Lars Ellgaard, Ari Helenius (ari.helenius@bc.biol.ethz.ch) Nature Reviews Molecular Cell Biology4, No 3, P. 181-191 (2003)
The endoplasmic reticulum (ER) has a quality-control system for 'proof-reading' newly synthesized proteins, so that only native conformers reach their final destinations. Non-native conformers and incompletely assembled oligomers are retained, and, if misfolded persistently, they are degraded. As a large fraction of ER-synthesized proteins fail to fold and mature properly, ER quality control is important for the fidelity of cellular functions. Here, we discuss recent progress in understanding the conformation-specific sorting of proteins at the level of ER retention and export.
(Рис.1.) | The effects of the endoplasmic reticulum environment on folding equilibria.
(Рис.3.) | Trafficking of a cargo glycoprotein from the endoplasmic reticulum through exit sites to the Golgi complex.
Boxes
(Box 1.) | Secretory-pathway organelles that are involved in quality control
Box 2 | The main chaperone families of the endoplasmic reticulum
The endoplasmic reticulum (ER) contains chaperones that belong to several of the classical chaperone families, such as heat shock protein (Hsp)40, Hsp70 and Hsp90, with the two main exceptions being the Hsp104 and Hsp60/Hsp10 proteins. The ER also contains chaperones and folding enzymes that are unique, such as calnexin and calreticulin and the family of thiol-disulphide oxidoreductases.
Hsp70s
The main protein of this family is BiP, which takes part in many aspects of ER quality control (QC). It binds to various nascent and newly synthesized proteins and assists their folding. In addition, it is involved in the processes of ER-associated degradation and the unfolded protein response. The functions of the second Hsp70 family member, glucose-regulated protein (GRP)170, are relatively unexplored.
Hsp40s
Five ER proteins of the Hsp40 family (ERdj1–5) are known. They contain a luminally exposed J-domain and can stimulate BiP ATPase activity in vitro.
Hsp90
The only known Hsp90 family member is GRP94. Despite being abundant in the ER, it is not essential for cell viability and seems to limit its interactions to a small set of substrates.
Peptidyl-prolyl isomerases
Peptidyl-prolyl isomerases (PPIases) from both of the two main PPIase families — the cyclophilins and the FK506-binding proteins — are found in the ER. Catalysis of cis/trans isomerization of peptidyl-prolyl bonds in vivo remains to be shown conclusively for these proteins.
Calnexin and calreticulin
These two lectin chaperones interact with and assist the folding of proteins that carry monoglucosylated N-linked glycans.
Thiol-disulphide oxidoreductases
This large family of enzymes, of which protein disulphide isomerase is the best known, catalyses the oxidation, isomerization and reduction of disulphide bonds.
The salutary intersection of fundamental cell biology with the study of disease is well illustrated by the emerging elucidation of neurodegenerative disorders. Novel mechanisms in cell biology have been uncovered through disease-orientated research; for example, the discovery of presenilin as an intramembrane aspartyl protease that processes many diverse proteins within the lipid bilayer. A common theme has arisen in this field: normally-soluble proteins accumulate, misfold and oligomerize, inducing cytotoxic effects that are particularly devastating in the post-mitotic milieu of the neuron.
Kaganovich, D. et al. Misfolded proteins partition between two distinct quality control compartments. Nature 454, 1088–1095 (2008)
Образование амилоидных включений агрегируемых белков, которые типичны для многих нейродегенеративных заболеваний, хорошо описано. Но какова судьба 'normal' неправильно упакованных цитозольных белков? И почему некоторые неправильно упакованные белки накапливаются в амилоидных включениях, тогда как др. деградируют?
Judith Frydman с коллегами изучали судьбу флюоресцентно меченных чувствительных к температуре мутантного Ubc9 (Ubc9ts), который неправильно сворачивается при температуре выше 30°C. В дрожжевых клетках неправильно упакованный Ubc9ts временно накапливается в околоядерных включениях до тех пор, пока не будет деградирован с помощью ubiquitin-proteasome пути. Нарушение обеспечиваемой протеосомами деградации, однако, заставляет Ubc9ts накапливаться в двух разных включениях: в околоядерных включениях и в крупных околовакулярных включениях.
Др. неправильно упакованный белок, состоящий из отдельных частей von Hippel-Lindau (VHL) опухолевый супрессор накапливается непосредственно в околоядерных включениях в дрожжевых клетках даже в присутствие протеосомного ингибитора. Но путем повышения температуры до 37°C, VHL накапливается в двух разных включениях, как и в случае Ubc9ts. Итак, неправильно упакованные белки секвестрируются в двух самостоятельных включениях; околоядерные включения образуются первыми и превалируют при нормальных условиях, тогда как стрессовые условия ведут к накоплению белка во вторых периферических включениях.
Паттерн секвестрации Ubc9ts и не собранного VHL в клетках млекопитающих сходен с таковым у дрожжей. Аmyloidogenic мутантный белок huntingtin колокализуется с околовакуолярными включениями, но не с околоядерными включениями в клетках дрожжей и млекопитающих. Итак, разные типы неправильно упакованных белков секвестрируются по-разному в два самостоятельные, эволюционно законсервированные quality-control компартменты.
Используя анализ fluorescence loss in photobleaching (FLIP), авт. исследовали свойства диффузии флюоресцентно меченных неправильно упакованных белков во включения. Быстрая потеря флюоресценции соответствовала Ubc9ts в околоядерных включениях, это указывает на то, что неправильно упакованные белки с этом 'juxtanuclear quality control' compartment (или JUNQ) растворимы и могут обмениваться с цитозольным пулом. Напротив, околовакуолярный компартмент сохраняет большую часть своего флюоресцентного сигнала, это указывает на то, что он содержит в основном не-диффундирующие, нерастворимые Ubc9ts (поэтому и название 'insoluble protein deposit' или IPOD).
Протеосомы концентрируются вблизи JUNQ, но не IPOD, это указывает на то, что деградация неправильно упакованных белков происходит JUNQ. Хаперон Hsp104 колокализуется с JUNQ и IPOD; Hsp104, по-видимому, необходим для переупаковки в JUNQ, тогда как он может фрагментировать белковые агрегаты в IPOD.
Как же неправильно упакованные белки сортируются в JUNQ или IPOD? Нарушение убиквитинирования неправильно упакованных белков Ubc9ts и VHL блокирует их накопление в JUNQ и вместо этого происходит их накопление в IPOD, даже при 30°C и в отсутствие ингибирования протеосом. Блокирование их убиквитинирования ассоциирует с редуцированной растворимостью; следовательно, статус убиквитинирования или растворимости может предопределять в какой компартмент эти белки будут направлены. Напротив, полиубиквитинирование прионового белка Rnq1 способствует его распределению в JUNQ. в
Путем сортировки Ubc9ts или в JUNQ или IPOD путем изменения его состояния убиквитинирования, а затем возвращения к пермиссивной температуре, авт. показали, что полиубиквитинированные Ubc9ts в JUNQ могут быть упакованы заново с помощью Hsp104, тогда как не-убиквитинированные Ubc9ts в IPOD окончательно агрегируют. Итак, накопление неправильно упакованных белков вместе с протеосомами и хаперонами JUNQ может облегчить как деградацию. так и повторную упаковку, тогда как секвестрация окончательно агрегированных белков в IPOD может облегчить их очистку, напр., с помощью аутофагического пути.
В клетках существует своего рода контроль качества (quality control (QC)) для практически каждой ступени, ведущей к синтезу ДНК, РНК и белковых молекул. Как результат количество накапливаемых ошибок в макромелекулах, которые обязательно возникают, чрезвычайно мало.
Для белков 'proof-reading' происходит на уровне транскрипции, трансляции, складывания и сборки ансамбля. Чтобы перейти к финальным КПП (QC checkpoints), белок д. обычно приобрести правильно упакованную конформацию. Это обычно т.наз 'native' конформация, которая соответствует энергетически наиболее благоприятному состоянию. В случае белков с несколькими субъединицами обычно необходим собственно олигомерный ансамбль.
Если процесс упаковки и созревания не происходит, то белковая молекула не транспортируется к своему финальому месту предназначения в клетке и в конечном счете деградирует. Чтобы отличать нативную от не-нативной конформации белка клетка использует различные сенсорные молекулы. По определению, сенсоры включают молекулярные хапероны (chaperones), т.к. они взаимодействуют специфически с неполностью упакованными белками. Молекулярные chaperones часто выполняют двойную роль, ассистируя процессу складывания и отправляя любой неправильно упакованный белок на деструкцию. Система, определяющая конформацию, включает также энзимы, которые селективно и ковалентно метят ('tag') неправильно сложенные белки, которые распознаются упаковывающей и деградирующей кухней (machinery). Наиболее известными метками являются ubiquitin, малый белок, который прикрепляется к боковыым цепочкам лизина в качестве сигнала на деградацию и глюкоза, которая добавляется к N-сцепленным гликанам гликопротеинов в качестве сигнала на возврат в endoplasmic reticulum (ER).
Обсуждается процесс QC, который действует на вновь синтезированные белки в ER клеток эукариот. Строгое различие между белками, которые могут или не могут транспортироваться вдоль секреторного пути, гарантирует точность и функциональность белков, которые экспрессируются во внеклеточном пространстве, плазматической мембране и в компартментах, которые связаны с секрецией и эндоцитозом. ER QC регулирует также деградацию этих белков, сложенных неправильно. Разложение осуществляется с помощью ER-associated degradation (ERAD); неправильно упакованные белки обратно транслоуируются из ER в цитозоль, где они убиквитилируются и затем деградируются протеосомами.
Protein folding and quality control in the ER
ER создает условия, которые оптимизированы для упаковки и созревания белков. Подобно просвету др. органелл секреторного пути (Box 1), просвет ER является внецитозольным (extracytosolic), а , следовательно, топологически эквивалентен внеклеточному пространству. Следовательно, среда ER отличается от цитозоля в отношении ионов, redox условий и набора молекулярных chaperones. В ER происходят некоторые ко-трансляционные и пост-трансляционные модификации, которые не возможны в цитозоле,такие как образование дисульфидных мостиков, отщепление сигнального пептида, N-сцепленное гликозилирование и добавление glycophosphatidylinositol (GPI)-якорей. Эти ковалентные изменеия важны для правильного складывания белка. Правила складывания в ER отличны от тех, что используются в цитозоле. Обычно белки, которые проходят упаковку в ER, не м. б. сложены правильно, если направляются в цитозоль и наоборот.
В клетках млекопитающих, белки транслоцируются в ER ко-трансляционно и складываени обычно протекает в три фазы. Во-первых, cotranslational и cotranslocational складывание белка происходит в контексте translocon комплекса — белкового канала, через который образующаяся цепочка вступает в просвет ER или мембрану ER. Во-вторых, пост-трансляционное складывание происходит после того как законченная цепь освобождается из рибосом и translocon комплекса. Наконец, происходит сборка олигомера. Это обычно происходит, когда субъединицы приобретают конформацию, которая близка к финальному состоянию упаковки. Chaperones и folding энзимы (Box 2) находятся в просвете ER в высоких концентрациях и они участвуют во всех трех стадиях упаковки.
Присутствие строгой QC системы в ER существенно по нескольким причинам. Из-за предупреждения преждевременного выхода промежуточно упакованных продуктов и неполностью собранных белковых ансамблей из ER, она распространяется на поставку субстратов в упаковывающую machinery в просвете ER и тем самым увеличивает шансы правильного созревания; ниже располженные органеллы в секреторном пути обычно не обеспечивают упаковку белка. Более того, ER QC гарантирует, что белки не будут доставлены в терминальные компартменты, если они все еще неполностью упакованы, а , следовательно, потенциально вредны для клетки. Напр., важно, что нефункциональные или частично функциональные ионные каналы, транспортеры и рецепторы не достигали плазматической мембраны, где их присутствие м.б. токсичным. Наконец, клетки используют ER QC, чтобы регулировать транспортацию и активацию специфических белков пост-трансляционно. Эти белки участвуют в процессах, таких как регуляция генов и хранение питательных веществ, а некоторые обладают функциями внеклеточных переносчиков лигандов, которые были загружены в ER прежде чем белки стали пригодными к секреции.
Primary quality control
Система, которая регулирует транспорт белков из ER в аппарат Golgi сложна и изощренна. Она работает на генеральном уровне ('primary QC'), который приложим ко всем белкам независимо от их происхождения и индивидуальных характеристик и на специфическом уровне, который зарезервирован для избранных категорий белков ('secondary QC').
Первичный QC базируется на общих структурных и биофизических свойствах, по которым отличаются нативные от не-нативных белковых конформаций. Это способ, с помощью которого многие грузовые белки приобретают функциональную способность, поскольку они в ER, при этом транспортная компетентность не зависит от функции белка. Важным свойством для распознавания служит экспозиция гидрофобных областей, непарных цистеиновых остатков и тенденция агрегировать.
Молекулярные chaperones и folding сенсоры, которые используются первичным многочислены в ER. Это , , , glucose-regulated protein (GRP)94 и thiol-disulphide oxidoreductases protein disulphide isomerase (), и (Box 2). Часто даже минорные отклонения от нативной конформации из-за неполной упакованности или неправильной упаковки, ведут к связыванию белка одним или несколькими из этих факторов, а , следовательно, к оставлению в ER. Имеются различные серьезные заболевания, которые возникают в результате того, что эндогеннные белки содержат мутации и дефекты, нарушающие упаковку и ведущие к накоплению белка в ER. Т.к. нет специфических сигналов или мотивов аминокислотных последовательностей, необходимых для первичного QC, то он касается не только эндогенных белков дикого типа, но и химерных и рекомбинантно экспрессируемых гетерологичных белков.
A correlation with protein stability.
Первичный QC является системой, базирующейся на удержании, при которой неполностью сложенные конформеры и несобранные в ансамбли олигомеры распознаются и избирательно задерживаются. Упакованные конформеры не выявляются и свободно покидают ретикулем.
При измерении эффективности секреции серии folding-мутантов bovine pancreatic trypsin inhibitor (BPTI) у Saccharomyces cerevisiae,было установлено, что имеется честкая корреляция с in vitro измеренной термальной стабильностью мутантных белков (повышенная термальная стабильность связана с повышенной эффективностью секреции). Эта корреляция наблюдается даже когда температуры плавления для всех мутантов были выше температуры, используемой для экспрессии белка. Следовательно, важным параметром, который определяет эффективность секреции, является упакованного белка, которая отражает свободную энергию упаковки (folding).
В целом это наблюдение было подтверждено на нескольких системах. Внесение точковых мутаций в цепочки инсулина или T-клеточных рецепторов, которые, как полагают. делают эти белки более стабильными, чем соотв. белки дикого типа, действительно приводило к более высоким уровням секреции. Когда производился скрининг мутаций BPTI и те, что обладали повышенной эффективностью секреции, отбирались, то все эти мутации обнаруживали повышенную термальную стабильность по сравнению с белками дикого типа. Эти наблюдения подтверждают, чем ниже барьер free-energy между нативными и не-нативными структурами, тем большая фракция белка остается в ER и деградирует.
Эти данные указывают на то, что QC в ER м. зависеть от динамических и кинетических свойств, которые являются структурными флюктуациями, а не усредненными по времени структурами. Даже если полностью уложенные дикого типа и мутантные белки м. временно расправляться и подвергаться связыванию хаперонами, то будут возникать неправильно уложенные конформации, когда они в ER. Чем ниже общая стаильность белка, тем чаще это будет происходить. Чем длиннее период времени, в течение которого белок находится в не-нативной конформации, тем ниже его шансы покинуть ER.
Эта идея суммирована на Рис. 1. Представлены конформации белков неполностью уложенных (I), неполностью уложенных, связанных с хаперонами (I–C) и нативных (N). Итак, за небольшими исключениями выход из ER в комплекс Golgi является, в данной модели, ограниченным белками, которые достигли нативной конформации, тогда как неправильно уложенные формы обратно транслоцируются и деградируют в цитозоле. Чем выше стабильность нативной формы белков, тем эффективнее этот экспорт и тем меньшая фракция деградирует.
Произвожным этой модели является идея, что хотя условия ER и способствуют и поддерживают укладку белков, они м. также вызывать и их расправление (unfolding). Эта возможность проиллюстрирована в экспериментах с упаковкой у tsO45 мутантов vesicular stomatitis virus (VSV) G-белка: VSV G-белок частично расправляется при возрастании темпаратуры, но только если он находится в ER. Более того, расправляющая сила ER используется по отношению к холерному токсину, чтобы увеличить его отправку в цитозоль с помощью ретро-транслокации. В дополнение, по крайней мере частичное расправление хаперонами, по-видимому, необходимо перед ретро-транслокацией неправильно уложенных белков из ER в цитозоль по translocon каналу для деградации.
Molecular properties that determine ER retention.
Молекулярные сигналы, которые управляют folding-сенсорами не-нативных конформеров, остаются в основном неизвестными. Однако, некоторая информация, правда неполная, получена для BiP и для calnexin/calreticulin системы.
In vitro, BiP связывает гептапептиды, которые имеют алифатические аминокислотные боковые цепочки в альтернативных положениях. Хотя такие детерминанты из последовательностей и присутствуют в большинства белков, только ограниченный набор действительно используется BiP в качестве сайтов связывания во время упаковки белка. Частично причиной м.б. то, что многие сегменты быстро прячутся при складывании белка. Это м.б. также связано с тем, что хотя и экспозируются последовательности, но стерически они недоступны в BiP для сайтов связывания пептидов. Тем же путем, что и эффективность протеолитического расщепления экспозируемых сайтов на поверхности нативных и частично уложенных белков, обнаруживающая корреляцию с гибкостью полипептидных сегментов, со связью гидрофобных пептидных последовательностей с хаперонами, которая м. зависеть не только от экспозиции, но и от динамических свойств последовательностей в мишени.
The 'stamp of disapproval'.
Примером особенно хорошо охарактеризованной первичной QC системы является т. наз. calnexin/calreticulin цикл (Рис. 2). Эта система ответственна за упаковку гликопротеинов, она удерживает не-нативные гликопротеины в ER до тех пор, пока они не будут уложены правильно, в некоторых случаях неправильно уложенные гликопротеины направляются на деградацию.
Calnexin и calreticulin являются гомологичными белками, которые располагаются в ER и оба являются , которые взаимодействуют с monoglucosylated, уложенными (trimmed) промежуточными образованиями N-сцепленных стержневых гликанов на вновь синтезированных гликопротеинах. Calnexin является трансмембранным белком, а calreticulin является растворенным в просвете белком. Их взаимодействие с гликанами происходит через сайты связывания в их глобулярных лектиновых доменах, которые структурно родственны лектинам бобов. Специфичность calnexin и calreticulin в отношении связывания monoglucosylated гликана (Glc1Man7-9GlcNAc2) (где Glc глюкоза, Man манноза, а GlcNAc - N-acetylglucosamine) ведет к временной ассоциации одного или обоих из этих хаперонов почти со всеми гликопротеинами, которые синтезируются в ER. Происходят ли дальнейшие контакты помимо гликана между субстратами-гликопротеинами и лектинами-хаперонами неизвестно.
И calnexin и calreticulin формируют комплексы ERp57 — a thiol-disulphide oxidoreductase, которые как известно, формируют временные дисульфидные мостики с calnexin- и calreticulin-связанными гликопротеинами. NMR и биохимические исследования показали, что ERp57 соединяются с кончиком плече-подобного домена, который отстоит ~110 и ~140 A от лектиновых доменов calreticulin и calnexin, соотв. Защищенное пространство образуется для связанного субстрата между ERp57, плече-подобным доменом и лектиновым доменом (Рис.2). Др. ER chaperones и folding энзимы, такие как BiP и PDI, также часто вовлекаются в упаковывание гликопротеинов.
Два функционально независимых ER энзима обеспечивают цикл включения и выключения в этой хапероновой системе (Рис. 2). Glucosidase II отвечает за диссоциацию субстрата-гликопротеина от calnexin или calreticulin , за счет гидролиза глюкозы от monoglucosylated стержневого гликана. (GT), с др. стороны, отвечает за повторное glucosylating субстрата, так что он м. повторно ассоциировать с calnexin или calreticulin. Хорошо известно, что re-glucosylation с помощью GT происходит только тогда, когда гликопротеин уложен неполностью. Т.обр., GT действует как сенсор упакованности (folding). Белок м. покинуть этот цикл только тогда, когда GT окажется неспособным его re-glucosylate. Глюкоза действует как селективная метка неполностью упакованного белка — это своего рода 'stamp of disapproval', который сообщает системе, что белок еще не готов к эксплуатации.
Циклы glucosylation и de-glucosylation продолжаются до тех пор, пока глюкопротеин не достигнет своей нативной конформации или не будет отправлен на деградацию. Для деградации гликопротеинов отстригается (trimming) одиночная манноза с помощью ER α1,2-mannosidase I в средней ветеочке олигосахарида, это ведет к ассоциации с ER degradation-enhancing 1,2-mannosidase-like белком (EDEM) — вновь открытым лектином. Это взаимодействие, по-видимому, выводит гликопротеин из calnexin/calreticulin цикла и способствует его деградации. Установлено, что Fbx2 из SCFFbx2 ubiquitin ligase комплекса функционирует как специфически для белков, которые несут N-сцепленные high-mannose олигосахариды, это создает дополнительную связь между процессами ER QC и ERAD гликопротеинов.
In vitro исследования показали, что система преимущественно re-glucosylates гликопротеины в частично уложенной, расплавленной глобуло-подобной конформации и что важным признаком для распознавания является экспозирование гидрофобных аминокислотных кластеров. Она игнорирует гликопротеины в нативной и случайно скрученной конформации, а также укороченные гликопептиды и изолированные гликаны. GT способна распознавать ограниченные, четко локализованные дефекты укладки, и делая это, она re-glucosylates лишь те цепи гликанов, которые присутствуют в неправильно уложенных областях. Этот способ, который фокусирует энзим специфически на областях субстратов-глипопротеинов, которые частично уложены неправильно и содержат гликаны, и подчеркивает тот факт, что GT является изощренным и чувствительным детектором неправильной укладки в просвете ER и в ER сайтах-выхода. Помещение N-сцепленных гликанов в последовательность гликопротеинов м.б. использована для для привлечения непосредственного внимания QC системы к определенным областям уложенного белка. Напротив, N-сцепленные гликаны д. отстуствовать в др. областях, которые нуждаются в повышенной подвижности.
Chemical and pharmacological chaperones.
Принимая во внимание систему, в которой удержание базируется на конформационных критериях и различиях в стабильности нативной и не-нативной конформаций, д.б. возможно улучшение созревания и секреции за стет стабилизации белка в раннем секреторном пути. Этот подход д. в принципе вымостить дорогу для терапевтических вмешательств в болезни ER-накопления, в которых белки с нарушенной укладкой не способны секретироваться.
В самом деле, некоторые исследования, используя клетки тканевой культуры, показали, чтотакой эффект м.б. получен, напр., при снижении температуры или при использовании малых проникающих в клетку молекул, таких как glycerol, dimethylsulphoxide и trimethylamine N-oxide. Эти 'chemical chaperones' действуют неспецифически, способствующий укладке их эффект проявляется в стабилизации нативных или подобных нативным конформерам или в снижении агрегации. Хорошо известен случай, связанный в первую очередь с вызывающим болезнь аллелем cystic fibrosis transmembrane conductance regulator () — folding-дефектным мутантом. В этом случае, использование разных химических хаперонов ведет к повышенной экспрессии на клеточной поверхности структурно дестабилизированного, но функционального белка.
Сходные, но более специфические эффекты м.б. получены с 'pharmacological chaperones'. Этот термин обозначает лиганды, которые которые направляют специфические белки. На G-protein-coupled receptors (таких как мутантные &delta opioid receptor и V2 vasopressin receptor), tyrosinase, P-glycoprotein мутанты и антитела. которые несут мутации в тяжелой цепи области, детерминирующей комплементарность, был продемонстрирован потенциал этих молекул. Специфичность подхода продемонстрирована с помощью корреляции между лиганд-связывающим сродством и лиганд-обеспечиваеющим восстановлением (rescue). Благоприятные эффекты фармакологических хаперонов возможно возникают из структурной стабилизации сходных с нативными конформеров, которые способны взаимодействовать с лигандами. Следовательно, они м. помочь сдвинуть равновесие с неполностью уложенных(I) форм белка к нативной (N) форме (Рис. 1), этого достаточно для повышения секретоной эффективности.
Фармакологические хапероны воспроизводят эффект, который определенные физиологические лиганды оказывают на секрецию белка. Напр., retinol binding protein (RBP) задерживается в ER в несвязанной лигандом форме. Только связанный с ретинолом RBP экспортируется. Т.к. связывание ретинола вызывает лишь незанчительные конформационые изменения в RBP, то этот эффект скорее всего м.б. объяснен лигандом-индуцированной стабилизацией струтктуры RBP.
Secondary quality control
Чтобы секретироваться многие бели д. удовлетворять определенным критериям помимо тех, что наклаыдваются первичной QC системой. термин вторичный QC означает различные збирательные механизмы, которые регулируют экспорт индивидуальных видов белков или семейств белков. Каждый из факторов импеет свой собственный механизм распознавания и многие из этих факторов взаимодействуют с уложенными белками-грузами или со складываемыми промежуточными образованиями. Среди разноцветной смеси вторичных QC белков были классифицированы те белки, которые необходимы для складывания и сборки специфических белков типа 'outfitters', те, что необходимы для сопровождения белков из ER в качестве 'экскорта' и те, что необходимы для обеспечения передачи сигналов для внутриклеточноко транспорта в качестве 'проводников'. Группа поставщиков (outfitters) включает и специализированные хапероны и энзимы, такие как Nina A — peptidyl-prolyl cis/trans isomerase, которая гарантирует транспортную competence специфических родопсинов у Drosophila melanogaster. Хорошо известным экскортным белком является receptor-associated protein (RAP), который соединяется с членами семейства low density lipoprotein-receptor (LDLR) в ER и экскортирует их в комплекс Golgi, чтобы защитить их от преждевременного связывания лиганда на раннем этапе секреторного пути. Среди проводников, лектин, который известен как ER–Golgi intermediate compartment (ERGIC)-53, циркулирует между ER и комплексом Golgi и, по-видмимому, действует как транспортный рецептор для определенных белков, которые несут high-mannose N-сцепленные гликаны.
Вторичные QC процессы часто специфичны для определенных типов клеток. Кроме того, они часто вовлекаются в регуляцию ER удержания и экспорта. Напр., уровень клеточного холестерола контролируется с помощью регулируемого ER экспорта sterol regulatory element binding protein (SREBP) посредством его cholesterol-зависимого взаимодействия с экскортным фактором SCAP (SREBP cleavage-activating protein). В этом случае, связывание холестерола с помощью SCAP вызывает конформационное изменение в молекуле, которое ведет к задержке в ER SCAP–SREBP комплекса. Эта задержка облегчается за счет взаимодействия sterol-sensing домена SCAP с любым из двух гомологичных трансмембранных ER белков (insig-1 и insig-2). Механизм ER-удержания четвертичного SCAP–SREBP–insig комплекса неизвестен.
Protein sorting and ER quality control
ER-retention signals.
ER постоянно подпитывает груз-содержащими пузырьками секреторные пути и получает ретроградно взамен мембраны из комплекса Гольджи (Box 1). Когорта уложенных, собранных в ансамбли, нативных секртеоных и мембранных белков, а также мембранных липидов, постоянно экспортируется из ER. Большинство резидентных ER белков, включая хапероны folding энзимы, содержит ER-удерживающие и -возвращающие сигналы. Из этих сигналов, хорошо охарактеризованы tetrapeptide KDEL последовательности (где K - lysine, D - aspartate, E - glutamate и L - leucine) присутствующие на С-конце многих растворимых ER белков. Этот мотив взаимодействует с KDEL рецептором и тем самым гарантирует, что белок будет возвращен из комплекса Golgi с помощью coatomer protein (COP)I-покрытых пузырьков (Box1).Сходные с KDEL последовательностями, KKXX или KXKXX сигналы (где X любая аминокислота), которые присутствуют на С-конце и как известно обеспечивают возвращение за счет прямого взаимодействия с COPI оболочкой. Кроме того, экспозиция цистеиновых остатков также м. функционировать как сигнал для возвращения в просвет ER.
Задерживающие и возвращающие сигналы, которые присутствуют в белках, предназначенных для экспорта также важны в QC, т.к. они помогают удерживать белки в ER до тех пор пока правильная укладка или ансамбль не будут достигнуты. Наиболее охарактеизованным из этих сигналов является RKR мотив (где R - arginine), который впервые выявлен в субъединице ATФ-чувствительных калиевых каналов. В большинствве случаев, этот сигнал помогает удерживать индивидуальные субъединицы и неполные олигомеры в ER до тех пор, пока они не будт собраны в правильный ансамбль.
Др. интригующий пример транспортной регуляции касается роли в обеспечении ER экспорта белков, которые содержат dibasic COPI-взаимодействующий удерживающие сигналы. Связывание 14-3-3 с мотивами из коротких последовательностей — которые содержат фосфорилированный остаток серина и присутствуют, напр., в разных калиевых каналах и в — как было показано, исключает одновременное связывание с COPI-белком β-COP и ведет в результате к экспорту из ER. Итак, взаимо исключающее связывание 14-3-3 и β-COP? по-видимому, лежит в основе этой зависимой от фосфорилирования регуляции ER экспорта и удержания.
В случае ATF6 (activating transcription factor 6), транспорт из ER регулируется с помощью ER стрессов. В стрессовых условиях, которые ведут к накоплению неправильно упакованных белков в ER, транскрипционный фактор ATF6 транспортируется в комплекс Golgi, где внутримембранный протеолиз высвобождает транскрипционного фактора домен, который экспозируется в цитозоль. Transcription-factor домен затем переносится в ядро, в котором он активирует транскрипцию ER-chaperone-gene. Экспорт из ER ATF6 контролируется с помощью BiP. Используя механизм, который, по-видимому, участвует в маскировке сигналов для транспорта в Golgi, связываение BiP удерживает ATF6 в ER вплоть до нормализации клеточных условий. Накопление неправильо уложенных белков в ER, очевидно будет приводить к тому, что такие конформеры будул конкурировать за связывание BiP. это будет приводить к высвобождению BiP от просветного домена ATF6 и в результате белок.e, the protein becomes transport competent.
ER exit sites.
Выход белков из ER происходит в т.наз. переходных элементах или ER выходных сайтах (Рис. 3). Они образуют почки или небольшие мембранные кластеры, которые являются продолжением ER мембраны и покрыты COPII оболочкой. Важно, что неполностью уложенные белки-грузы и ER chaperones исключены из выходных сайтов. Если tsO45 VSV G-белок оказываетс неправильно упакованным в результате температурного сдвига, когда находится в выходном сайте, то он re-glucosylated с помощью GT и вместо транспортировки в комплекс Гольджи возвращается в ER. Следовательно, выходные сацты функционируют как внутренняя часть ER QC системы.
Причинами, по которым неправильно уложенные белки не включаются в экспортные пузырьки, м.б.: что они удерживаются в результате взаимодействий с молекулами где-либо в ER; что они каким-то образом предупреждаются от вступления в сайты выхода за счет ограничений, накладываемых самими выходными сайтами; или что 'cargo receptors', которые присутствуют в выходных сайтах неспособны их узнавать. В модели 'bulk flow' избирательность базируется на удерживающих взаимодействиях, а в модели 'cargo capture' груз избирательно распознается в выходных сайтах с помощью рецепторов, которые, как полагают, являются трансмембранными белками, которые ассоциируют непосредственно или опосредованно с COPII оболочкой. Хотя доказательства имеются в пользу обеих моделей, ни одна из них не объясняет адекватно весь спектр феномена сортировки ER-to-Golgi переносимых белков.
Protein mobility in the ER.
Некоторые неправильно уложенные белки неспособны транспортироваться в комплекс Golgi,т.к. они агрегируют в ER. Помимо не-нативных белков, такие агрегаты обычно содержат молекулярные хапероны и thiol-disulphide oxidoreductases, и они часто стабилизированы за счет non-native, межцепочечных дисульфидных мостиков. Агрегация белков в ER чаще всего необратима и во многих случаях связана напосредственно с болезненными состояниями. Однако, было показано, что агрегаты генетических созданных вариантов FKBP12 белка (FK506 binding protein), которые рекомбинантно экспрессированы в ER, м.б. разъединены при добавлении малого синтетического лиганда. Когда слитые белки — из FKBP12 сцепленного с терапевтически важными гормонами (такими как инсулин) через сайт расщепления для furin (который является Golgi-resident протеазой) — экспрессировали в клетках тканевой культуры или у мышей, то достигалась лигандом-индуцированная секреция гормоана. Этот подход показывает, что модулирование процесса, который участвет в сортировке белков и ER QC, м. в принципе вести к развитию новых терапевтических стратегий.
Абсолютные размеры м.б. достаточны для объяснения, почему агрегаты в ER не м. экспортироваться. Однако верхний лимит размеров для частиц, которые м. экпортироваться довольно высок; напр., вирусы и вирус-подобные частицы, которые 50 nm в диаметре м. проникать в ER, и проколлагеновые волокна длиной в 300 nm м. транспортироваться в комплекс гольджи. Несмотря на это, возможно, что некоторые агрегаты формируемые неправильно уложенными белками превосходят эти лимиты.
Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) анализ green fluoresent protein (GFP)-меченных грузов-молекул показал, что определенные агрегаты не-нативных белков эффективно иммобилизуются в грубом ER. Итак, др. причиной, почему агрегаты неправильно упакованных белков неспособны транспортироваться в Golgi, является, по-видимому, отсутствие мобильности в ER. Они м.б. неспособными двигаться в ER выходные сайты.
Предполагается, что молекулярные хапероны и другие резидентные бклки, присутствующие в просвете ER в высоких концентрациях, формируют viscous, взаимосвязанную белковую сеть, которая м. ограничивать подвижность, не только больших агрегатов, но также и малых комплексов. которые содержат неполностью уложенные белки. Однако, FRAP анализ показал, что некоторые неспособные к транспорту белки-грузы остаются мобильными в ER. Это - GFP-labelled tsO45 VSV G-белок, CFTR Δ508 мутант, мутантный aquaporin 2 и тяжелая цепь несобранного major histocompatibility complex (MHC) class I молекул. Если сравниваь с уложенными формами тех же самых белков, то мало отличий обнаруживается в латеральной мобильности. Подсчитанные константы диффузии указывают на то, что белки, удерживаемые в ER, находятся в форме мономеров или в малых-средних размеров агрегатах. Итак, хотя агрегация м. б. фактором, который способствует недопущению некоторые неправильно уложенных белков в выходные сайты, данные FRAP указывают тем не менее, что многие неправльно упакованные белкимобильны в ER.
Quality control in the Golgi complex.
Аппарат Гольджи также м. участовать в контроле качества. В некоторых случаях, происходит возвращение неправильно уложенных белков из Гольджи в ER. Для несобранных в ансамбль T-cell antigen рецепторных α-цепей этот путь возвращения использует COPI-покрытые пузырьки и зависит от BiP и KDEL-рецепторов. Сходным образом, когда неправильно уложенный tsO45 вариант VSV G-белка избыточно экспрессируется в Chinese hamster ovary (CHO) клетках, то белок участвует в цикле между ER и cis-Golgi в комплексе с BiP. Однако, KDEL-рецепторы обладают способностью возвращать KDEL-содержащие белки и комплексы не только из cis-Golgi, но и из всего комплекса Golgi. Путь возвращения из комплекса Гольджи, по-видимому, представляет собой систему возврата, когда способность удерживать в ER белок использована полностью. В др. случаях, рециклинг неправильно упакованных белков м.б. необходим для ERAD. Комплекс Гольджи в клетках млекопитающзих, по-видимому, лишен резидентных хаперонов и folding энзимов,но локализация calreticulin, GT и glucosidase II в ERGIC м. указывать на наличие потенциала по укладыванию гликопротеинов в этом компартменте.
В частности у S. cerevisiae, комплекс Golgi, по-видимому, важное место для QC. Vps10 — Golgi белок, который отвечает за сортировку вакуолярных гидролаз — используется как folding сенсор для вакуолярного транспорта неправильно уложенных белков. Многократно пронизывающий мембрану белок Golgi — Tul1, который является ubiquitin ligase — был идентифицирован как энзим, который распознает полярные остатки в трансмембранной области мембранных cargo белков. Возможно, что Tul1 единственный из мембранных белков, который если не складывается правильно в трансмембранной области или не полностью олигомеризован направляется в вакуоль.
The efficiency of protein maturation
Хотя некоторые белки складываются довоьно эффективно, большинство же складывается неэффективно. Возможным объяснением низкой скорости созревания белков м.б. то, что во время эволюции белки оптимизировались функционально, но необязательно по упаковке и сборке ансамблей. Поэтому последние склонны к ошибкам. Часто полипептиды приобретают не-нативную конформацию, из которой они не м. выйти в разумное время даже в присутствии хаперонов. Для определенных ER белков, таких как иe δ opioid receptor, 40% или более вновь синтезированных белковых молекул дикого типа неспособны созревать и деградируют. Хотя физиологические температуры м.б оптимальными для функции белка, они м.б. слишком высокими для эффективного укладывания. Поэтому увеличение эффективности складывания часто обнаруживается при росте в пониженных температурах.
У гетеро-олигомерных белков часто наблюдается низкая скорость созревания. Орфановые субъединицы и частично собранные олигомеры удерживаются в ER и в конечном счете деградируют. Напр., это наблюдается в культивируемых мышечных клетках, в которых лишь ~30% acetylcholine receptor α-субъединиц инкорпорируются в нативные гетеро-пентамерные рецепторные молекулы. Однако, non-stoichiometric продукция белковых субъединиц также м. иметь разные причины. В случае сборки иммуноглобулинов в клетках плазмы легкие цепи экспрессируются в избытке по сравнению с тяжелыми цепями, чтобы гарантировать высокие скорости включения тяжелых цепей с олигомерный комплекс, т.к. тяжелые цепи склонны к агрегации потенциально токсичны в свободной форме. Сходным образом, уровень экспрессии белка часто превосходит уроень имеющихся специфических лигандов, что существенно для секреции. Это имеет место для молекул MHC class I — только часть из тех, что загружены, с высоким сродством пептидов транспортруется на клеточную поверхность — и для RBP, который нуждается в ассоциации с ретинолом.
Установлено, что 30–75% белков, которые синтезируются, деградируют в течение 20 мин. и что некоторые из белков, которые деградируют, еще продолжают синтез. Считается, что кажущаяяся расточительность в действительности выполняет важную функцию, т.к. идущая деградация вновь синтезированных и синтезируемых белков создает непрерывную поставку пептидов, которые будучи представлены на клеточную поверхность связываются молекулами MHC class I. Известно, что большинство пептидов, которые предтавляются таким способом, происходят, фактически, из белков, которые только что были синтезированы. Следовательно, когда клетка инфицируется вирусом и начинается продукция вирусного белка, то эта инфекция м.б. быстро определена Т-клетками.
Хотя образование неправильно упакованных белков м. иметь практическое значение для иммунной защиты, тем не менее в основе различных болезней, при которых накапливаются агрегровнные белки в клетках и тканях, лежит не-нативная конформация. Напр., образование амилоидных бляшек безусловно связано с нарушениями QC и/или системы деградации белка. Очевидно, что эти конформации еще не м. б. распознаны как неправильная укладка или свофримровавшись они не м.б. деградированы.
Conclusions and perspectives
The ER is unique among cellular compartments in the sense that most newly synthesized proteins are exported from the ER and find their final location in places that are devoid of chaperones or other factors that could help them refold if they were to become damaged. Therefore, the requirements for protein stability might be set higher in the ER than in the cytosol. The stability of proteins that are produced in the ER is enhanced by the formation of disulphide bonds and by the addition of protein-bound glycans. Although these modifications make proteins more stable, they impose more complexities on the folding process. The number of enzymes that are involved solely in the oxidation and isomerization of disulphide bonds is large, and so is the number of enzymes that are needed to synthesize and trim N-linked glycans. It is also probable that the ER exposes folded proteins to further 'prodding' by chaperones to ensure their stability.
As we learn more about the folding and maturation of individual proteins in the ER, and about the mechanisms that are used by individual chaperones, it will be important to consider the overall principles of these systems. How are degradation decisions made in this compartment? How do chaperones and folding enzymes work together? Which are the crucial folding sensors, and how do they recognize their substrates? What is the mechanism for selective cargo loading in ER exit sites? Whether at the level of structural fluctuations in the folded and unfolded proteins or the mobility of the proteins and assemblies in the ER lumen and membrane, we will also need to focus more on dynamic aspects.
The questions above are important, and the answers might allow us to enhance the expression of recombinant proteins that are of crucial industrial and pharmaceutical significance. They might also help us to further understand the many disease states that have their basis in aberrant protein folding in the ER, and they will certainly provide us with a better understanding of the post-translational aspects of protein expression and its regulation in general.
