности или почти в точности комплементарны с последовательностями микроРНК. Места расщепления мРНК известны, но отвечающие за него энзимы неизвестны. Трансляция репрессируется, если два кусочка РНК содержат больше несоответствий. Что происходит во время репрессии "is a real mystery," говорит Hannon. Еще никому не удалось выделить дуплекс микроРНК-мишень с помощью иммунопреципитации или др. методов.

Т.к. растительные мРНК почти комплементарны своим мишеням, то сканирование геномов выявляет около 60 мишеней у Arabidopsis. Многие из этих мишеней "are transcription factors that control some specific developmental events," замечает James C. Carrington, директор Oregon State University's Center for Gene Research and Biotechnology, в Corvallis. "Напр., многие из этих транскрипционных факторов необходимы для поддержания стволовых клеток в виде недифференцирующихся клеток в соотвт. количестве в меристеме растений. Др. гены, известные как мишени, участвуют в контроле радиального паттерна и в контроле того, что детерминирует типы клеток, которые развиваются на кончике листа в противопоожность нижней части листа."
Чтобы объяснить эту степень использования микроРНК, Bartel выдвинул гипотезу, что когда растительные клетки дифференцируются они должны переключаться с одного набора транскрипционных факторов на др. Если это действительно происходит с белками, связывающимися с промоторами, чтобы ингибировать транскрипцию ДНК предыдущего набора транскрипционных факторов, то эти факторы не должны выключаться "until their mRNA is gone," объясняет Bartel. "Идея в том, что микроРНК находят и вызывают деградацию этих messages. И таким образом вы можете переходить от одной программы транскрипционных факторов к др. очень быстро, независимо от постоянно нестабильных messages."
Следующая задача исследователей растений - найти, насколько важны эти мишени и как функционируют in vivo. Carrington видит несколько стратегий: одна из них - инсерция энхансера вблизи гена микроРНК, чтобы усилить его активность; др., по иронии судьбы, - снизить его активность с помощью интерференции с экзогенной РНК. Его Лаб. использует Affymetrix-type microarrays для мониторинга, какая из мРНК расщепляется, когда продукция микроРНК увеличивается или падает.
Некоторые исследователи вызывали мутации в положении третьего кодна предполагаемой мишени для микроРНК. "Now you have a target gene that should be fully functional but is no longer a substrate for cleavage by the microRNA," говорит Carrington. "Then you ask, exactly what happens when you put that back into a plant?" Т.к. мутантные гены доминантны, добавляет он, то м. возникать фенотипические отклонения даже, если др. ген-мишень дикого типа не элиминирован.

FLIES, FLUORESCENCE, AND FAT МикроРНК животных трудны для изучения,т.к. транскрипты животных не полностью комплементарны своим мишеням, поэтому мРНК-мишени трудно выявить с помощью сканирования генома. Кроме того, множественные копии генов микроРНК у некоторых животных делают невозможным knockout подход для выявления функции. Мыши, напр., имеют по крайней мере десятки копий let-7 гена.

Тем не менее, Ambros, Bartel и H. Robert Horvitz, MIT проф. биологии и лауреат Нобелевкой премии 2002, сотрудничают в деле нокаута генов микроРНК у C. elegans. Ruvkun отмечает, что большинство таких нокаутов должно иметь должны иметь едва заметные функциональные изменения "because so few have emerged from traditional genetics up to this point." Др. объяснением неспособности раньше выявлять микроРНК м. служить то, что гены слишком малы, чтобы их м.б. бы легко выявлять с помощью мутагенеза.
До сих пор описано лишь незначительное количество реакций microRNA-mRNA у животных: lin-4 находит lin-14 и lin-28, а let-7 находит lin-41. Однако, теперь появились три др. генных мРНК в качестве мишеней. Один из генов это lin-57 червя (известный также как hbl-1), гомолог гена Drosophila melanogaster hunchback. Две группы исследователей недавно заявили, что 3' untranslated region (UTR) у lin-57/hbl-1 содержит множественные возможные места связывания для let-7 микроРНК.3-4 Разные данные указывают на то, что lin-57/hbl-1 является скорее всего нижестоящей мишенью для let-7 микроРНК, которая затем влияет на развитие и формирование паттерна нервной системы.
Выявлены первые две микроРНК у Drosophila и их мишени. Используя традиционную мутагенную технику, Stephen M. Cohen, из European Molecular Biology Laboratory в Heidelberg, Germany, обнаружили ген bantam в белок-некодирующей области генома мухи. Они нашли, что bantam кодирует микроРНК, которая стимулирует пролиферацию клеток и предупреждает апоптоз.1 Затем использовали неопубликованный компьютерный метод для идентификации гена, индуцирующего апоптоз hid, в качестве мишени, чья трансляция репрессируется микроРНК bantam. Если bantam коэкспрессируется с hid, то уровень белка hid падает, но уровни его мРНК остаются неизменными.

Исследования Cohen's оказались такде пионерскими в использовании in vivo sensor, который Ambros назвал "beautiful approach for detecting where microRNAs are expressed." Сенсор м. вставляться с помощью гибридизации in situ, которая до сих пор успешно использовалась для отслеживания микроРНК, т.к. они слишком коротки, чтобы генерировать достаточный сигнал. Cohen создал трансген, который экспрессирует green fluorescence protein (GFP) и в 3' UTR область гена он поместил две копии target последовательностей вточности комплементарных микроРНК bantam. Где бы не экспрессировали клетки мухи bantam, трансген расщепляется и флюоресценция снижается. Cohen предполагает, что сходный подход поможет установить, что UTR является мишенью для микроРНК. Он помещал область 3' UTR гена позади GFP трансгена и тестировал, как микроРНК влияет на флюоресценцию. "That's dead easy," говорит он. "It just takes time."
Bruce A. Hay, биолог, работающий с мухами в California Institute of Technology, получил мух, которые экспрессируют в избытке Reaper, белок, способствующий апоптозу, такие трансформированные Drosophila's вместо обычных больших красных глаз имели маленькиебледные глаза. Скрестив этих мух с др., чьи геномы содержат случайно вставленные транспозоны. Эти инсерции имеют промотор, который усиливает глаз-специфическую экспрессиию соседних генов. Если потомство имело нормальные глаза, то это указывало на то, что вставленный транспозон включал соседний ген, который супрессировал гибель клеток. 10 мест инсерций давали нормальные глаза, но только 6 из этих мест были вблизи генов, кодирующих белки.
В течение 4-х лет Hay оставался в неведении относительно этих 4-х мест. Он был знаком с работами Ambros' по lin-4, но, как теперь смеется он, "We put them in the file cabinet that said 'interesting but probably not relevant to our work.'" Но интерес возрос, когда он познакомился с исследованиями, выявившими гены микроРНК у многих организмов, Hay убедился, что один из сайтов инсерции транспозона является почти таким геном.2 Когда он делетировал этот ген, mir-14, то мухи становились чувствительными к стрессам, жили недолго и были тучными.
Чтобы идентифицировать сайты, с которыми связывается mir-14 микроРНК, Hay исследовал гены нескольких известных регуляторов апоптоза. Он пришел к выводу, что эта микроРНК регулирует ген caspase Drice, т.к. уровни его белкового продукта менялись, когда манипулировали с экспрессией mir-14. Однако, в отсутствие измерений РНК Hay не смог установить, что мРНК Drice является непосредственной мишенью mir-14 микроРНК.

CONSERVATION, KEY TO COMPUTATION Hay не производил компьютерного сканирования генома, но он и др. исследователи надеются, что эта стратегия позволит определить множество потенциальных мишеней микроРНК, особенно вне известных биологических путей. Еще одна большая проблема м.б. преодолена. Т.к. микроРНК являются короткими и часто не очень комплементарными своим мишеням, то несложное сканирование генома сможет выявить многие потенциальные мишени. Значительное большинство безусловно будет ложно-положительным.

Почему фактор имеет столь cлабую комплементраность? "In a computational study," говорит Bartel, "You can find that a third of the known elegans microRNAs will hybridize to the lin-14 UTR about as well as lin-4 [microRNA] does." Ruvkun, однако, не считает компьютерный анализ чрезвычайно трудным. "It's only 20 bases you have to think about," утверждает он. "It's a lot simpler than anything longer, where [RNA] can really fold up into something complicated."
Ключом к плодотворному сканирующему подходу, как полагают исследователи, является генетическая консервация. Идея в том, что если некоторые микроРНК не используются слишком часто, то их мишени не должны вовлекаться слишком часто и наоборот.
Для Thomas Tuschl, главы Rockefeller University's Laboratory of RNA Molecular Biology, многообещающая стратегия означает старт с выявления "20 or so absolutely conserved microRNAs, which you find in C. elegans, fish, humans, Drosophila"; затем должна будет запущена биоинформационная программа. которая выявит соотв.подходы к этим микроРНК; и, наконец, исследование тысяч или миллионов хитов законсервированных мРНК мишеней (включая 3' UTRs) и законсервированных белков, кодируемых этими или вышестоящими мишенями.
"We've learned the hard way that there are complications in how to detect these [targets]," говорит Chris Sander, глава Memorial Sloan-Kettering Cancer Center's центра компьютерной биологии, который сотрудничает с Tuschl и с Debora Marks из Columbia University. Как физик-теоретик Sander отмечает, что программа сканирования генома сможет объяснить "interesting loop-outs and bulges" в гибридизации микроРНК-мишеней, влияние соседних белков (напр., RISC комплекса), и энергетики РНК-РНК несоответствий. Суперкомпьютер с 90-процессорами лучше всего для подсчетов.
"What we don't understand is basically how a microRNA appears to the target RNA," говорит Tuschl. Однажды он и др. исследователи идентифицировали дальнейшие мишени с помощью сканирования генома, он добавляет, эти результаты д. обучить нас правилам "распознавания микроРНК с помощью РНК-мишеней. Зная это, м. двигаться в направлении предсказания мишеней для менее законсервированных микроРНК."

Expression of microRNA miR-124a in the developing mouse embryo

MicroRNAs (miRNAs) are small (22nt) non-coding RNAs that regulate gene expression by base pairing to target mRNAs. miRNAs are synthesized by RNA polymerase II as longer precursors that are processed by the ribonucleases Drosha and Dicer. Shown is a whole mount in-situ hybridization in which a probe for miR-124a RNA was used to reveal the expression pattern of the precursor in a 11.5 post-conception embryo (E 11.5). Strong staining was observed in the developing spinal cord, dorsal root ganglia, and brain.

"Here you have sort of a unique situation, where all of a sudden, 200 or more new kinds of genes--not just new genes, but new kinds of genes--have been identified, and we don't know anything about how they work," объясняет Cal Tech's Hay. "For graduate students and postdocs, in particular, this is a place where you can really make a difference because everything you learn at this point is new."

Douglas Steinberg (dougste@attglobal.net) is a freelance writer in New York City.

Сайт создан в системе uCoz