Посещений:
Мужское Бесплодие

Фрагментация ДНК

DNA fragmentation in human spermatozoa: significance in the diagnosis and treatment of infertility
J.G. Alvarez
Minerva Ginecol. V. 55, No.3, P. 233-239, 2003

Спермии с поврежденной ДНК оплодотворяют метафаза II ооциты с эффетивностью, сравнимой с таковой нормальных спермиев. Однако присутствие в эмбриональном геноме химических модификаций на уровне нуклеотидов ДНК и/или разрывы нити ДНК, получаемые с отцовским геномом (которые не репарируются ооцитом после оплодотворения) несовместимо с нормальным развитием эмбрионов и плодов.
Подсчитано, что 30% всех случаев мужского бесплодия является неясного происхождения (idiopathic). Этиологически некоторы из этих случаев м.б. связаны с повреждениями ДНК спермиев. Однако такие повреждения обычно репарируются ооцитом после оплодотворения. Это зависиот от геномных и цитоплазматических качеств ооцита и степени повреждний ДНК спермиев. Т.к. способность к репарации ооцитов с возрастом снижается, а степень фрагментации ДНК в спермиях увеличиваетя, то это м. объяснить, по крайней мере частично, существенное снижение количества беременностей у старых пар. Присутствие нерепарируемых повреждений ДНК у эмбрионов, проддуцируемых in vivo и in vitro м. объяснить почему эмбрионы с нормальным криотипом неспособны обеспечивать беременность. В целом, чем выше степень повреждений ДНК. переданных эмбриону геномом спермия, тем скорее эти повреждения будут экспрессироваться во время эмбриогенеза и наоборот.
Для изучения повреждений ДНК в бластомерах от эмбрионов, продуцируемых in vitro разработана техника DBD-FISH (DNA Breakage Detection by Fluorescence ib situ Hibridization).

Mechanisms of DNA fragmentation in sperm


1)Альтерации в процессе спермиогенеза в семявыносящем эпителии м. вызывать дефекты ремоделирования хроматина спермиев. Эти изменения будут возникать до spermiation. Считается, что присутствие эндогенных пробелов (nicks) в эйякулируемых спермиях м.б. показателем неполного созревания во время спермирогенеза. Считается, что упаковка хроматина неизбежно велчёт за собой активность эндогенной нуклеазы для создания и связывания nicks, что облегчает protamination. Эти разрывы, как полагают, создают рельеф торсионных стрессов и нацелены на перестройки хроматина во время удаления гистонов с помощью протаминов. Изменения в контроле этог процесса и м. вызывать возникновение нерепарируемых ДНК.
2) Индукция апоптоза во время процесса сперматогенеза.
3) Индукция повреждний ДНК в дифференцированных спермиях с помощью незрелых спермиев, которые продуцируют высокие уровни reactive oxygen spesies (ROS) во время совместной миграции из семявыносящих канальцев в эпидидимис. Т.к. спермии тесно упакованы в свмявыносящих канальцах и эпидидимисах, то это облечает возникновение ROS-индуцированных повреждений ДНК. Скорее всего, что спермии, обнаруживающие наивысшие уровни повреждений ДНК, являются теми, которые имеют наинизший уровень дисульфидных поперечных связей в хроматине.
4) Активация каспаз и эндонуклеаз в дифференцировных спермиях. Известно, что обработка спермиев in vitro 40oC вызывает существнное увеличение фрагментаций ДНК. Недавно было показана индукция in vivo фрагментации ДНК у мышей, подвергнуютых действию 42оС. Авт. пришли к выводуяяяяяяя. что эти повреждения продуцируются в результате индукции абортивного механизма, сходного с апоптоза (т.е. активации в спермиях каспаз и эндонуклеаз).

Determination of sperm DNA fragmentation: test SCSA


Mtcnfvb на фрагментацию м. служить TUNEL, COMET, CMA и Sperm Chromatin Structure Assay (SCSA). Последний измеряет фрагментацию ДНК с помощью жидкостной цитометрии на 5000 сперматозидах. Он делает возможным быстрый, объективный и количественный анализ. Кроме того он не нуждается в замораживании спермиев и криопрезервации.
Результаты теста SCSA представляются в виде СОМРαt значений, которые обнаруживают достоверную корреляцию с величинами беременноси in vivo и in vitro. У 24 пациентов, прошедших IVF/ICSI и не давших беременности, значения СОМРαt более 27% в выборках спермиев, использованных для оплодотворения. Оплодотворения происходили при значении СОМРαt ниже 27%. У 9 пациенток со значениями СОМРαt 34-37%, обнаруживших признаки беременновсти, все они закончились абортацией в первом триместре.
Тест SCSA измеряет чувствительность ДНК спермиев к денатурации in vitro после обработки рН 1.2. ДНК спермиев с нормальным хроматином не денатурируется при этих условиях. Акридин оранжевый окрашивает фрагментированную ДНК красным, а интенсивность красной флюоресценции определеяется жидкостной цитометрией и выражается в виде СОМРαt значений. В терминах успешной беременности при значениях СОМРαt выше 30% беременность не наступает. Это было описано Evenson как "эффект айсберга".

Application to the diagnosis and treatment of infertility


Полностью компетентные зрелые ооциты обладают функциональными механизмами репарации ДНК дефектных спермиев после оплодотворения. Однако незрелые ооциты, ооциты от старых женщин или ооциты, которые были повреждены эндогенными (напр., свободными радикалам) или экзогенными ( напр., курение, средовые токсиканты) факторами м. оказаться неспособными к репарации поврежденных ДНК спермиев. Фатически степень франментации ДНК д.б. определена до начала искусственного оплодотворения. Выборки спермиев с показателями СОМРαt выше 30% д.б. отклонены. Оказалось, что показатели СОМРαt варьируют в зависимости от цикла сперметогенеза от донора. 3 выборки по три пробы были взяти в течение 3-х месяцев от доноров. 3 из 9 оказались с уровенем СОМРαt 35-55% и оказались неспособными к искусственному оплодотворению.
Хотя SCSA тест имеет высокую негативную прогнозируемость, значения СОМРαt ниже 30% не гарантируют беременности, т.к. это м. зависеть от др. факторов, не связанных с качеством генома спермиев. Так на IVF м. влиять и др. характеристики спермиев ( подвижность, capacitation, акросомая реакция, адгезия и слияние, активация ооцита, деконденсация мужского пронуклеуса, присутствие функциональных центриолей) и качествоо ооцитов и наличет восприимчивого эндометрия.


Сайт создан в системе uCoz