Обычные аллогенные трансплантации костного мозга являются новой стратегией для лечения широкго круга аутоиммунных заболеваний. Более 437 пациентов лечили с помощью этой процедуры, включая пациентов со multiple sclerosis (MS), scleroderma, lupus, dermatopolymyositis, rheumatoid arthritis (RA) или juvenile arthritis.
Аутоиммунные гематопоэтические нарушения, включая hemolytic anemia, thrombopenia и aplasia, также подвергали лечению. Однако, величина успеха этого подхода снижается за счет graft-
-host disease (GVHD), отторжания трансплантата донором или неполного T-клеточного восстановления. Следовательно, трансплантации аутологичных стволовых клеток являются предпочтительными, хотя и отмечается быстрое возобновление болезни. Несмотря на это иммунный эффект hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) трудно отличим от эффекта myeloablative режима, включая cyclophosphamide, ассоциированный с воздействием низких доз облучения.
Mesenchymal stem cells (MSCs) являются предшественниками множественных мезенхимных клеонов, включая кости, хрящи, мышцы, жировую ткань, строму костного мозга, а также астроциты.2 MSCs являются взрослыми стволовыми клетками, присутствюущими в большинстве тканей, вовлекаемых в аутоиммунные заболевания. Т.к. эти MSCs м.б. мишенями в патологических органах, то они представляют идеальный рычаг для экспрессии терапевтических белков. Более того, эти клетки обладают иммунологическими свойствами, которые м. усиливать их терапевтический потенциал при аутоиммунитете. По крайней мере, использование мультипотентных клеток открывает перспективы регенеративной медицины после контроля аутоиммунных процессов. .
MSCs или стромальные клетки костного мозга являются плюрипотентными клетками, присутствующими в костном мозге в низких количествах (1 на 10
4-10
5 однодерных клеток), которые способны дифференцироваться в хондроциты, остеоциты, миоциты и адипоциты.
5 MSCs м. увеличиваться в числе более чем в 10
4 раз в культуре без потери своего фенотипа и мультиклнального потенциала. Установлено, что инициальная и последующая концентрации помещаемых клеток являются критическим параметром.
6 Пролиферация повышается, если концентрация засеваемых клеток низкая (<1000 клеток
/cm
2), тогда как индукция некоторых путей дифференцировки обнаруживается при высоких концентрациях клеток, это указывает на роль межклеточного общения. MSCs отличаются от гематопоэтических стволовых клеток. т.к. они не являются предшественниками гематопоэтических клонов и не экспрессируют CD34, CD45, CD14, glycophorin A, T- или B-клеточные маркеры.
7 Потенциал MSC обычно определяется в colony-forming unit fibroblast assay (CFU-F) и MSCs идентифицируются по экспрессии Thy-1 (CD90), endoglin (CD105), vascular cell adhesion molecule (VCAM)-1 (CD106) и hyaluronate receptor (CD44) (обзор Noel
et al8). Хотя в настоящее время MSCs выделяются в основном из костного мозга, они обнаружены также в мышцах, synovium, cord blood или жировой ткани.
9-12 Стандартные условия для генерации MSC из костного мозга покоятся на их способности слипаться в популяции моноядерных клеток после 10- to 14-дневного периода культивирования, Обычно используется среда, содержащая сыворотку плодов телят и в некоторых случаях добавляются факторы роста, такие как basic fibroblast growth factor (b-FGF), platelet-derived growth factor (PDGF) или epidermal growth factor (EGF).
13 Недавно было показано, что MSCs происходят из общего источника, multipotent adult progenitor cell (MAPC), которые дают и др. клоны, столь отличные как эндотелий, энтодерма и эктодерма.
14 MSCs поддерживают рост гематопоэтических предшественников за счет секреции ряда гематопоэтических цитокинов, таких как macrophage colony stimulating factor (M-CSF), interleukin (IL)-6, IL-7, IL-8, IL-11, IL-12, IL-14, IL-15 и leukemia inhibitory factor (LIF).
15 MSCs обладают также потенциалом привлекать введенные в костный мозг гематопоэтические стволовые клетки за счет экспрессии привлекающих рецепторов и хемокинов, таких как stromal-derived factor (SDF)-1.
Immunological characteristics of MSCs
Было предположено, что MSCs избегают иммунную систему, т.к. они обладают фенотипом клеточной поверхности, который отражает плохое распознавание Т клетками. Отсутствие MHC II или T-клеточных ко-стимулирующих молекул B7-1, B7-2, CD40 или CD40L м. частично объяснить, почему MSCs человека не распознаются аллогенными Т клетками.
16 Более того, MSCs, как было показано, супресируют T-клеточные реакции как
in vitro, так и при добавлении MSCs к mixed lymphocyte reaction (MLR), блокирующей пролиферацию аллогенных Т клеток.
17 Подобная MLR ингибиция является дозово зависимой с оптимальным эффектом соотношения клеток MSC:T равным 1:1. Задержанное добавление MSCs все еще ингибирует максимальную Т-клеточную реакцию с 96% супрессии в первый день до 73% на третий день. В таких условиях, добавление IL-2 частично противодействует MSC-индуцированной супрессии MLR. Т.о., MSCs выглядят иммуносупрессивными, аозможно. из-за секреции цитокинов, таких как transforming growth factor (TGF)-β или hepatocyte growth factor (HGF), тогда как IL-6 и IL-11 не принимают в этом участия.
18 MSCs неспособны индуцировать аллогенные Т-клеточные реакции
in vivo, но они, как было установлено, индуцируют иммунную толерантность у хозяина. Даже ксеногенные трансплантации MSCs столь же хорошо вызывают толерантность, как было показано на примере способности мышиных MSCs колонизировать и приживляться в поврежденном миокарде крыс после перевязки коронарной артерии.
19 Это подчеркивает , что не только аллогенные MSCs не отторгаются, но и сохраняют свой потенциал дифференцировки. Эти данные подтверждают, что универсальные донорские MSCs м. использоваться в терапевтических целях.
Tissue-homing capacities of MSCs
Способность MSCs слипаться с компонентами матрикса обнаруживает преимущественное стремление к кости, легким и хрящам при внутривенном введении. Это свойство привлечения проиллюстировано в исследованиях с систематическими введениями MSCs, экспрессирующих маркерные гены, в облученных сингенных мышей. Спустя месяц, 8% клеток костного мозга и 5% клеток легкихх экспрессировали меркерный ген.
7 У бабуинов, получавших меченные MSCs, клетки все еще обнаруживались в костном мозге спустя 500 дней после трансплантации.
20 Более того, GFP-меченные клетки не обнаруживались в др. тканях, несмотря на использование чувствительной PCR техники, это указывает на то, что MSCs преимущественно накапливаются в костном мозге. После intracerebral имплантаций, MSCs были способны пролиферировать, дифференцироваться и, по-видимому, мигрировать вдоль хорошо известных путей миграции нейронов.
21,22 Более того, внутримозговые инъекции MSCs из костного мозга мышей, моделирующих types A и B Niemann
-Pick disease (NPD), показали, что трансплантированные клетки выживают, по крайней мере, в течение 6 мес. после трансплантации и существенно замедляют потерю клеток Пуркинье, характерную для NPD.
23 В др. исследовании, пациенты с osteogenesis imperfecta (генетическим нарушением, вызываемым мутацией в гене коллагена type I и характеризующимся генерализованной osteopenia) получали систематические инъекции аллогенного костного мозга. Такое воздействие вызывало приживление остеобластов (1.5
-2% донорских клеток) на 3 мес. и увеличивало и общее минеральное содержимое костей тела и рост скелета.
24 При такой стратегии систематические инъекции больших количеств MSCs перед любой иррадиацией хорошо переносимы.
Hematopoietic and MSCs in autoimmune diseases
Аллогенные HSCT, после сублетального облучения реципиентных животных, способны индуцировать донор-специфическую толерантность, облегчающую последующую трансплантацию органов. Т.о., химерные мыши, полученные после аллогенной трансплантации костного мозга, не отторгали сердечный трансплантат от того же самого донора, пересаженный двумя месяцами позднее.
25 Это состояние толерантности делает возможным отказ от иммуносупрессивной медикации. Кажется возможным, что этот подход сможет повторно вызывать толерантность при аутоиммунных заболеваниях и м.б. использован для лечения тяжелой scleroderma, psoriatic arthritis, life-threatening lupus или RA. Различные исследования с небольшим количеством пациентов и коротким временем пользования дали различные клинические результаты в зависимости от леченой болезни. При dermatopolymyositis, напр., пациенты не обнарудивали достоверного улучшения.
26 При scleroderma, 62 пациента в течении 3 лет имели 8% смертность после процедуры HSCT.
1 Однако легкое улучшение наблюдалось, только 35% пациентов рецидивировали прогрессивно в течение последнего года лечения. При RA, 45% пациентов обнаруживало улучшение, но у половиныэтих пациентов со временем наступал рецедив. Сообщалось о крупном контролируемом исследовании HSCT у 33 пациентов с refractory RA, которые были рандомизированы, чтобы получить немодифицированный BMT после стандартного режима cyclophosphamide или CD34-selected HSCT.
27 Наиболее информативным результатом такого исследования было то, что у всех пациентов наступал рецедив в течение 180 дней, независимо от того получали пациенты высоко очищенные CD34-позитивные HSCs или необработанные клетки костного мозга. Это указывает на то, что повторное введение HSCs открывает возможность, что Т клетки со временем приведут к агрессивным аутоиммунным клеткам, в зависимости от генетического фона у пациентов или сохранения средовых условий, которые благоприятствуют аутоиммунным процессам. При juvenile arthritis, клинические результаты кажутся лучшими, гистология суставов показывает, что локальное воспаление и Т-клеточная инфильтрация снижаются по мере улучшения состояния детей.
28 Успешность этого агрессивного режима все еще сравнима с anti-TNF лечением в терминах эффективности. Однако, кажется разумным включить в HSCT протоколы пациентов устойчивость к TNF-блокирующим агентам. В случает генетически предопределенного аутоиммунитета аллогенный источник стволовых клеток д.б. необходим, чтобы избежать ремиссии аутоиммунитета. Однако, MSCs или стромальные клетки, присутствующие внутри костного мозга, м.б. критическими для иммуносупрессивного эффекта лечения.
Экспериментальные аутоиммунные заболевания, такие как adjuvant arthritis у крыс, collagen-induced arthritis (CIA) или экспериментальный encephalomyelitis у мышей, м.б.излечены с помощью трансплантаций костного мозга.
29,30 При этих экспериментальных процедурах, общий трансплантат костного мозга содержит и HSCs и стромальные клетки и среди них MSCs играют центральную роль в индукции толерантности. Аллогенные трансплантации костного мозга, асоциированные с транплантатами кости оказались эффективными при лечении аутоиммунных нарушений, таких как у MLR/lpr mмышей, моделирующих волчанку.
31 На 40 неделе, мыши, леченные с помощью этого подхода, излечивались, с существенным снижением титра антител анти-ДНК и antirheumatoid factor (anti-RF) в сыворотке и с отсутствием иммуноглобулиновых отложений в почечных гломерулах. Все обработанные мыши жили более 1 года. В этих экспериментах стромальные клетки, как предполагалось, играют критическую роль по сравнению с HSCs. Чтобы опредлить действительное знчение MSCs слипчивые клетки удаляли из всей выборки костного мозга перед трансплантацией. В этом случае 75% леченных животных погибало в течение 90 дней. Напротив, добавление в костный мозг, лишенный слипчивых клеток, стромальных клеток позволяло лечить аутоиммунные заболевания, подтверждая тем самым критическую роль в терапевтическом эффекте MSCs. В качестве иллюстрации м. служить систематические вливания аутологичных MSCs, задерживающие отторжение донорских клеток с 7 до 11 дней в мвшиной модели кожных трансплантатов.
17 В этой модели применение больших количеств аутологических MSCs сравнимо в терминах эффективности с введением cyclosporine, конъюгированным с anti-CD80 терапией. Эта индукция толерантности м.б. использована в аллеогенных трансплантациях, при которых наблюдаются низкие показатели GVHD, когда гематопоэтический трансплантат конъюгирован с MSCs.
32 Толерогенный эффект введенияч MSC эквивалентен независимо от того, каким способом инъецировались клетки, внутривенно или помещениме на osteo-inductive матрикс.
Присутствие MSCs продемонстрировано в тканях, производных мезенхимы, таких как поврежденный synovium в случае хронического воспаления как у RA пациентов или в артритичпеских суставах мышей DBA1 с CIA.
33,34 При экспериментальном CIA, MSCs обнаруживаются в суставах животных за 2 недели до начала болезни. В это же время синовиальная гиперплазия ассоциирует с увеличением medullar клеток в области эпифизов и образованием каналов между костным мозгом и полостью сустава.
34 Гистологический анализ подтверждает, что MSCs м. мигрировать из костного мозга. Более 2% клеток окрашивается позитивно по одному из маркеров MSCs, bone morphogenetic protein receptor (BMPR)-I, и негативно по HSC-специфическому маркеру CD34. Накопление MSCs в суставах TNFα-зависимо, т.к. anti-TNF обработка предупреждает накопление. Роль MSCs в артритическом процессе еще невыяснена, но их способность продуцировать хемокины и цитокины, такие как IL-6, IL-12 и IL-15 указывает на активную их роль в хроническом воспалении. Хотя происхождение этих стволовых клеток в сутавах неизвестно, их присутствие в нормальном synovium продемонстрировано у людей и кроликов, в котором TGFβ стимуляция индуцирует образование хрящевой ткани.
32,35
Engineering MSCs
MSCs м.б. использованы для различных терапевтических стратегий или как иммуносупрессивные агенты или генетически пребразованные, чтобы экспрессировать молекулы, действующие против аутоиммунного процесса. Т.к. MSCs не отторгаются и переносятся в поврежденные мезенхимные ткани, в частности в кость, то они представлют собой средство для внесения терапевтических белков. MSCs преобразованные, чтобы экспрессировать BMP-2, цитокин, участвующий в дифференцировке кости, м. дифференцироваться в кость, если имплантированы в мышцы.
36 Они были также способны индуцировать репарацию сегментных дефектов кости у мышей. В этом случае, клетками опосредуемая терапия обнаруживала преимущества в рекрутировании MSCs из реципиента (посредством paracrine эффекта) и индукции образования новой эндохондральной кости (autocrine эффект). На экспериметальной SCID
/hu модели, человеческие MSCs, преобразованные, чтобы продуцировать IL-3, засевали в osteo-inductive ceramic cubes, которые затем подкожно имплантировали мышам.
32 Дифференцировка MSC происходила внутри кубиков и вызывала в результате формирование кости и секрецию IL-3 в системное кровообращение в течвение, по крайней мере, 12 недель. MSCs лгко трансдуцируют ретровирусные векторы с эффективность переноса генов от 50 до 85%.
37 Это делает возможной долговремпенную экспрессию, более 3-х месю у грызунов. MSCs м. также использоваться как устройства для экспрессии цитокинов и они м. эффективно трансдуцироваться, чтобы секретировать некоторые терапевтические белки, такие как erythropoietin (EPO) человека или фактор IX, секреция
in vivo обнаруживается свыше 90 дней после подкожного введения клеточного имплантата.
38 Интерферон-β-экспрессирующие MSCs были способны ингибировать рост злокачественных клеток
in vivo, когда имплантировались вместе с опухолевыми клетками, но этого не происходило, если MSCs имплантировали в место, удаленное от опухоли.
39 Сходным образом, имплантация MSCs, генетически преобразованных, чтобы экспрессировать soluble tumor necrosis factor receptor (sTNF-R) II, NOD
/SCID мышам приводила к появлению в сыворотке цитокина и к эффективному терапевтическому эффекту в виде снижения в сыворотке уровня TNFα.
40
Conclusion
Engineered MSCs have a great potential in the treatment of autoimmune diseases. Their immunosuppressive effect is in part related to secretion of immunosuppressive cytokines such as TGFβ and HGF that should block the T helper 1 (Th1)-cell-driven response. Moreover, these MSCs may be efficiently genetically modified to express anti-inflammatory cytokines Finally, their homing capacities to mesenchymal tissues, in particular to injured sites, may contribute to their potential use in the treatment of autoimmune diseases