Xenopus muscle development: From primary to secondary myogenesis Christophe Chanoine (chanoine@biomedicale.univ-paris5.fr), Serge Hardy
Developmental DynamicsVolume 226, Issue 1, 2003. Pages:12-23
Developmental DynamicsVolume 226, Issue 1, 2003. Pages:12-23
Xenopus myogenesis is characterized by specific features, different from those of mammalian and avian systems both at the cellular level and in gene expression patterns. During early embryogenesis, after the initial molecular signals inducing mesoderm, the myogenic determination factors XMyoD and XMyf-5 are activated in presomitic mesoderm in response to mesoderm-inducing factors. After these first inductions of the myogenic program, forming muscles in Xenopus can have different destinies, some of these resulting in cell death before adulthood. In particular, it is quite characteristic of this species that, during metamorphosis, the primary myotomal myofibers completely die and are progressively replaced by secondary "adult" multinucleated myofibers. This feature offers the unique opportunity to totally separate the molecular analysis of these two distinct types of myogenesis. The aim of this review is to summarize our knowledge on the cellular and molecular events as well as the epigenetic regulations involved in the construction of Xenopus muscles during development.
(Рис.1.) | Blastomeres in 32-cell stage Xenopus embryo. Those cells coloured red contribute 40-50% of their progeny to somites. Those coloured orange contribute 30-40% of their progeny to somites. Most of the somite becomes muscle (redrawn from Dale and Slack, 1987a).Used with permission of the Company of Biologists, Ltd.
(Рис.2.) | Pathways for segmentation and differentiation of myotomes in Xenopus laevis. Myoblasts differentiate into uninucleate myotubes. Later, at the onset of metamorphosis, these cells develop into multinucleate muscle fibers. These multinucleated primary myotomal fibers in Xenopus arise from amitotic division of the primary nuclei (Boudjelida and Muntz, 1987), hence without cell fusion, the nuclei of the uninucleate myotomal myotubes being polyploid in this species (Kielbowna,1966]). However, we cannot exclude that some "secondary" migrating myoblasts or some activated satellite cells expressing myogenin could take part in the multinucleation process (Nicolas et al.,). Redrawn and modified from Radice et al. (1989).
(Рис.3.) | Schematic representation of the events of secondary myogenesis in Xenopus laevis showing the replacement of primary myofibers by secondary myofibers in axial muscles and the formation of limb muscles during metamorphosis. Just before metamorphosis, adult body myoblasts fuse and form some adult-type muscle fibers along the dorsomedial edge of the dorsal muscle. During metamorphosis, adult type areas expanded from dorsomedial to ventrolateral side with an anteroposterior gradient; these events were due to cell replacement with secondary myogenesis initiated from the dorsomedial edge of dorsal muscle and degeneration of preexisting larval-type muscle fibers both in the body and tail. Redrawn and modified from Nishikawa and Hayashi (1994). Used with permission of Academic Press.
(Рис.4.) | Growth and death waves in larval-to-adult conversion of muscle during Xenopus metamorphosis. Adult-type gene expression (terminal differentiation) and growth of presumptive adult-type myoblasts are initiated at the prometamorphic stage. Adult-type areas (black) expand in a wave-like manner (growth wave) from the dorsomedial to the ventrolateral side, with an anteroposterior gradient during the metamorphic climax stage. The area of muscle cell death (muscle apoptotic area) first appeared near the base of the tail at the early climax stage. Thereafter, the dying area expanded like a wave (death wave) from the base of the tail to the anterior and posterior sides. All preexisting larval-type muscle fibers (white) in the body and tail disappeared. Redrawn from Nishikawa and Hayashi (1995). Used with permission of Springer-Verlag.
(Рис.5.) | Expression of tropomyosin mRNAs in dorsal muscle. Transverse sections of the body at stage 54 submitted to in situ hybridisation reacted with probes as indicated. The region of the dorsomedial edge (arrowheads) corresponding to secondary myofibers only express the β-TMad gene, an adult muscle gene, whereas the primary myofibers only express the TM α7 gene, an larval muscle gene. The TM α2 transcripts are detected in both primary and secondary myofibers.
(Рис.1.) | Blastomeres in 32-cell stage Xenopus embryo. Those cells coloured red contribute 40-50% of their progeny to somites. Those coloured orange contribute 30-40% of their progeny to somites. Most of the somite becomes muscle (redrawn from Dale and Slack, 1987a).Used with permission of the Company of Biologists, Ltd.
(Рис.2.) | Pathways for segmentation and differentiation of myotomes in Xenopus laevis. Myoblasts differentiate into uninucleate myotubes. Later, at the onset of metamorphosis, these cells develop into multinucleate muscle fibers. These multinucleated primary myotomal fibers in Xenopus arise from amitotic division of the primary nuclei (Boudjelida and Muntz, 1987), hence without cell fusion, the nuclei of the uninucleate myotomal myotubes being polyploid in this species (Kielbowna,1966]). However, we cannot exclude that some "secondary" migrating myoblasts or some activated satellite cells expressing myogenin could take part in the multinucleation process (Nicolas et al.,). Redrawn and modified from Radice et al. (1989).
(Рис.3.) | Schematic representation of the events of secondary myogenesis in Xenopus laevis showing the replacement of primary myofibers by secondary myofibers in axial muscles and the formation of limb muscles during metamorphosis. Just before metamorphosis, adult body myoblasts fuse and form some adult-type muscle fibers along the dorsomedial edge of the dorsal muscle. During metamorphosis, adult type areas expanded from dorsomedial to ventrolateral side with an anteroposterior gradient; these events were due to cell replacement with secondary myogenesis initiated from the dorsomedial edge of dorsal muscle and degeneration of preexisting larval-type muscle fibers both in the body and tail. Redrawn and modified from Nishikawa and Hayashi (1994). Used with permission of Academic Press.
(Рис.4.) | Growth and death waves in larval-to-adult conversion of muscle during Xenopus metamorphosis. Adult-type gene expression (terminal differentiation) and growth of presumptive adult-type myoblasts are initiated at the prometamorphic stage. Adult-type areas (black) expand in a wave-like manner (growth wave) from the dorsomedial to the ventrolateral side, with an anteroposterior gradient during the metamorphic climax stage. The area of muscle cell death (muscle apoptotic area) first appeared near the base of the tail at the early climax stage. Thereafter, the dying area expanded like a wave (death wave) from the base of the tail to the anterior and posterior sides. All preexisting larval-type muscle fibers (white) in the body and tail disappeared. Redrawn from Nishikawa and Hayashi (1995). Used with permission of Springer-Verlag.
(Рис.5.) | Expression of tropomyosin mRNAs in dorsal muscle. Transverse sections of the body at stage 54 submitted to in situ hybridisation reacted with probes as indicated. The region of the dorsomedial edge (arrowheads) corresponding to secondary myofibers only express the β-TMad gene, an adult muscle gene, whereas the primary myofibers only express the TM α7 gene, an larval muscle gene. The TM α2 transcripts are detected in both primary and secondary myofibers.
Маргинальная зона бластулы, из которой частично дифференцируется аксиальная мусклатура, является субъектом двух сигналов индукции мезодермы, исходящих из вегетативных клеток. Сигнал dorsal/vegetal (DV) индуцирует дорсальную мезодерму (Spemann Organizer [O]) и ventral/vegetal (VV) сигнал, индуцирующий ventral mesoderm (VM). После этих вегетативных первичных индукций действуют дорсализующие сигналы на ст. поздней бластулы и гаструлы. Дорсализующие сигналы секретируются из организатора и обладают способностью индуцировать вентральную мезодерму, чтобы сформироваь более дорсальные типы клеток, такие как мышцы, хорда и пронефросы.
На молекулярном уровне, во-первых, некоторые секретируемые полипептидные факторы из семейства transforming growth factor-beta (TGFβ)(такие как Xnrs, Vg1, или BMP-4) и семейства fibroblast growth factor (FGF), продуцируемые вегетативными клетками, индуцируют маргинальную зону, чтобы дать мезодерму. Во-вторых, формирование паттерна мезодермы - более сложный процесс - происходит с вовлечением многочисленных, специфичных для мезодермы генов в качестве транскрипционых факторов, принадлежащих к классам, представленными T-доменовыми генами или гомеобоксными генами, а также секретируемыми белками с определенными паттернами экспрессии в мезодерме гаструлы Xenopus. Шпемановский Организатор, как полагают, формирует паттерн мезодермы, действуя как источник секретируемых дорсализующих молекул, таких как chordin и noggin, в противоположность вентрализующим молекулам, таким как BMP-4 и Xwnt-8.
ESTABLISHMENT OF MUSCLE LINEAGES DURING EARLY EMBRYOGENESIS
ESTABLISHMENT OF MUSCLE LINEAGES DURING EARLY EMBRYOGENESIS
Отслеживая клоны мезодермальных клеток со стадии 32-клеток было установлено, что большинство (83%) сомитов и , следовательно, большинство мышц происходят из бластомеров B2+3 и C2-4 (Рис. 1). Было показано, что большинство аксиальных мышц происходит из дорсальной маргинальной зоны на ст. 8-10. Было также установлено, что 40-60% клеток, находящихся во внутренней дорсолатеральной области ранней гаструлы будут формировать мышечные клетки. Предшественники мышц, культивируемые in vitro во время ст. гаструляции дифференцируются в мышцы только, если они находятся в общении с большим числом подобных клеток. Этот эффект, названный community effect, по-видимоу, связан с участием растворимых пептидов, секретируемых будущими мышечными клетками.
Показано, что eFGF скорее всего и обеспечивает эффект сообщества (community effect) в миогенезе Xenopus.
Первая активация мышце-специфических генов обнаруживается во время гаструляции и связана с двумя миогенными регуляторными факторами XMyf-5 и XMyoD, чьи транскрипты обнаруживаются на ст. 9.5 и 10.5, соотв., вскоре после аккумуляции транскриптов α кардиального актина, первого мышечного структурного гена, экспрессирующегося у позвоночных. Мyogenic regulatory factors (MRFs) семейства MyoD (включая самого MyoD, Myf-5, myogenin, и MRF4) являются basic helix-l (bHLH) helix транскрипционными факторами, чья эктопическая экспрессия способна конвертировать широкие пределы культивируемых клеток в мышечный фенотип и которые м. способствовать транскрипции некоторых мышце-специфических генов. Нокаутные мыши показали, что MyoD и Myf-5 играют перекрывающиеся роли в спецификации миобластов, тогда как myogenin и или MyoD или MRF4 необходимы для дифференцировки. В отличие от мышиных моделей, где первым экспрессируются Myf-5 и MyoD в сомитах, у эмбрионов Xenopus эти два MRFs м. обнаруживаться в пресомитной мезодерме на уровне транскриптов и белка для MyoD.
XMyf-5 экспрессия впервые становится видимой на ст. ранней гаструлы в двух симметричных дорсолатеральных доменах, тогда как в ранней гаструле экспрессия XMyoD появляется во всей маргинальной зоне за исключением дорсального домена. У Xenopus, микроинъекции синтетических XMyf-5 или XMyoD мРНК в ранние эмбрионы подтвердили, что XMyf-5 м. действовать в основном во время очень ранних стадий миогенеза до XMyoD и показали, что имеющиесяся эти два MRFs способны индуцировать преходящую волну эктопической экспрессии α-cardiac actin в анимальной шапочке.
In vivo анализ показал, что XMyf-5 также как и XMyoD транскрипты м. индуцировать миогенную программу после эктопических микроинъекций. М. предположить, что строгое накопление XMyf-5 и XMyoD мРНК в проспективной сомитной области ранней гаструлы в последствии проявляется дифференировкой миотомных мышечных клеток. Гипотеза, что компетентность формировать мышцы теряется у эмбрионов прежде чем миогенные предшественники будут детерминированы (committed), перепроверена. В то время, как результаты, представленные выше, свидетельствуют о прямой связи между активацией транскрипции этих миогенных генов и детерминацией миобластов, некоторые др. наблюдения осложняют эту интерпретацию. У Xenopus, имеется два XMyoD гена (названных XMyoDa и XmyoDb), которые происходят из двух неаллельных локусов псевдотетраплоидного генома Xenopus. Во-первых, яйца лягушек содержат материнский пул XMyoDa РНК, который не локализуется в проспективных мышц-формирующих областях. Во-вторых, во время перехода от средней бластулы, который маркирует начало экспрессии зиготических генов,
оба MyoD гена временно транскрибируются на низких уровнях где-то еще в эмбрионе и этот процесс не связан с индукцией мезодермы. Предполагается, что у ранних эмбринов лягушек XMyoD белок находится под негативным контролем. Экспериментальный анализ выявляет, что XMyoD является в основном цитоплазматическим, за исключением локальной области, которая вкючает презумптивную мезодерму, где она ядерная. Предполагается, что эмбрионы лягушек регулируют внутриклеточную локализацию XMyoD белка как следствие мышечной индукции. Став ядерным, MyoD м. активировать свою собственную транскрипцию и детерминировать клетки в миогенный клон. Показано, что MyoD является прямым, позитивным регулятором Notch лиганда Delta-1 в проспективных миобластах preinvoluted мезодермы гаструлы Xenopus, это подтверждает прямое вовлечение Notch в детерминацию мышц.
WHAT MOLECULAR SIGNALS INITIATE THE MYOGENIC PROGRAM DURING Xenopus EMBRYOGENESIS?
WHAT MOLECULAR SIGNALS INITIATE THE MYOGENIC PROGRAM DURING Xenopus EMBRYOGENESIS?
У млекопитающих хорошо известно, что некоторые факторы, продуцируемые с помощью сомитных условий (хорда, нервная трубка или дорсальная эктодерма) имеют критическое значение для инициации миогенной программы, характеризуемой активацией двух MRFs, Myf-5 и MyoD, в разных частях формирующегося сомита. У Xenopus активация факторов миогенной детерминациии MyoD и Myf-5 в мышце-формирующей области происходит в ответ на mesoderm-inducing factors (MIFs). Разные члены семейства FGF, TGF-β и Wnt белков вовлечены в этот процесс. Wnts эволюционно законсервированное семейство секретируемых белков, которое обеспечивает передачи межклеточных сигналов, и которое участвует в инициальных событиях миогенеза у млекопитающих. Эта связь, по-видимому, имеет место и у Xenopus, т.к. экспрессия доминантно-негативного Xwnt-8 блокирует индукцию XMyoD у эмбрионов Xenopus и т.к. эктопическая экспрессия функционального Xwnt-8 в дорсальной маргинальной зоне гаструлы индуцирует эктопический XMyoD. Установлено, что Wnt/beta-catenin путь необходим для регуляции экспрессии миогенных генов в презумптивной мезодерме и м. непосредственно активировать экспрессию гена XMyf-5 в клетках мышечных предшественников. XMyoD кроме того временно экспрессируется в анимальных шапочках после инъекции в них BMP-4 и в целых эмбрионах после инъекции BMP-4 количество транскриптов XMyoD возрастает. Показано, что экспрессия XMyf-5 и мышечная дифференцировка нуждаются в низких дозах BMP-4, которые возникают в результате наложения противодействующих белков BMP-4 и noggin in
vivo. Эти результаты подчеркивают критическую роль секретируемых молекул, участвующих в формировании паттерна мезодермы, в региональной экспрессии MRF в гаструле. Установлено также, что neuroregulin, epidermal growth factor (EGF)-подобный фактор роста, известный своей ролью в нейральной и мышечной дифференцировке. индуцирует эктопически некоторые члены семейства генов MyoD, такие как сам MyoD или Myf-5.
Инъекции kielin, секретируемого фактора, который содержит множественные Cys-богатые повторы, сходные с теми, что в chordin, вызывает экспансию экспрессии MyoD на ст. нейрулы эмбрионов.
Как MIFs индуцируют MRFs неясно. Для MyoD индукция зависит от возраста развития индуцируемых клеток скорее, чем типа или времени воздействия индуктора. Напр., в подходящее время, индукция de novo MyoD с помощью активина нуждается менее чем в 90 мин, это свидетельствует в пользу немедленного ответа скорее, чем в пользу серии индуктивных событий. Предполагается, что домен экспрессии MyoD's у эмбрионов зависит от взаимодействия временых изменений клеточной компетентности, путей плейотропной передаи сигналов и аутокатализа. Подчеркивается, что гистон деацетилазная активность необходима для индукии MyoD клона мышечных клеток у Xenopus. Установлено, что eFGF необходим для инициальной активации транскрипции XmyoD в клоне миогенных клеток Xenopus, предполагается существование молекулярого пути миогенной спецификации у лягушек, где eFGF сам выступает в качестве немеделенного раннего ответа на MIFs. В этой модели, vegetally расположенные материнские факторы, такие как VegT, регулируют экспресссию TGF-β сигнальных молекул, как и родственного nodal фактора Xnr2. Эти факторы индуцируют мезодерму на ст. бластулы и акивируют экспрессию субнабора генов, включая eFGF в формирующейся мезодерме. eFGF индуцирует экспрессиюXmyoD в мезодерме и специфицирует клетки миогенного клона, возможно посредством ингибирования лабильного транскрипционного репрессора XmyoD.
EXISTENCE OF DIFFERENT SKELETAL MUSCLE FATES
EXISTENCE OF DIFFERENT SKELETAL MUSCLE FATES
Известно, что мышцы амфибий м. иметь разное предназначение, некоторые из клеток погибают еще до достижением взрослого периода. Судьба одних связана с ранней эмбриональной гибели и происходит в мышцах наиболее краниальных миотомов. Волокна из этих миотомов первыми дифференцируются у эмбрионов и у Xenopus они даже иннервируются и функциональны. Они также подвергаются автономной. запрограммировнной гибели в кранио/каудальной последовательности, начиная приблизительно со ст. 26 и заканчиваясь на ст. 52. Считалось, что миотомы туловища имеют другую судьбу, что они персистируют в течение всего взрослого периода. Однако, установлено, что и мышци из туловищных миотомов , так же как и мышцы adductor челюстей погибают во время метаморфоза и прогрессивно замещаются новыми взрослыми мышцами. Третья судьба, поздняя эмбриональная гибель, связана с волокнами хвостовых миотомов, которые дифференцируются во время личиночной стадии, затем дегенерирую во время метаморфоза. Наконец, четвертая судьба соответствует позднему развитию и связана с мышцами конечностей, которые не появляются вплоть до средины метаморфоза, но затем сохраняются во взрослых конечностях.
MECHANISMS PRODUCING PRIMARY MYOTOME
MECHANISMS PRODUCING PRIMARY MYOTOME
Первичные миотомы возникают из сомитов, которые в свою очередь происходят из ткани мезодермы, которая инвагинирует во время гаструлчции. Сомиты формируются прогрессивно со скоростью примерно 1.5 сомита в час, начиная со ст. 17. У Xenopus большая часть сомита состоит из миотомных клеток, которые должны дать мышцы. Небольшая дорсолатеральная часть каждого сомита формирует кожу (dermatome), и лишь незанчительное количество, ближайшее к хорде, как считают, формирует склеротом.
Происхождение мышц головы не прослежено в деталях, они происходят из наиболее переденей части инвагинирующей мезодермы, которая оказываетя расположенной на постгаструлярных ст. во фронте хорды. Как это наблюдается у др. позвоночных, мышцы вентральной стенки тела, а также мышцы конечностей, по-видимому, возникают в результате миграции клеток мышечных предшественников из аксиальных сомитов. Это характерно и для образования мышц вентральной стенки тела у личинок Xenopus. Этот процесс сходен с развитием hypaxial мышц у кур и мышей. Клетки специфицирующиеся в миграторный клон обнаруживают активирование (up-regulation) гена pax3 в вентролатеральной области сомита. Эти pax3-позитивные клетки мигрируют вентрально, прочь от сомита и подвергаются терминальной дифференцировке, экспрессируя Myf-5, сопровождаемый MyoD.
У Xenopus, клетки сомитомеров первоначально ориентированы перпендикулярно к оси несегментированной параксиальной мезодермы, затем они родируют на 90 градусов и располагаются параллельно оси, при этом каждое мышечное волокно первичного миотома занимает всю длину одиночного миотома (Рис. 2). Клеточные события, связанные с образованем и дифференцировкой сомитов Xenopus хорошо известны. Установлено, что сегментный паттерн генерируется в пресомитной мезодерме эмбрионов Xenopus с помощью генов, кодирующих Mesp-подобный bHLH белок, называемый thylacine 1, и компоненты сигнального пути Notch. Эти гены устанавливают повторяющиеся паттерны экспрессии генов, которые подразделяют клетки пресомитной мезодермы на передений и задний получегмент. Члены семейства protocadherin молекул клеточной адгезии, называемые PAPC, экспрессируются в пресомитной мезодерме Xenopus в виде полусегментных паттернов, указывая тем самым, что они м. играть роль в ограничении перемешивания клеток на передней сегментной границе и что они м. регулировать сомитную ротацию.
Во время развития у большинства позвоночных скелетные мышцы, многоядерные мышечные трубки образуются в результате слияния многих миобластов. Однако, этого не происходит во время миогенеза мышц первичных миотомов X. laevis, в которых миобласты дифференцируются в одноядерны мышечные трубки(myotubes). Позднее, с началом метаморфоза, они формируют многоядерные мышечные волокна. Некоторые полагали, что многоядерные первичные миотомные волокна у Xenopus возникают в результате амитотических делений первичных ядер; действительно, без слияния клеток ядра одноядерных миотомных myotubes м. становиться полиплоидными вплоть до октоплоидных у этих видов. Однако, показано, что этот механизм в основном ответственнен за многоядерность большинства первичных личиночных волокон, хотя нельзя исключить, что и некоторые вторичне мигрирующие миобласты и некоторые активированные сателлитные клетки используюжт этот процесс умножения ядер (Рис. 2). С др. стороны, некоторые моноядерные волокна м. сливаться др. с др., формируя многоядерные вторичные миотомные мышечные волокна, как это имеет место в миотомах мышей.
CELL DEATH AND SECONDARY MYOGENESIS
CELL DEATH AND SECONDARY MYOGENESIS
Метаморфоз является периодом критических изменений в разитии амфибий, находящийся целиком под контролем временного увеличения уровня thyroid hormone (TH). TH действует посредством семейства ядерных рецепторов, которые взаимодействуют с хроматином, модулируя транскрипцию TH-чувствительных генов.
Известно, что первичные миотомные мышечные волокна погибают и замещаются вторичными многоядерными мышечными волокнами, возникающими в результате слияния только что мигрировавшихво время метаморфоза миобластов взрослого типа. Считается, что запрограммированая гибель мышечных клеток важна в дегенерирующем хвосте, также как и для превращения линичночных во взрослые мышцы дорсальной части тела X. laevis (Рис. 4). X. laevis является единственной модельной системой, в которой все первичные мышцы тела погибают и полностью замещаются новыми взрослыми мышцами. Перед метамофрозом (stage 53), лишь небольшое количество мышечных волокон в дорсомедиальной части дорсальных мышц экспрессирует мышечные белки взрослого типа. Во время метаморфоза, область мышц взрослого типа постепенно расширяется с дорсальной на вентральную сторону с переденезадним градиентом и с увеличением мышечных волокон взрослого типа. В то же самое время, запрограммированная гибель мышечных клеток, является важной в дегенерирующем хвосте и для превращения личиночных мышц во взрослые. В хвосте обнаруживается гибель мышечных клеток только личиночного типа. Однако, в теле, обнаруживается и гибель мышц личиночного типа и новый миогенез взрослых скелетных мышц. Выявляется взаимосвязь между фагоцитозом макрофагами и запрограммированной гибелью мышечных клеток. Распределение и изменения количества макрофагов точно такое же как у мышечных апоптических тел (sarcolytes) во время метаморфоза. Область гибели мышечных клеток расширяется подобно волне от основания хвоста к переденей и задней сторонам. Рост, дифференцировка и запрограммиированная гибель индуцируются T3. Известно, что обработка T3 существенно усиливает транскрипцию проапоптического гена Bax в каудальных мышцах. Используя миобластные клетки из хвоста, которые отвечают на TH гибелью, были получены строгие доказательства того, что увеличение экспрессии апоптического гена CPP32/apopain/Yama связано с резорбцией хвоста личинок во время метаморфоза. Было установлено также, что очень немногие, реагирующие на TH гены, экспрессируются в мышцах личинок, тогда как большинство из них активируется в фибробластах, которые окружают мышцы и м. индуцировать гибель мышечных клеток в результате протеолиза внеклеточного матрикса. Эти результаты указывают на то, что как внутренние (т.e., экспрессия апоптических генов в мышечных клетках), так и внешние (т.e., протеолиз мышечного окружения) механизмы контролируют TH-зависимую гибель мышц у Xenopus. Установлено, что не одна программа клеточной гибели задействована в резорбции первичных мышечных волокон. Мышцы конечностей, которые не появляются вплоть до средины метаморфоза индуцируются с помощью TH и характеризуются классической схемой миогенеза, включая и слияние миобластов (Рис.3).
MUSCLE GENE EXPRESSION FROM PRIMARY TO SECONDARY MYOGENESIS
MUSCLE GENE EXPRESSION FROM PRIMARY TO SECONDARY MYOGENESIS
После инициации миогенной программы с помощью экспрессии XMyf-5 и XMyoD на ст. гаструлы, различные мышце-специфичные гены последовательно экспрессируются во время первичного миогенеза, включая членов семейств актинов, тропомиозинов и миозинов (Table ). MRFs индуцируют экспрессию многочисленных мышце-специфических генов. Вовлечение E-boxes в обеспечение активности MRF у Xenopus подтверждается их наличеи в мышце-специфических промоторах. Как показано на др. видах, строгие доказательства подтверждают мнение, что MRFs кооперируют с повсеместно распространенными bHLH белками, подобными E12 и E47, и MEF2 белками для активации экспрессии мышце-специфических генов у Xenopus. Во время развития миотомов XMRF4 мРНК обнаруживатеся только на ст. 18, указывая тем самым, что она не вовлечена ни в детерминацию, ни в раннюю дифференцироваку мышц (Табл.1). Экспрессия MRF4 перекрывается с формированием нейромышечных соединений, показано, что денервация мышц постоянно снижает уровни его транскриптов, подтверждаея тем самым, что экспрессия MRF4м.б. индуцирована иннервацией и, следовательно, м.б. вовлечена в обеспечение транскрипционного ответа на иннервацию. Хотя экспрессия myogenin всегда связана с дифференцировкой мышц у млекопитающих, миогенез у Xenopus обнаруживает особенность в том, что Xmyogenin не экспрессируется в первичных миотомах. Это наблюдение и то, что др."differentiation" MRF, MRF4, экспрессируется с опозданием, подтверждают гипотезу, что XMyf-5 и/или XMyoD м. выполнять роль Xmyogenin во время первичного миогенеза у Xenopus, исходя из того факта, что MRFs, по крайней мере до некоторой степени, обнаруживают функциональное перекрывание в миогенезе. То, что экспрессия XMyf-5 ограничена задней областью поздней нейрулы и участвует в формировании хвоста у поздних эмбрионов объясняет дифференцировку сомитов в направлении спереди-назад. Установлено, что interferon regulatory factor-подобный связывающий эдемент ограничивает экспрессию Xmyf-5 в задних сомитех во время миогенеза Xenopus проливает свет на то, как осуществляется негативный контроль экспрессии Xmyf-5.
2
-TM embКлонированы две кДНК, MHC E3 and MHC E19, которые представляют транскрипты тяжелой цепи миозина, экспрессируемые только у эмбрионов и личинокt (т.e., во время первичного миогенеза) и одну кДНК MHC A7, которая представлена транскриптами, экспрессирующимися только после метамофроза. В первичном миогенезе, в то время как MHC E3 обнаруживает классический переднезадний паттерн экспрессии, не выявляясь в менее дифференцированной задней миотомной области, мРНК MHC E19 mRNA неожиданно обнаруживает заднепередний паттерн экспрессии: на ст. 30, она обнаруживается только в мышечных клетках кончика хвоста (где MHC E3 не экспрессируется) и ее экспрессия распространяется кпереди в соседние миотомы в течение нескольких последующих часов развития. Это отражает раздельность индукции хвостовых структур во время эмбриогенеза.
Метаморфоз характеризуется многими переключениями в экспрессии мышечных генов. В частности, переход от личиночных к взрослым MHCs во время метаморфоза хорошо изучен у Xenopus и др. видов амфибий. Этот переход находится под контролем TH, скоррелирован в первую очередь со вторичным переходом мышечных волокон в мышцах тела. Так, личиночные и взрослые MHC экспрессируются в мышцах сначала миотомов и вторично в дорсальных мышечных волоканах, соотв. Воздействие T3 существенно подавляет экспрессию MHC E3 и достоверно усиливает транскрипцию MHC A7. Др. мышечные гены экспрессируются специфически первично или вторично в дорсальных мышцах тела (Табл.1), как это видно для трех разных TM транскриптов на Рис. 5. Личиночная TMα7 и взрослая
TMα2 изоформы генерируются посредством отдельных 3'концевых процессингов, указывая тем самым, что перееключение с личиночных на взрослые мзоформы регулируется на транскрипционном уровне посредством активации мультигенного семейства, а также дифференциального процессинга РНК.
Во время конструкции конечностей, ситуация совершенно другая, т.к. различные мышечные гены, последовательно экспрессируемые во время ремоделирования тела, еоэкспрессируются в мышцах формирующихся конечностей. Установлено, что накопление Xmyogenin мРНК ограничивается вторичным миогенезом, включая формирование новых мышц в разивающихся конечностях, также как и в дорсальных мышцах во время ремоделирования тела. Известно, что у млекопитающих myogenin необходим in vivo для слияния миобластов,
с этим согласуется и тот факт, что первичный миогенез у Xenopus, происходящий без слияния клеток, указывает на критическую роль Xmyogenin в программе терминальной дифференцировки, включая и слияние миобластов и активацию мышечных генов взрослого типа, подобных MHC или β-TM. Две отдельне кДНК связаны с Xmyogenin, XmyogU1 и XmyogU2. Они дифференциально экспрессируются во время миогенеза. Установлено, что Xmyogenin, но не др. миогенные регуляторные факторы, индуцируют экспрессию генов эмбрионально/личиночных изофром β-tropomyosin и миозиновой тяжелой цепи. Только XmyogU1 индуцирует экспрессиию гена взрослой быстрой изоформы тяжелой цепи миозина. Сравнение экспрессии генов различных MRFs и различных контрактильных белков четко показало, что миогенез у Xenopus характеризуется отдельными миогенными программами.
MUSCLE FIBER TYPES
MUSCLE FIBER TYPES
C помощью ATPase активности миозинов трудно идентифицировать все типы мышечных волокон у Xenopus. Терминология, используемая для высших позвоночных (т.e., типа IIB, IIA, IIX, и I волокна), также трудно приложима для мышц лягушек. Однако, комбинация АТФазной активности миозина, метаболическаой активности и force/velocity ведет к идентификации 5 типов волокон во взрослых скелетных мышцах, названных 1, 2, 3, 4, и 5. Тип 1 обладает наивысшей скоростью укоровения, а тип 5 наинизшей. Типа 5 волокна являются медленными тоническими волокнами (с очень низкой succinic dehydrogenase [SDH] активностью) и не м.б. сравнены с медленно (type I) сокращающимися волокнами млекопитающих. У Xenopus, по-видмому, отсутствуют волокна того типа, которые в физиологическом смысле были бы сравнимы с мышечными волокнами типа I млекопитающих. Возможно, то типы 1, 2, и 3 родственны типам волокон IIB, IIA/IIB,
или IIX и IIA амниот, соотв. Геномный Southern blots показывает, что как и у млекопитающих, у Xenopus примерно около десятка различных MHC генов. Однако, нелизя утверждать, что транскрипты MHC A7 экспрессируются волокнами быстрого типа.
Установлено, что Xmyogenin преимущественно накапливается в окидативных мышечных волокнах (волокна типа 2-4), обнаруживая профиль экспрессии, ождаемый для белка, который является частью поддержания фентипа этих клеток.
Во время развития мышц, первые мышечные волокна дифференцируются в миотомах. Эти инициальные мышечные трубки сходны в некотором отношении с эмбриональными быстрыми скелетными волокнами. Они становятся функциональными на ст. 24, вскоре после нейруляции, и являются единственным типом волокон в миотомных мышцах вплоть до ст. 37, перед метаморфозом, когда впервые м.б. обнаружены два типа волокон. Это волокна относительно большого диаметра, с низкой активностью SDH и с acid-labile АТФазной активностью миозина. Он назван "white" "fast," или "larval type II". Др. тип волокон тоньше в диаметре, с высокой активностью SDH и acid-stable АТФазной активностью миозина. Он назван "red", "slow," или "larval type I". Гибиридизация In situ показала, что MHC E3 экспрессируется преимущественно в личиночных типа II волокнах и что MHC E19 является основным транскриптом MHC в личиночных волокнах типа I. У личинок Xenopus, "slow" волокна располжены в периферическом слое вокруг сердцевины из"fast" мышечных волокон в каждом миотоме. Более того, личиночные волокна типа IIпревалирую.т кпереди и уменьшаются кзади, позводяя предоминировать личиночному типу I волокнам в хвостовых кончиках. Такой паттерн одинаков для всех личинок легушачих (anuran) и рыб, но отличается от паттерна во взрослых мышцах Xenopus, где типы волокон смешаны мозаично как и в мышцах млекопитающих.