Regulation of myostatin activity and muscle growth
Se-Jin Lee and Alexandra C. McPherron
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 98, Issue 16, 9306-9311, July 31, 2001
(Рис.1.) | Binding of myostatin to activin type II receptors. (a) Analysis of purified myostatin protein. Myostatin protein preparation following the heparin column (heparin eluate) or following reverse-phase HPLC (fractions 32-34 or 35-37 containing the C-terminal region or propeptide, respectively) was electrophoresed under reducing (+βME) or nonreducing (-βME) conditions and either silver stained or subjected to Western analysis. (b) Binding of myostatin to lentil lectin. The heparin eluate was bound to lentil lectin Sepharose and eluted with methyl mannose. Samples were electrophoresed under reducing conditions, blotted, and probed with antibodies directed against the C-terminal region. Similar analysis by using antibodies directed against the pro region showed that the pro region was also retained on the column and eluted with methyl mannose (data not shown). (c) Crosslinking experiments. COS-7 cells transfected with expression constructs for the indicated receptors were incubated with 125I-myostatin followed by the crosslinking agent disuccinimidyl suberate. Crosslinked complexes were analyzed by SDS/PAGE. Asterisk denotes predicted size for myostatin bound to an activin type II receptor. In the rightmost lane, excess unlabeled myostatin was included in the binding reaction. (d) Binding of myostatin to ActRIIB. All points represent the average of triplicate samples. (e) Scatchard analysis of the data shown in d. (f) Inhibition of myostatin binding to ActRIIB by follistatin (diamonds) and the propeptide (circles). Each experiment was carried out in triplicate, and each curve represents the average of three independent experiments.
(Рис.2.) | Increased muscling in mice overexpressing a dominant-negative form of ActRIIB or full length follistatin. A control male nontransgenic mouse, a male transgenic mouse from the C11 line (dominant-negative ActRIIB), and the F3 male founder mouse (follistatin) are shown. Pictures of live mice are shown in the top row, and pictures of animals that had been killed and skinned are shown in the bottom three rows.
(Рис.3.) | Analysis of transgenic mice. (a) Specific expression of transgenes in skeletal muscle. Northern analysis of RNA samples prepared from female mice was carried out by using simian virus 40 sequences as a probe. On longer exposures of these blots, no expression of the transgenes was observed in liver, kidney, spleen, or heart in any of these lines. (b) Muscle analysis. Sections were stained with hematoxylin and eosin. The gastrocnemius and plantaris muscles are outlined (Left). Center shows higher magnifications of representative areas from the gastrocnemius muscle. Right shows distribution of fiber diameters. Each graph represents the composite of 450 fiber measurements from 3 animals (150 per animal), except for the F3 graph, which represents 175 measurements from the F3 founder animal. Standard deviations of fiber sizes were 9, 11, 11, and 13 µm for control, B32, C27, and F3 animals, respectively. Black and gray arrows show the mean fiber diameters for control and transgenic animals, respectively. Note that in each case, the mean fiber diameter was increased in the transgenic animals (P < 0.001).
(Табл.1.) | Muscle weights, mg
(Табл.2.) | Muscle weights, mg
Myostatin является членом семейства трансформирующиего фактора роста-β, который действует как негативный регулятор массы скелетных мышц. Myostatin экспрессируется первоначально в миотомном компартменте развивающихся сомитов и продолжает экспрессироваться в миогенном клоне в течение всего развития и у взрослых. Мыши с делецией миостатинового гена обнаруживают драматическое и повсеместное увеличение массы скелетных мышц за счет гиперплазии и гипертрофии волокон. Отдельные мышцы нулевых по myostatin мышей весят примерно вдвое больше, чем у контрольных. Последовательности myostatin высоко законсервированы в ходе эволюции. Последовательности миостатина человека, крысы, свиньи, индейки и кур идентичны в биологически активной С-терминальной порции молекулы, сопровождаемой сайтом протеолитического процессинга. Функция миостатина также законсервирована, т.к. мутации гена myostatin удваивают мышечную массу у рогатого скота.
Для выявления новых стратегий блокирования активности миостатина изучали регуляцию передачи сигналов миостатина. Белок, очищенный из клеток млекопитающих состоит из нековалентно удерживаемого комплекса из N-терминального пропептида (частью белка-предшественника выше сайта протеолитического процессинга) и дисульфидно-сцепленного димера из С-терминальных фрагментов. Очищенный C-терминальный миостатиновый димер способен связываться с рецепторами активина типа II, Act RIIB, и в меньшей степени с Act RIIA. Связывание миостатина с Act
RIIB м.б. ингибировано с помощью активин-связывающего белка follistatin и при высоких концентрациях с помощью миостатинового пропептида. Получены трансгенные мыши, экспрессирующие высокие уровни propeptide, follistatin или доминантно-негативной формы Act RIIB при использовании мышеце-специфических промоторов. Каждая трансгенная линия мышей вызывала драматическое увеличение мышечной массы, сравнимое с таковым у myostatin нокаутных мышей. Следовательно, propeptide, follistatin, или др. молекулы, ингибирующие передачу сугналов по этому пути м.б. использованы для усиления мышечного роста как для лечения у человека, так и для использования в с/х.
Итак, установлено, что миостатин м. нормально существовать in vivo в латентном комплексе с пропептидом и что активация миостатина ведет к передаче сигналов путем связывания с рецепторами активина типа II.
Предложена рабочая модель регуляции активности миостатина. После протеолитического процессинга миостатиновый С-терминальный димер сохраняется в латентном комплексе с пропептидом и с др. белками также. Myostatin негативно регулируется с помощью follistatin, который связывается с C-терминальным димером и ингибирует его способность соединяться с рецепторами. Высвобождение
C-терминального димера от этих ингибирующих белков с помощью еще неизвестного механизма позволяет миостатину передавать сигналы через рецепторы активина типа II. По аналогии с др членами семейства предполагается, что активация этих рецепторов ведет к активации рецептора типа I и Smad белков.
Модель согласуется не только с представленными данными, но и с др. генетическими данными. Нокаутные по follistatin мыши обнаруживают пониженную мышечную массу при рождении, это и ожидается при отсутствии ингибирования активности миостатина. Сходный мышечный фенотип обнаруживается и у мышей без ski, который как известно ингибирует активность Smad2 и 3 , а противоположный фенотип с избытком мышечной массы обнаруживается у мышей с избыточной экспрессией ski.
Правда полученные данные согласуются с альтернативной моделью с участием дрю рецепторов и лигандов. Напр., неизвестен механизм, с помощью которого укороченная форма Act RIIB усиливает рост мышц у трансгенных мышей. Возможно, что укороченные рецепторы неспособны блокировать передачу сигналов к клеткам мишеням, а скорее всего действуют как тянущий на дно груз, снижающий внеклеточные концентрации миостатина.
Возможно и то, что укороченные рецепторы блокируют передачу сигналов от др. лигандов помимо миостатина. У др. видов было показано, что доминантно-негативные формы типа II activin receptors м. блокировать передачу сигналов от разнообразных родственны TGF-β лигандов. Сходным образом полученные данные не выявили с определенностью, что follistatin блокирует активность миостатина in vivo чтобы способствовать мышечному росту.Возможно, что и др. чувствительные к follistatin лиганды м. участвовать в регуляции мышечного роста. Одним из возможных кандидатов является GDF-11, которых довольно сильно связан с миостатином и также экспрессируется в скелетных мышцах. Более того, известно, что активность GDF-11 у Xenopus м.б. блокирована follistatin. Др. лигандами кандидатами м.б. активины, которые, как известно, способны ингибировать дифференцировку мышечных клеток in vitro.
Однако, миостатин единственный секретируемый белок, который играет негативную роль в регуляции мышечной массы in vivo. Итак, антогонисты миостатина, такие как follistatin и пропептид миостатина, или антогонисты активиновых рецепторов типа II м.б. эффективными агентами, повышающими мышечную массу.