EXPERIMENTAL EMBRYOLOGY AND NEURAL DEVELOPMENT
Экспериментальная эмбриологии и развитие нервной системы

CUTTING, PASTING AND PAINTING: EXPERIMENTAL EMBRYOLOGY AND NEURAL DEVELOPMENT Gary C. Schoenwolf Nature Reviews Neuroscience V.2. № 11. P. 763-771 (2001) Перевод И.Г. Лильп (lilp@mail.ru)
Кажется, что цель экспериментальной эмбриологии проста – манипулирование эмбрионами для изучения механизмов развития. Такие манипуляции включают разные вариации трех основных методов исследования – cutting, pasting и painting (удаление, вставки и окрашивание). Все три метода внесли неоценимый вклад в понимание ключевых принципов развития нервной системы. CRE/LOXP A site-specific recombination system derived from Escherichia coli bacteriophage P1. Two short DNA sequences (loxP sites) are engineered to flank the target DNA. Activation of the Cre-recombinase enzyme catalyses recombination between the loxP sites, leading to excision of the intervening sequence. DOMINANT NEGATIVE A mutant molecule capable of forming a heteromeric complex with the normal molecule, knocking out the activity of the entire complex ELECTROPORATION The transient generation of pores in a cell membrane by exposing the cell to a high field strength electrical pulse. FLOOR PLATE The ventral cells of the neural tube that lie in the midline. IONTOPHORESIS The introduction of a substance into a cell by ion transfer, using electrodes to apply an electrical potential to the membrane. ISTHMUS A narrow section of the neural tube, which separates the midbrain from the hindbrain. MORPHOLINO An antisense oligonucleotide that acts specifically to block the initiation of translation. NEURULATION A morphogenetic process during which the progenitors of the nervous system segregate from the ectoderm as a dorsal, hollow nerve cord. NOTOCHORD A rod-like structure of mesodermal origin that is found in vertebrate embryos. It participates in the differentiation of the ventral neural tube and in the specification of motor neurons. (Timeline) \| Key events in experimental embryology that led to the elucidation of the principles of neural development (Рис.1.) \| Prospective fate maps of gastrula stages of the four vertebrate models. (Рис.2.) \| Cutting, pasting and painting experiments in birds and mammals. (Рис.3.) \| The molecular equivalent of cutting, pasting and painting experiments. (Рис.4.) \| The organizer experiment. (Рис.5.) \| The molecular equivalent of the organizer experiment.	Ключевые принципы развития нервной системы стали известны благодаря методам экспериментальной эмбриологии, разработанным такими выдающимися исследователями как Wilhelm Roux, Hans Spemann, Ross Harrison, Frank Lillie и Viktor Hamburger, их научными «детьми», «внуками» и более дальними научными «родственниками» (См. схему TIMELINE). Казалось бы, что цель экспериментальной эмбриологии проста и ясна, однако эмбрион является крошечным, хрупким и удивительно сложным организмом, развитие которого может быть легко нарушено многими неспецифическими путями, которые потенциально могут изменить результаты экспериментов. Кроме того, эмбрион высокочувствителен к стрессу и компенсаторные механизмы, которые могут восстановить (заменить) целый зачаток (например, организатор или нервный гребень) быстро вступают в действие (evoke). Поэтому для работы с эмбрионами необходимо усовершенствование техники микроманипулирования, полное понимание соответствующей эмбриональной анатомии и нормального развития, а также «эмбрионального выращивания». В статье кратко обсуждается роль экспериментальной эмбриологии (и экспериментальных биологов) в открытии принципов развития нервной системы позвоночных. После описания сильных и слабых сторон моделей четырех видов позвоночных будет дана оценка роли методов cutting, pasting и painting (удаления, вставок и окрашивания), а также модификации этих методов, приведших к новым подходам, разъясняющим принципы развития нервной системы. Автор в дальнейшем будет трактовать понятия cutting, pasting и painting шире, чем удаление ткани (ablation), трансплантация и маркировка соответственно. Эти понятия будут также включать генную инактивацию, эктопическую сверхэкспрессию генов и экспрессию маркеров, таких, к примеру, как green fluorescent protein (GFP). В основном будет рассмотрен главный принцип развития, вытекающий из экспериментальной эмбриологии – развитие нервной системы требует иерархического индуктивного взаимодействия между соседними клетками. Открытие этого феномена сопоставимо с открытием организатора Шпемана – центра внутри эмбриона, ответственного за создание плана строения тела. Автору этого открытия Hans Spemann в 1935 г. была присуждена Нобелевская премия. The four vertebrate models В отличие от специалистов в области биологии развития, использующих в своих экспериментах широкий спектр видов животных и растений, экспериментальные эмбриологи при изучении развития нервной системы используют в работе в основном четыре модели позвоночных. Исторически сложилось так, что в области экспериментальной эмбриологии имелась тенденция идти от «более низких» моделей позвоночных (считали, что они более просты для манипуляций) к «более высоким» моделям. Конечная цель этих исследований заключалась в понимании нормального и аномального развития эмбриона человека и предупреждении врожденных пороков развития. Экспериментальная эмбриология начала развиваться в XIX в. с изучения амфибий, которых можно было свободно собирать в местных прудах. В начале XX в. репертуар экспериментальных организмов пополнился теплокровными животными и куриными эмбрионами. Последние, из-за своего сельскохозяйственного значения, легко доступны и недороги во всем мире. Примерно в это же время фаворитом в генетических исследованиях становится мышь. Однако экспериментальные эмбриологи довольно медленно приспосабливались к мышиному эмбриону как к модельной системе, главным образом, из-за того, что мышиный эмбрион развивается в матке и, следовательно, менее доступен для манипуляций, чем эмбрионы амфибий и птиц. Более того, их развитие «изнутри-кнаружи» («inside-out») с энтодермой снаружи и эктодермой внутри в противоположность амфибиям, птицам, полосатым данио (zebrafish) и большинству млекопитающих, было слишком запутанным. Поэтому за последние 150 лет методы cutting, pasting и painting, которые основательно разрабатывались для эмбрионов амфибий, были воспроизведены на куриных эмбрионах и лишь недавно их начали применять для эмбрионов мышей. Во второй половине ХХ в. экспериментальные эмбриологи признали преимущества полосатых данио как экспериментальных объектов – их прозрачность и легкость получения мутаций позволяли создавать огромное число мутантных эмбрионов для исследований. Методы экспериментальной эмбриологии в настоящее время адаптируются к эмбрионам полосатых данио, а исследования на мышах и данио фактически развиваются параллельно. Несмотря на прогресс в подборе модельных организмов, Xenopus и куриные эмбрионы остаются «рабочими лошадками» экспериментальных эмбриологов благодаря относительной легкости манипуляций с позвоночными этих классов. Каждая из этих четырех моделей позвоночных имеет свои преимущества и недостатки. И, если, начиная с ХХ в., экспериментальные эмбриологи использовали лягушек (особенно Rana) и саламандр (особенно Ambystoma), то в последние годы основным видом амфибий в исследованиях по эмбриогенезу стала шпорцевая лягушка Xenopus laevis. Эмбрионы амфибий имеют некоторые качества, делающие их удобным объектом для экспериментальной эмбриологии. Взрослых животных нетрудно содержать и разводить в лабораторных условиях, а их икринки можно получать в течение всего года и в больших количествах. Эмбрионы развиваются вне тела матери в простом солевом растворе (прудовой воде), они хорошо видны и с ними легко манипулировать в течение всего периода развития. Эмбрионы Xenopus laevis относительно крупные и содержат много желтка. Индивидуальные клетки могут быть помечены и составлены «карты судьбы» (fate maps) этих клеток (РИС.1). Более того, представляющие интерес гены, включая dominant-negative конструкции, могут быть свехэкспрессированы при инъецировании РНК в нужные клетки. В результате может быть получена пространственно таргетированная генная mis-expression (gene mis-expression). Эмбрионы Xenopus крайне восприимчивы к экспериментальным манипуляциям. Их клетки и ткани могут быть легко удалены или трансплантированы, а методы экспериментальной эмбриологии хорошо разработаны для этого организма (Hamburger, V. The Heritage of Experimental Embryology. Hans Spemann and the Organizer (Oxford Univ. Press, New York, 1988; Sive, H. L., Grainger, R. M. & Harland, R. M. Early Development of Xenopus laevis (Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 2000). Недавно появилась возможность (используя Xenopus tropicalis) создания трансгенных животных (Amaya, E. & Kroll, K. L. A method for generating transgenic frog embryos. Methods Mol. Biol. 97, 393-414.1999). Кроме того, X. tropicalis, в отличие от X. laevis имеет диплоидный геном и относительно короткий жизненный цикл, и в связи с этим является многообещающей системой для мутагенеза и forward-genetic screens, которая уже была разработана для полосатых данио. К недостаткам амфибий можно отнести затрудняющую наблюдения непрозрачность их яиц. Куриные эмбрионы, как и эмбрионы Xenopus, также доступны в течение всего года и в неограниченных количествах. Эмбрионы развиваются внутри скорлупы, которая может быть удалена для изучения развития in ovo или эмбрионы могут быть удалены из оболочки и прокультивированы. Однако, как и Xenopus, куриные эмбрионы непрозрачны (даже если удалено большинство желтка), а проведение стандартных генетических исследований затруднено. В то же время основным преимуществом куриного эмбриона перед Xenopus, является то, что рост его клеток и тканей сопровождается морфогенезом, как и у эмбриона человека. С куриным эмбрионом, так же как и с Xenopus, легко манипулировать, хотя небольшой размер их клеток не позволяет надежно проводить внутриклеточные инъекции. Однако и здесь были получены «карты судьбы» для многих стадий развития (РИС.1) либо с помощью внеклеточных инъекций прижизненных флуоресцентных красителей, либо при трансплантации перепелиных (quail) донорских клеток в куриный эмбрион-хозяин с последующим использованием естественных нуклеолярных перепелиных маркеров (или pan-перепелиных ядерных антител) для идентификации донорских клеток в полученных химерах. (Обсуждение этих методов, разработанных Nicole Le Douarin, и их применение в изучении клеток нервного гребня дано в работе: Le Douarin, N. M. & Kalcheim, C. The Neural Crest. Cambridge Univ. Press, Cambridge, 1999). Недавно для трансфицирования клеток стали использовать вирусные векторы и метод электропорации клеток в целый эмбрион. Мышиные эмбрионы как модельные системы имеют сходные с куриными эмбрионами преимущества и недостатки. Несмотря на то, что они развиваются внутри матки, в настоящее время разработаны прекрасные методы культивирования целого эмбриона. Как и у куриного эмбриона, рост мышиного эмбриона сопровождается морфогенезом, размеры его клеток небольшие и он непрозрачен. И хотя с ними труднее манипулировать, чем с куриными эмбрионами, они недешевы и их количество ограничено, методы cutting, pasting и painting все больше применяют к эмбрионам мышей при их развитии в культуре. Для них также составлены «карты судьбы» (РИС.1) либо с использованием метода ионофореза для мечения единичных клеток, либо с помощью внеклеточных инъекций прижизненных флуоресцентных красителей. Главным преимуществом эмбрионов мышей является множество накопившихся к настоящему времени молекулярно-генетических данных. Их гены могут быть сверхэкспрессированы при трансгенезе, «недоэкспрессированы» (нокаутированы, knocked out) с помощью гомологичной рекомбинации, а стандартный мутагенез становится рутинным методом при использовании CRE/LOXP рекомбинантной системы. Преимущество эмбрионов полосатых данио заключается, прежде всего, в их прозрачности, позволяющей легко прослеживать развитие. Кроме того, достаточно быстро можно получить большое число эмбрионов и стоимость их невысока. Их клетки могут быть удалены и ли трансплантированы в эктопические участки (ectopic sites), хотя технически осуществить это сложнее, чем у других моделей позвоночных (из-за внутреннего давления и небольшого размера клеток), См.The Zebrafish Book online. Их «карты судьбы» были получены с помощью инъекций единичных клеток (РИС.1), хотя клеточные «родословные» не совсем ясны на стадии ранней бластулы. Для изучения сверхэкспрессии генов в их единичные клетки может быть введена РНК, а MORPHOLINO антисмысловые нуклеотиды могут быть введены для нокдауна (knock down) генной экспрессии (Behringer, R. & Magnuson, T. (eds) Morpholino gene knockdowns. Genesis 30, 89-200. 2001). Как было сказано выше, основным преимуществом этой модели является возможность ее использования для скининга (forward-genetic screens) после химического мутагенеза. Было отобрано большое число мутаций, поражающих практически каждый этап развития. Выявление роли генов, участвующих в развитии и определяющих фенотип, затруднено тем, что геном полосатого данио (в отличие от X. tropicalis, кур и мышей) подвергался дополнительной дупликации во время эволюции. До начала «современной молекулярной эры» и понимания того, что механизмы развития высококонсервативны у самых разных организмов, было широко распространено мнение, что эмбрионы млекопитающих и «по умолчанию» эмбрионы мышей, являются лучшими моделями для изучения механизмов развития человека. Сейчас ясно, что для понимания развития человека можно использовать и другие, более доступные и экспериментально подходящие модели, включая беспозвоночных – таких как Drosophila melanogaster и Caenorhabditis elegans. Поэтому эмбриология и биология развития, начавшиеся с основанной на морфологии сравнительной эмбриологии, вернулись к сравнительному подходу, хотя молекулярные и механистические сравнения значительно потеснили морфологические исследования. Techniques of experimental embryology Экспериментальная эмбриология базируется на трех основных методах: cutting, pasting и painting (BOX 1). BOX 1. Tools of the trade Экспериментальные эмбриологи использовали для работы с мелкими и нежными эмбрионами самые необычные методы. Основным методом является хирургическая микроскопия (dissecting or stereo), обеспечивающая достаточное увеличение и глубину поля для рассмотрения и манипуляций с эмбрионом. Вторым методом, крайне важным для понимания внутреннего строения непрозрачных и сложных эмбрионов является гистологическая техника, т.е. использование микротома, который впервые был применен в эмбриологии Wilhelm His. Использование микротома позволяет готовить серийные срезы и детально исследовать строение эмбриона. Более экзотические методы, используемые экспериментальными эмбриологами, включают такие инструменты как петли из детских волос, волоски бровей, жженые волоски луковиц (burnt-out light bulb filaments), стеклянные и вольфрамовые иглы, заточенные швейные иглы (sharpened sewing needles), ортодонтические проволоки, кактусовые иголки, coverslip slivers, микрошпатели и микропипетки. Их дополняют пинцеты и такие замечательные инструменты как глазные скальпели. Из-за того, что эмбриологам часто приходится самим изготавливать мелкие инструменты, они должны быть умелыми мастерами и хорошими микрохирургами. И следует принять в качестве аксиомы, что микрохирургия дает хороший эффект только тогда, когда экспериментатор может придумать и изготовить, часто весьма остроумные, микроинструменты, соответствующие задачам его работы. В настоящее время, когда эмбриология соединилась с клеточной и молекулярной биологией, в экспериментальной эмбриологии используются методы клеточной и молекулярной биологии. Поэтому число и спектр инструментария экспериментального эмбриолога становится почти бесконечным. И хотя прошло почти 100 лет с первых попыток применения этих методов, эти три подхода и их молекулярные варианты используются и в настоящее время в области эмбриологии. На тканевом и клеточном уровнях cutting включает либо удаление (ablation) ткани, группы клеток или одиночных клеток для выяснения их значения для специфических моментов развития (РИС.2а) или изоляцию ткани и клеток для их дальнейшего тестирования. В последнем случае ткани или клетки могут содержаться in vitro в культуре эксплантата, часто в коллагеновых гелях для проверки состояния их детерминации в определенное время развития. Считают, что ткань или клетка детерминированы, т.е. имеют свою «судьбу» развития, если они могут реализовать эту «судьбу» при помещении в нейтральное окружение. Кроме того, помещенные в культуру изолированные ткани могут служить донорами клеток, которые затем могут быть перенесены в эмбрион-хозяин (host-эмбрион). Поэтому “pasting” включает трансплантацию ткани или клеток от донора в host –эмбрион (РИС.2b) и может быть проделан между эмбрионами, находящимися на одной и той же стадии развития (isochronic transplants) или на разных стадиях развития (heterochronic transplants). Более того, ткани или клетки могут быть трансплантированы от донора в идентичные участки хозяина (homotopic transplants) или могут быть трансплантированы в эктопические участки (heterotopic transplants). Клетки могут быть трансплантированы в host –эмбрионы по разным причинам. Например, предполагаемый тканевой индуктор может быть трансплантирован в интактную (naive) ткань host –эмбриона, которая по предположению должна быть компетентной, т.е. способной отвечать на индуктивный сигнал. Альтернативно, клетки могут быть трансплантированы в эктопический участок host –эмбриона для проверки их состояния (commitment) в определенное время развития. Считают, что ткани или клетки уже детерминированы к определенной «судьбе» в развитии, если они могут реализовать эту «судьбу» при помещении в среду, содержащую конфликтные индуктивные сигналы. При трансплантационных исследованиях донорские клетки обычно несут эндогенные маркеры, такие, например, как нуклеолярный маркер перепела (quail nucleolar marker), для того, чтобы отличить их от клеток хозяина. У клеток куриного эмбриона нет нуклеолярного маркера, поэтому клеточные ядра перепела можно легко идентифицировать у quail–chick трансплантационных химер. Кроме того, клетки могут быть помечены эндогенным маркером, таким как флуоресцентный краситель DiI. Поэтому “painting” включает мечение клеток для дальнейшего слежения за их передвижениями и их судьбы во время последующего развития. (РИС.2с). Молекулярные эквиваленты cutting, pasting и painting экспериментов включают сверхэкспрессию и «недоэкспрессию» меченых молекул – либо РНК (или комплементарные ДНК) или белки (РИС.3). Сниженная экспрессия (knocking down) или отсутствие экспрессии (knocking out) молекулы может рассматриваться как эквивалент “cutting”. Это приводит к утрате функции молекулы. Такая манипуляция может быть проделана у мышиного эмбриона при нокаутировании гена с применением таргетированной гомологической рекомбинации (targeted homologous recombination). У эмбрионов Xenopus и полосатого данио это может быть проделано с помощью микроинъецирования антисмысловых олигонуклеотидов или РНКi (double-stranded/interfering RNA) в индивидуальные клетки, а также методом электропорации антисмысловых олигонуклеотидов в группы клеток куриного эмбриона. Эквивалентом pasting является эктопическая экспрессия молекулы. Это может быть достигнуто при конструировании трансгенных мышей или мышей, содержащих ген, который уже был knocked in. Таким же образом это может быть проделано у эмбрионов Xenopus и полосатого данио с помощью микроинъецирования одиночных клеток с полномерными конструкциями (full-length constructs), а также у куриного эмбриона с помощью метода электропорации full-length constructs в группы клеток. У куриного эмбриона часто наблюдают сверхэкспрессию ростовых факторов при имплантации chromatography beads (хроматографических шариков), которые покрыты специфическим ростовым фактором или при трансплантации COS клеток, которые экспрессируют нужный ростовой фактор. Кроме того, у эмбрионов мышей и кур для сверхэкспрессии нужного гена могут быть использованы вирусы (обычно replication-competent retroviruses, такие как RCAS вирус). Молекулярным эквивалентом painting является связывание mis-экспрессированных молекул с маркерами. Например, белки могут быть помечены эпитопной меткой (epitope tag), которую можно выявить с помощью антител, или GFP может быть включен в вектор как часть сверхэкспрессированной конструкции. В отличие от этих подходов, в настоящее время разработан новый метод, основанный на использовании Cre/loxP эксцизии (вырезания) под контролем тканеспецифического промотора/энхансера (enhancer) для экспрессии репортерного гена в специфическом домене клеток и их потомков, что позволяет составить их молекулярную «карту судьбы». Principles of neural development Центральным принципом развития нервной системы позвоночных является то, что нервная система и связанные с ней структуры, такие как нос, уши, глаза, и (у некоторых организмов) боковая линия возникают благодаря серии индуктивных взаимодействий между соседними клетками. В замечательном обзоре Antoine Jacobson впервые были суммированы традиционные эмбриологические подходы, с помощью которых удалось выявить эти принципы (Jacobson, A. Inductive processes in embryonic development. Science 152, 25-34.1966). Использование методов cutting, pasting и painting позволило сформулировать несколько ключевых принципов развития нервной системы, сходных с общими принципами развития позвоночных. К примеру, с помощью painting (т.е. методов маркировки) были получены «карты судьбы», показавшие, что «гаструлирующие» эмбрионы разных классов позвоночных, независимо от структуры их яиц и количества желтка, имеют будущие органные зачатки, организованные примерно одинаковым способом вокруг их сайта интернализации (internalization) (бластопора или первичной полоски) (РИС.1). Кроме того, эти карты показали, что у всех классов позвоночных будущая нервная пластинка (neural plat) –рудиментарный орган центральной нервной системы взрослого организма и основной «вкладчик» в периферическую нервную систему (через нервный гребень, который формируется на латеральных краях) – появляется вблизи организатора (зародышевого щитка у рыб, дорсальной губы бластопора у амфибий и рептилий, гензеновского узелка у птиц и узелка млекопитающих). Детальные описания стадий развития имеются для всех модельных позвоночных животных: 1) для полосатых данио (zebrafish) См.The Zebrafish Book online; 2) для X. laevis см. Nieuwkoop, P. & Faber, J. Normal Table of Xenopus laevis 2nd edn (North-Holland, Amsterdam, 1967); 3) для куриного эмбриона см. Hamburger, V. & Hamilton, H. L. (1951) и Eyal-Giladi, H. & Kochav, S. (1976); 4) для мышей см. Downs, K. M. & Davies, T. Staging of gastrulating mouse embryos by morphological landmarks in the dissecting microscope. Development 118, 1255-1266.1993). Кроме того, существуют детальные атласы по эмбриональной анатомии: 1) для полосатых данио см. См.The Zebrafish Book online; 2) для для X. laevis см. Hausen, P. & Riebesell, M. The Early Development of Xenopus laevis. An Atlas of the Histology (Springer, Berlin, 1991); 3) для куриного эмбриона см. Bellairs, R. & Osmond, M. The Atlas of Chick Development (Academic, San Diego, 1998); 4) для мышей см. Kaufman, M. H. The Atlas of Mouse Development (Academic, New York, 1992). Использование методов cutting (удаления) показало, что организатор необходим и для формирования нервной системы, а применение методов pasting показало, что эктопические организаторы индуцируют развитие вторичных эмбрионов, содержащих дополнительные нервные системы, состоящие из нервной пластинки и нервного гребня, которые происходят из (т.е. индуцированы из) клеток хозяина. Варьируя стадиями развития, на которых трансплантируют ткани в host-эмбрион или эксплантируют в тканевую культуру, были установлены стадии, во время которых клетки способны реагировать на индуктивные сигналы (т.е. компетентность клеток), поскольку имеется определенное время нейральной детерминации и commitment. С помощью таких экспериментов был установлен важный принцип activation-transformation , означающий, что формирование нервной пластинки включает активацию (neuralization) эктодермы, за которой следует ее трансформация (regionalization). Использование методов painting показало, что эмбрионы всех классов позвоночных подвергаются сходным морфогенетическим движениям во время гаструляции и нейруляции, а использование методов cutting и pasting показало, что гаструляционные движения в значительной степени автономны по отношению к организатору и связанных с ним структур (Keller, R. Gastrulation: Movements, Patterns, and Molecules. Plenum, New York, 1991), тогда как для нейруляционных движений требуется взаимодействие между нервной пластинкой и прилегающими к ней зачатками (Colas, J.-F. & Schoenwolf, G. C. Towards a cellular and molecular understanding of neurulation. Dev. Dyn. 221, 117-145.2001). Дальнейшие исследования с применением этих методов экспериментальной эмбриологии, особенно в сочетании с молекулярными маркерам, показали, что разные уровни (участки) нервной трубки взаимодействуют с соседствующими с ними структурами для индукции сенсорных систем. Например, передний мозг взаимодействует с поверхностной эпидермальной эктодермой, чтобы индуцировать хрусталик, а задний мозг вместе с примыкающей мезодермой взаимодействуют с эпидермальной эктодермой, чтобы индуцировать внутреннее ухо. Эти исследования также показали, что мезодерма (и, вероятно, энтодерма) взаимодействуют с образующейся нервной трубкой, что ведет к её региональной спецификации в дорсовентральном и ростокаудальном направлениях. Они также показали, что взаимодействие происходит на будущей нейроэктодермальной и эпидермальной границе ранней нервной пластинки и бороздки (groove), что ведет к формированию нервных валиков (neural folds) и нервного гребня (neural crest). Кроме специфического клеточного взаимодействия, ведущего к паттернированию, экспериментальная эмбриология нужна для идентификации молекул, опосредующих такие взаимодействия. К примеру, к настоящее время лучше всего изучена роль Shh (sonic hedgehog; продуцируемый нотохордой и дном пластинки (floor plate) нервной трубки) в дорсовентральном паттернировании нервной трубки и Fgf8 (fibroblast growth factor 8; продуцируется isthmus) в организации границы между средним и задним мозгом (midbrain–hindbrain boundary). И, наконец, стоит указать, что по традиции экспериментальные эмбриологи сначала идентифицировали клеточные взаимодействия, используя методы удаления и трансплантации тканей, и только затем идентифицировали соответствующие молекулы по сверхэкспрессии избирательных кандидатных белков или посредством knockout или knock down генов. Однако иногда эта последовательность может быть обратной. Хорошим примером является случай, когда идентификация локализованной генной экспрессии в ограниченной области энтодермы мышиного эмбриона – а именно, в anterior visceral энтодерме – вела к удалению этой ткани и, в конечном счете, к идентификации ее критической роли в паттернировании переднего мозга (Beddington, R. S. P. & Robertson, E. J. Anterior patterning in mouse. Trends Genet. 14, 277-284 (1998). A summary of evidence for the existence of a head organizer in mice, which is unique and spatially separated from the trunk-tail/Spemann organizer (that is, the node). Experimental embryology and neural induction Методы экспериментальной эмбриологии внесли определенный вклад в разработку нескольких принципов развития нервной системы позвоночных. Из-за недостатка места автор описывает только самые важные эксперименты, приведшие к открытию нейральной индукции и последние модификации методов экспериментальной эмбриологии, которые используются для выявления молекулярных механизмов развития. В 1924 г. Ханс Шпеман (Hans Spemann) и его докторант Hilde Mangold показали, что трансплантация дорсальной губы бластопора на вентральную сторону гаструлы у амфибий ведет к образованию вторичной оси тела, состоящей из тканей донора и реципиента (РИС.4). Этот простой эксперимент выявил принципы нейральной индукции и взбудоражил несколько поколений экспериментальных эмбриологов, а впоследствии биохимиков и молекулярных биологов, которые стали изучать механизмы, лежащие в основе этого явления. До эры молекулярных исследований большинство работ было сфокусировано на выявлении спектра тканей и стадий развития, через посредство которых могла происходить нейральная индукция, а также сроков компетенции эктодермы для формирования нервной системы. Так как разные ткани, а в конечном счете разные химические вещества и белки (раньше их называли «аномальными индукторами», а в настоящее время эндогенно экспрессируемыми ростовыми факторами), были изучены в отношении их способности вызывать нейральную индукцию, то на эксперименально- аналитической основе сформировалось два подхода. Для определенной ткани или молекулы, которые рассматривали как потенциальные индукторы, важно было показать: во-первых, что её достаточно, чтобы вызвать образование незрелой, но компетентной ткани (часто эктодерму animal cap на стадии гаструлы у амфибий), формирующей нервную систему – обычно морфологически определяемую как утолщенную структуру, напоминающую раннюю нервную пластинку, или молекулярно определяемую по экспрессии маркеров ранней нервной пластинки, таких как Sox2 (sex-determining region Y (SRY) box 2). Во вторых, будущая нервная ткань должна была формировать нервную пластинку. Молекулярным эквивалентом cutting (демонстрирующим необходимость) и pasting (демонстрирующим достаточность) экспериментов, производимых эмбриологами, являются: во-первых нокаутирование (knock out) или снижение (knock down) экспрессии белков (например при использовании антисмысловых олигонуклеотидов) или блокирование их сигнализирования рецепторами (например, при использовании dominant-negative конструкций) для проверки достаточности специфических белков. Во-вторых, сверхэкспрессия полномерного белка вблизи компетентной ткани может показать необходимость специфического белка. Эксперименты на Xenopus с использованием dominant-negative конструкций показали, что в отсутствие функциональных сигналов индукции от организатора, будущая нервная пластинка образует эпидермис. Таким образом, механизм нейральной индукции должен подавлять образование эпидермиса, указывая на то, что по умолчанию эктодерма является нервной пластинкой, а не эпидермисом, как думали долгое время. Кроме того, молекулярные эквиваленты экспериментов Spemann и Mangold – т.е. сверхэкспрессия белков, секретируемых организатором (РИС.5) – показали, что подавление BMP (bone morphogenetic protein) и Wnt (wingless-type MMTV integration site) сигнализирования такими молекулами как chrodin, noggin и follistatin (секретируемые ингибиторы BMP сигнализирования) и Frzb (frizzled-related protein) и cereberus (оба секретируются Wnt антагонистами) лежит в основе нейральной индукции. Эти результаты были подтверждены и для других моделей позвоночных, имеющих некоторые преимущества – например, возможность нокаутировать гены у мышей или наличие большого числа мутаций, нарушающих нейральную индукцию у полосатых данио. Интересно то, что сходные молекулярные механизмы лежат в основе индукции нервной ситемы у беспозвоночных животных. Например, формирование нервного тяжа у Drosophila включает подавление Dpp (Decapentaplegic) сигнализирования секреторным белком Sog (Short gastrulation). Dpp является членом суперсемейства transforming growth factor-β (TGF-β), гомологом BMP 2/4. Гомологом Sog у позвоночных является chordin, одна из молекул, секретируемых организатором позвоночных, которая подавляет BMP сигнализирование, ведущее к нейральной индукции. Предполагали, что в процессе эволюции дорсовентральная ось эмбриона инвертировалась таким образом, что вентральная область Drosophila (которая формирует вентральный нервный тяж) стала эквивалентом дорсальной области Xenopus (которая формирует нервную пластинку) (De Robertis, E. M. & Sasai, Y. A common plan for dorsoventral patterning in Bilateria. Nature 380, 37-40. 1996). Однако кроме инверсии оси есть и другие объяснения присутствия гомологичных сигнализационных событий. Например, в древности такие события могли играть определенную роль в детерминации невральной и эпидермальной эктодермы, которая функционировала независимо от детерминации дорсовентральной оси. Conclusion Традиционные методы экспериментальной эмбриологии, используемые для идентификации тканей и клеток, участвующих в индуктивном сигнализировании, или эти же методы, но в сочетании с молекулярно-генетическими подходами для идентификации сигнальных молекул, их рецепторов и нижестоящих (downstream) эффекторов, были теми инструментами, с помощью которых открывались ключевые законы, управляющие развитием нервной системы. Использование этих методов в XXI в. позволит нам узнать гораздо больше о нервной системе и не только об ее онтогенезе, но и о филогенезе.

Ключевые принципы развития нервной системы стали известны благодаря методам экспериментальной эмбриологии, разработанным такими выдающимися исследователями как Wilhelm Roux, Hans Spemann, Ross Harrison, Frank Lillie и Viktor Hamburger, их научными «детьми», «внуками» и более дальними научными «родственниками» (См. схему TIMELINE). Казалось бы, что цель экспериментальной эмбриологии проста и ясна, однако эмбрион является крошечным, хрупким и удивительно сложным организмом, развитие которого может быть легко нарушено многими неспецифическими путями, которые потенциально могут изменить результаты экспериментов. Кроме того, эмбрион высокочувствителен к стрессу и компенсаторные механизмы, которые могут восстановить (заменить) целый зачаток (например, организатор или нервный гребень) быстро вступают в действие (evoke). Поэтому для работы с эмбрионами необходимо усовершенствование техники микроманипулирования, полное понимание соответствующей эмбриональной анатомии и нормального развития, а также «эмбрионального выращивания».

В статье кратко обсуждается роль экспериментальной эмбриологии (и экспериментальных биологов) в открытии принципов развития нервной системы позвоночных. После описания сильных и слабых сторон моделей четырех видов позвоночных будет дана оценка роли методов cutting, pasting и painting (удаления, вставок и окрашивания), а также модификации этих методов, приведших к новым подходам, разъясняющим принципы развития нервной системы. Автор в дальнейшем будет трактовать понятия cutting, pasting и painting шире, чем удаление ткани (ablation), трансплантация и маркировка соответственно. Эти понятия будут также включать генную инактивацию, эктопическую сверхэкспрессию генов и экспрессию маркеров, таких, к примеру, как green fluorescent protein (GFP). В основном будет рассмотрен главный принцип развития, вытекающий из экспериментальной эмбриологии – развитие нервной системы требует иерархического индуктивного взаимодействия между соседними клетками. Открытие этого феномена сопоставимо с открытием организатора Шпемана – центра внутри эмбриона, ответственного за создание плана строения тела. Автору этого открытия Hans Spemann в 1935 г. была присуждена Нобелевская премия.

The four vertebrate models

В отличие от специалистов в области биологии развития, использующих в своих экспериментах широкий спектр видов животных и растений, экспериментальные эмбриологи при изучении развития нервной системы используют в работе в основном четыре модели позвоночных. Исторически сложилось так, что в области экспериментальной эмбриологии имелась тенденция идти от «более низких» моделей позвоночных (считали, что они более просты для манипуляций) к «более высоким» моделям. Конечная цель этих исследований заключалась в понимании нормального и аномального развития эмбриона человека и предупреждении врожденных пороков развития. Экспериментальная эмбриология начала развиваться в XIX в. с изучения амфибий, которых можно было свободно собирать в местных прудах. В начале XX в. репертуар экспериментальных организмов пополнился теплокровными животными и куриными эмбрионами. Последние, из-за своего сельскохозяйственного значения, легко доступны и недороги во всем мире.

Примерно в это же время фаворитом в генетических исследованиях становится мышь. Однако экспериментальные эмбриологи довольно медленно приспосабливались к мышиному эмбриону как к модельной системе, главным образом, из-за того, что мышиный эмбрион развивается в матке и, следовательно, менее доступен для манипуляций, чем эмбрионы амфибий и птиц. Более того, их развитие «изнутри-кнаружи» («inside-out») с энтодермой снаружи и эктодермой внутри в противоположность амфибиям, птицам, полосатым данио (zebrafish) и большинству млекопитающих, было слишком запутанным. Поэтому за последние 150 лет методы cutting, pasting и painting, которые основательно разрабатывались для эмбрионов амфибий, были воспроизведены на куриных эмбрионах и лишь недавно их начали применять для эмбрионов мышей. Во второй половине ХХ в. экспериментальные эмбриологи признали преимущества полосатых данио как экспериментальных объектов – их прозрачность и легкость получения мутаций позволяли создавать огромное число мутантных эмбрионов для исследований. Методы экспериментальной эмбриологии в настоящее время адаптируются к эмбрионам полосатых данио, а исследования на мышах и данио фактически развиваются параллельно. Несмотря на прогресс в подборе модельных организмов, Xenopus и куриные эмбрионы остаются «рабочими лошадками» экспериментальных эмбриологов благодаря относительной легкости манипуляций с позвоночными этих классов.

Каждая из этих четырех моделей позвоночных имеет свои преимущества и недостатки. И, если, начиная с ХХ в., экспериментальные эмбриологи использовали лягушек (особенно Rana) и саламандр (особенно Ambystoma), то в последние годы основным видом амфибий в исследованиях по эмбриогенезу стала шпорцевая лягушка Xenopus laevis. Эмбрионы амфибий имеют некоторые качества, делающие их удобным объектом для экспериментальной эмбриологии. Взрослых животных нетрудно содержать и разводить в лабораторных условиях, а их икринки можно получать в течение всего года и в больших количествах. Эмбрионы развиваются вне тела матери в простом солевом растворе (прудовой воде), они хорошо видны и с ними легко манипулировать в течение всего периода развития. Эмбрионы Xenopus laevis относительно крупные и содержат много желтка. Индивидуальные клетки могут быть помечены и составлены «карты судьбы» (fate maps) этих клеток (РИС.1). Более того, представляющие интерес гены, включая dominant-negative конструкции, могут быть свехэкспрессированы при инъецировании РНК в нужные клетки. В результате может быть получена пространственно таргетированная генная mis-expression (gene mis-expression). Эмбрионы Xenopus крайне восприимчивы к экспериментальным манипуляциям. Их клетки и ткани могут быть легко удалены или трансплантированы, а методы экспериментальной эмбриологии хорошо разработаны для этого организма (Hamburger, V. The Heritage of Experimental Embryology. Hans Spemann and the Organizer (Oxford Univ. Press, New York, 1988; Sive, H. L., Grainger, R. M. & Harland, R. M. Early Development of Xenopus laevis (Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 2000).

Недавно появилась возможность (используя Xenopus tropicalis) создания трансгенных животных (Amaya, E. & Kroll, K. L. A method for generating transgenic frog embryos. Methods Mol. Biol. 97, 393-414.1999). Кроме того, X. tropicalis, в отличие от X. laevis имеет диплоидный геном и относительно короткий жизненный цикл, и в связи с этим является многообещающей системой для мутагенеза и forward-genetic screens, которая уже была разработана для полосатых данио.

К недостаткам амфибий можно отнести затрудняющую наблюдения непрозрачность их яиц.

Куриные эмбрионы, как и эмбрионы Xenopus, также доступны в течение всего года и в неограниченных количествах. Эмбрионы развиваются внутри скорлупы, которая может быть удалена для изучения развития in ovo или эмбрионы могут быть удалены из оболочки и прокультивированы. Однако, как и Xenopus, куриные эмбрионы непрозрачны (даже если удалено большинство желтка), а проведение стандартных генетических исследований затруднено. В то же время основным преимуществом куриного эмбриона перед Xenopus, является то, что рост его клеток и тканей сопровождается морфогенезом, как и у эмбриона человека. С куриным эмбрионом, так же как и с Xenopus, легко манипулировать, хотя небольшой размер их клеток не позволяет надежно проводить внутриклеточные инъекции. Однако и здесь были получены «карты судьбы» для многих стадий развития (РИС.1) либо с помощью внеклеточных инъекций прижизненных флуоресцентных красителей, либо при трансплантации перепелиных (quail) донорских клеток в куриный эмбрион-хозяин с последующим использованием естественных нуклеолярных перепелиных маркеров (или pan-перепелиных ядерных антител) для идентификации донорских клеток в полученных химерах. (Обсуждение этих методов, разработанных Nicole Le Douarin, и их применение в изучении клеток нервного гребня дано в работе: Le Douarin, N. M. & Kalcheim, C. The Neural Crest. Cambridge Univ. Press, Cambridge, 1999).

Недавно для трансфицирования клеток стали использовать вирусные векторы и метод электропорации клеток в целый эмбрион.

Мышиные эмбрионы как модельные системы имеют сходные с куриными эмбрионами преимущества и недостатки. Несмотря на то, что они развиваются внутри матки, в настоящее время разработаны прекрасные методы культивирования целого эмбриона. Как и у куриного эмбриона, рост мышиного эмбриона сопровождается морфогенезом, размеры его клеток небольшие и он непрозрачен. И хотя с ними труднее манипулировать, чем с куриными эмбрионами, они недешевы и их количество ограничено, методы cutting, pasting и painting все больше применяют к эмбрионам мышей при их развитии в культуре. Для них также составлены «карты судьбы» (РИС.1) либо с использованием метода ионофореза для мечения единичных клеток, либо с помощью внеклеточных инъекций прижизненных флуоресцентных красителей. Главным преимуществом эмбрионов мышей является множество накопившихся к настоящему времени молекулярно-генетических данных. Их гены могут быть сверхэкспрессированы при трансгенезе, «недоэкспрессированы» (нокаутированы, knocked out) с помощью гомологичной рекомбинации, а стандартный мутагенез становится рутинным методом при использовании CRE/LOXP рекомбинантной системы.

Преимущество эмбрионов полосатых данио заключается, прежде всего, в их прозрачности, позволяющей легко прослеживать развитие. Кроме того, достаточно быстро можно получить большое число эмбрионов и стоимость их невысока. Их клетки могут быть удалены и ли трансплантированы в эктопические участки (ectopic sites), хотя технически осуществить это сложнее, чем у других моделей позвоночных (из-за внутреннего давления и небольшого размера клеток), См.The Zebrafish Book online. Их «карты судьбы» были получены с помощью инъекций единичных клеток (РИС.1), хотя клеточные «родословные» не совсем ясны на стадии ранней бластулы. Для изучения сверхэкспрессии генов в их единичные клетки может быть введена РНК, а MORPHOLINO антисмысловые нуклеотиды могут быть введены для нокдауна (knock down) генной экспрессии (Behringer, R. & Magnuson, T. (eds) Morpholino gene knockdowns. Genesis 30, 89-200. 2001). Как было сказано выше, основным преимуществом этой модели является возможность ее использования для скининга (forward-genetic screens) после химического мутагенеза. Было отобрано большое число мутаций, поражающих практически каждый этап развития. Выявление роли генов, участвующих в развитии и определяющих фенотип, затруднено тем, что геном полосатого данио (в отличие от X. tropicalis, кур и мышей) подвергался дополнительной дупликации во время эволюции.

До начала «современной молекулярной эры» и понимания того, что механизмы развития высококонсервативны у самых разных организмов, было широко распространено мнение, что эмбрионы млекопитающих и «по умолчанию» эмбрионы мышей, являются лучшими моделями для изучения механизмов развития человека. Сейчас ясно, что для понимания развития человека можно использовать и другие, более доступные и экспериментально подходящие модели, включая беспозвоночных – таких как Drosophila melanogaster и Caenorhabditis elegans. Поэтому эмбриология и биология развития, начавшиеся с основанной на морфологии сравнительной эмбриологии, вернулись к сравнительному подходу, хотя молекулярные и механистические сравнения значительно потеснили морфологические исследования.

Techniques of experimental embryology

Экспериментальная эмбриология базируется на трех основных методах: cutting, pasting и painting (BOX 1).

BOX 1. Tools of the trade

Экспериментальные эмбриологи использовали для работы с мелкими и нежными эмбрионами самые необычные методы. Основным методом является хирургическая микроскопия (dissecting or stereo), обеспечивающая достаточное увеличение и глубину поля для рассмотрения и манипуляций с эмбрионом. Вторым методом, крайне важным для понимания внутреннего строения непрозрачных и сложных эмбрионов является гистологическая техника, т.е. использование микротома, который впервые был применен в эмбриологии Wilhelm His. Использование микротома позволяет готовить серийные срезы и детально исследовать строение эмбриона.

Более экзотические методы, используемые экспериментальными эмбриологами, включают такие инструменты как петли из детских волос, волоски бровей, жженые волоски луковиц (burnt-out light bulb filaments), стеклянные и вольфрамовые иглы, заточенные швейные иглы (sharpened sewing needles), ортодонтические проволоки, кактусовые иголки, coverslip slivers, микрошпатели и микропипетки. Их дополняют пинцеты и такие замечательные инструменты как глазные скальпели. Из-за того, что эмбриологам часто приходится самим изготавливать мелкие инструменты, они должны быть умелыми мастерами и хорошими микрохирургами. И следует принять в качестве аксиомы, что микрохирургия дает хороший эффект только тогда, когда экспериментатор может придумать и изготовить, часто весьма остроумные, микроинструменты, соответствующие задачам его работы. В настоящее время, когда эмбриология соединилась с клеточной и молекулярной биологией, в экспериментальной эмбриологии используются методы клеточной и молекулярной биологии. Поэтому число и спектр инструментария экспериментального эмбриолога становится почти бесконечным.

И хотя прошло почти 100 лет с первых попыток применения этих методов, эти три подхода и их молекулярные варианты используются и в настоящее время в области эмбриологии. На тканевом и клеточном уровнях cutting включает либо удаление (ablation) ткани, группы клеток или одиночных клеток для выяснения их значения для специфических моментов развития (РИС.2а) или изоляцию ткани и клеток для их дальнейшего тестирования. В последнем случае ткани или клетки могут содержаться in vitro в культуре эксплантата, часто в коллагеновых гелях для проверки состояния их детерминации в определенное время развития. Считают, что ткань или клетка детерминированы, т.е. имеют свою «судьбу» развития, если они могут реализовать эту «судьбу» при помещении в нейтральное окружение.

Кроме того, помещенные в культуру изолированные ткани могут служить донорами клеток, которые затем могут быть перенесены в эмбрион-хозяин (host-эмбрион). Поэтому “pasting” включает трансплантацию ткани или клеток от донора в host –эмбрион (РИС.2b) и может быть проделан между эмбрионами, находящимися на одной и той же стадии развития (isochronic transplants) или на разных стадиях развития (heterochronic transplants). Более того, ткани или клетки могут быть трансплантированы от донора в идентичные участки хозяина (homotopic transplants) или могут быть трансплантированы в эктопические участки (heterotopic transplants). Клетки могут быть трансплантированы в host –эмбрионы по разным причинам. Например, предполагаемый тканевой индуктор может быть трансплантирован в интактную (naive) ткань host –эмбриона, которая по предположению должна быть компетентной, т.е. способной отвечать на индуктивный сигнал. Альтернативно, клетки могут быть трансплантированы в эктопический участок host –эмбриона для проверки их состояния (commitment) в определенное время развития. Считают, что ткани или клетки уже детерминированы к определенной «судьбе» в развитии, если они могут реализовать эту «судьбу» при помещении в среду, содержащую конфликтные индуктивные сигналы.

При трансплантационных исследованиях донорские клетки обычно несут эндогенные маркеры, такие, например, как нуклеолярный маркер перепела (quail nucleolar marker), для того, чтобы отличить их от клеток хозяина. У клеток куриного эмбриона нет нуклеолярного маркера, поэтому клеточные ядра перепела можно легко идентифицировать у quail–chick трансплантационных химер. Кроме того, клетки могут быть помечены эндогенным маркером, таким как флуоресцентный краситель DiI. Поэтому “painting” включает мечение клеток для дальнейшего слежения за их передвижениями и их судьбы во время последующего развития. (РИС.2с).

Молекулярные эквиваленты cutting, pasting и painting экспериментов включают сверхэкспрессию и «недоэкспрессию» меченых молекул – либо РНК (или комплементарные ДНК) или белки (РИС.3). Сниженная экспрессия (knocking down) или отсутствие экспрессии (knocking out) молекулы может рассматриваться как эквивалент “cutting”. Это приводит к утрате функции молекулы. Такая манипуляция может быть проделана у мышиного эмбриона при нокаутировании гена с применением таргетированной гомологической рекомбинации (targeted homologous recombination). У эмбрионов Xenopus и полосатого данио это может быть проделано с помощью микроинъецирования антисмысловых олигонуклеотидов или РНКi (double-stranded/interfering RNA) в индивидуальные клетки, а также методом электропорации антисмысловых олигонуклеотидов в группы клеток куриного эмбриона.

Эквивалентом pasting является эктопическая экспрессия молекулы. Это может быть достигнуто при конструировании трансгенных мышей или мышей, содержащих ген, который уже был knocked in. Таким же образом это может быть проделано у эмбрионов Xenopus и полосатого данио с помощью микроинъецирования одиночных клеток с полномерными конструкциями (full-length constructs), а также у куриного эмбриона с помощью метода электропорации full-length constructs в группы клеток. У куриного эмбриона часто наблюдают сверхэкспрессию ростовых факторов при имплантации chromatography beads (хроматографических шариков), которые покрыты специфическим ростовым фактором или при трансплантации COS клеток, которые экспрессируют нужный ростовой фактор. Кроме того, у эмбрионов мышей и кур для сверхэкспрессии нужного гена могут быть использованы вирусы (обычно replication-competent retroviruses, такие как RCAS вирус).

Молекулярным эквивалентом painting является связывание mis-экспрессированных молекул с маркерами. Например, белки могут быть помечены эпитопной меткой (epitope tag), которую можно выявить с помощью антител, или GFP может быть включен в вектор как часть сверхэкспрессированной конструкции. В отличие от этих подходов, в настоящее время разработан новый метод, основанный на использовании Cre/loxP эксцизии (вырезания) под контролем тканеспецифического промотора/энхансера (enhancer) для экспрессии репортерного гена в специфическом домене клеток и их потомков, что позволяет составить их молекулярную «карту судьбы».

Principles of neural development

Центральным принципом развития нервной системы позвоночных является то, что нервная система и связанные с ней структуры, такие как нос, уши, глаза, и (у некоторых организмов) боковая линия возникают благодаря серии индуктивных взаимодействий между соседними клетками. В замечательном обзоре Antoine Jacobson впервые были суммированы традиционные эмбриологические подходы, с помощью которых удалось выявить эти принципы (Jacobson, A. Inductive processes in embryonic development. Science 152, 25-34.1966).

Использование методов cutting, pasting и painting позволило сформулировать несколько ключевых принципов развития нервной системы, сходных с общими принципами развития позвоночных. К примеру, с помощью painting (т.е. методов маркировки) были получены «карты судьбы», показавшие, что «гаструлирующие» эмбрионы разных классов позвоночных, независимо от структуры их яиц и количества желтка, имеют будущие органные зачатки, организованные примерно одинаковым способом вокруг их сайта интернализации (internalization) (бластопора или первичной полоски) (РИС.1). Кроме того, эти карты показали, что у всех классов позвоночных будущая нервная пластинка (neural plat) –рудиментарный орган центральной нервной системы взрослого организма и основной «вкладчик» в периферическую нервную систему (через нервный гребень, который формируется на латеральных краях) – появляется вблизи организатора (зародышевого щитка у рыб, дорсальной губы бластопора у амфибий и рептилий, гензеновского узелка у птиц и узелка млекопитающих). Детальные описания стадий развития имеются для всех модельных позвоночных животных:

1) для полосатых данио (zebrafish) См.The Zebrafish Book online;

2) для X. laevis см. Nieuwkoop, P. & Faber, J. Normal Table of Xenopus laevis 2nd edn (North-Holland, Amsterdam, 1967);

3) для куриного эмбриона см. Hamburger, V. & Hamilton, H. L. (1951) и Eyal-Giladi, H. & Kochav, S. (1976);

4) для мышей см. Downs, K. M. & Davies, T. Staging of gastrulating mouse embryos by morphological landmarks in the dissecting microscope. Development 118, 1255-1266.1993).

Кроме того, существуют детальные атласы по эмбриональной анатомии:

1) для полосатых данио см. См.The Zebrafish Book online;

2) для для X. laevis см. Hausen, P. & Riebesell, M. The Early Development of Xenopus laevis. An Atlas of the Histology (Springer, Berlin, 1991);

3) для куриного эмбриона см. Bellairs, R. & Osmond, M. The Atlas of Chick Development (Academic, San Diego, 1998);

4) для мышей см. Kaufman, M. H. The Atlas of Mouse Development (Academic, New York, 1992).

Использование методов cutting (удаления) показало, что организатор необходим и для формирования нервной системы, а применение методов pasting показало, что эктопические организаторы индуцируют развитие вторичных эмбрионов, содержащих дополнительные нервные системы, состоящие из нервной пластинки и нервного гребня, которые происходят из (т.е. индуцированы из) клеток хозяина. Варьируя стадиями развития, на которых трансплантируют ткани в host-эмбрион или эксплантируют в тканевую культуру, были установлены стадии, во время которых клетки способны реагировать на индуктивные сигналы (т.е. компетентность клеток), поскольку имеется определенное время нейральной детерминации и commitment. С помощью таких экспериментов был установлен важный принцип activation-transformation , означающий, что формирование нервной пластинки включает активацию (neuralization) эктодермы, за которой следует ее трансформация (regionalization). Использование методов painting показало, что эмбрионы всех классов позвоночных подвергаются сходным морфогенетическим движениям во время гаструляции и нейруляции, а использование методов cutting и pasting показало, что гаструляционные движения в значительной степени автономны по отношению к организатору и связанных с ним структур (Keller, R. Gastrulation: Movements, Patterns, and Molecules. Plenum, New York, 1991), тогда как для нейруляционных движений требуется взаимодействие между нервной пластинкой и прилегающими к ней зачатками (Colas, J.-F. & Schoenwolf, G. C. Towards a cellular and molecular understanding of neurulation. Dev. Dyn. 221, 117-145.2001).

Дальнейшие исследования с применением этих методов экспериментальной эмбриологии, особенно в сочетании с молекулярными маркерам, показали, что разные уровни (участки) нервной трубки взаимодействуют с соседствующими с ними структурами для индукции сенсорных систем. Например, передний мозг взаимодействует с поверхностной эпидермальной эктодермой, чтобы индуцировать хрусталик, а задний мозг вместе с примыкающей мезодермой взаимодействуют с эпидермальной эктодермой, чтобы индуцировать внутреннее ухо. Эти исследования также показали, что мезодерма (и, вероятно, энтодерма) взаимодействуют с образующейся нервной трубкой, что ведет к её региональной спецификации в дорсовентральном и ростокаудальном направлениях. Они также показали, что взаимодействие происходит на будущей нейроэктодермальной и эпидермальной границе ранней нервной пластинки и бороздки (groove), что ведет к формированию нервных валиков (neural folds) и нервного гребня (neural crest).

Кроме специфического клеточного взаимодействия, ведущего к паттернированию, экспериментальная эмбриология нужна для идентификации молекул, опосредующих такие взаимодействия. К примеру, к настоящее время лучше всего изучена роль Shh (sonic hedgehog; продуцируемый нотохордой и дном пластинки (floor plate) нервной трубки) в дорсовентральном паттернировании нервной трубки и Fgf8 (fibroblast growth factor 8; продуцируется isthmus) в организации границы между средним и задним мозгом (midbrain–hindbrain boundary). И, наконец, стоит указать, что по традиции экспериментальные эмбриологи сначала идентифицировали клеточные взаимодействия, используя методы удаления и трансплантации тканей, и только затем идентифицировали соответствующие молекулы по сверхэкспрессии избирательных кандидатных белков или посредством knockout или knock down генов. Однако иногда эта последовательность может быть обратной. Хорошим примером является случай, когда идентификация локализованной генной экспрессии в ограниченной области энтодермы мышиного эмбриона – а именно, в anterior visceral энтодерме – вела к удалению этой ткани и, в конечном счете, к идентификации ее критической роли в паттернировании переднего мозга (Beddington, R. S. P. & Robertson, E. J. Anterior patterning in mouse. Trends Genet. 14, 277-284 (1998). A summary of evidence for the existence of a head organizer in mice, which is unique and spatially separated from the trunk-tail/Spemann organizer (that is, the node).

Experimental embryology and neural induction

Методы экспериментальной эмбриологии внесли определенный вклад в разработку нескольких принципов развития нервной системы позвоночных. Из-за недостатка места автор описывает только самые важные эксперименты, приведшие к открытию нейральной индукции и последние модификации методов экспериментальной эмбриологии, которые используются для выявления молекулярных механизмов развития.

В 1924 г. Ханс Шпеман (Hans Spemann) и его докторант Hilde Mangold показали, что трансплантация дорсальной губы бластопора на вентральную сторону гаструлы у амфибий ведет к образованию вторичной оси тела, состоящей из тканей донора и реципиента (РИС.4). Этот простой эксперимент выявил принципы нейральной индукции и взбудоражил несколько поколений экспериментальных эмбриологов, а впоследствии биохимиков и молекулярных биологов, которые стали изучать механизмы, лежащие в основе этого явления. До эры молекулярных исследований большинство работ было сфокусировано на выявлении спектра тканей и стадий развития, через посредство которых могла происходить нейральная индукция, а также сроков компетенции эктодермы для формирования нервной системы. Так как разные ткани, а в конечном счете разные химические вещества и белки (раньше их называли «аномальными индукторами», а в настоящее время эндогенно экспрессируемыми ростовыми факторами), были изучены в отношении их способности вызывать нейральную индукцию, то на эксперименально- аналитической основе сформировалось два подхода. Для определенной ткани или молекулы, которые рассматривали как потенциальные индукторы, важно было показать: во-первых, что её достаточно, чтобы вызвать образование незрелой, но компетентной ткани (часто эктодерму animal cap на стадии гаструлы у амфибий), формирующей нервную систему – обычно морфологически определяемую как утолщенную структуру, напоминающую раннюю нервную пластинку, или молекулярно определяемую по экспрессии маркеров ранней нервной пластинки, таких как Sox2 (sex-determining region Y (SRY) box 2). Во вторых, будущая нервная ткань должна была формировать нервную пластинку.

Молекулярным эквивалентом cutting (демонстрирующим необходимость) и pasting (демонстрирующим достаточность) экспериментов, производимых эмбриологами, являются: во-первых нокаутирование (knock out) или снижение (knock down) экспрессии белков (например при использовании антисмысловых олигонуклеотидов) или блокирование их сигнализирования рецепторами (например, при использовании dominant-negative конструкций) для проверки достаточности специфических белков. Во-вторых, сверхэкспрессия полномерного белка вблизи компетентной ткани может показать необходимость специфического белка. Эксперименты на Xenopus с использованием dominant-negative конструкций показали, что в отсутствие функциональных сигналов индукции от организатора, будущая нервная пластинка образует эпидермис. Таким образом, механизм нейральной индукции должен подавлять образование эпидермиса, указывая на то, что по умолчанию эктодерма является нервной пластинкой, а не эпидермисом, как думали долгое время. Кроме того, молекулярные эквиваленты экспериментов Spemann и Mangold – т.е. сверхэкспрессия белков, секретируемых организатором (РИС.5) – показали, что подавление BMP (bone morphogenetic protein) и Wnt (wingless-type MMTV integration site) сигнализирования такими молекулами как chrodin, noggin и follistatin (секретируемые ингибиторы BMP сигнализирования) и Frzb (frizzled-related protein) и cereberus (оба секретируются Wnt антагонистами) лежит в основе нейральной индукции. Эти результаты были подтверждены и для других моделей позвоночных, имеющих некоторые преимущества – например, возможность нокаутировать гены у мышей или наличие большого числа мутаций, нарушающих нейральную индукцию у полосатых данио.

Интересно то, что сходные молекулярные механизмы лежат в основе индукции нервной ситемы у беспозвоночных животных. Например, формирование нервного тяжа у Drosophila включает подавление Dpp (Decapentaplegic) сигнализирования секреторным белком Sog (Short gastrulation). Dpp является членом суперсемейства transforming growth factor-β (TGF-β), гомологом BMP 2/4. Гомологом Sog у позвоночных является chordin, одна из молекул, секретируемых организатором позвоночных, которая подавляет BMP сигнализирование, ведущее к нейральной индукции. Предполагали, что в процессе эволюции дорсовентральная ось эмбриона инвертировалась таким образом, что вентральная область Drosophila (которая формирует вентральный нервный тяж) стала эквивалентом дорсальной области Xenopus (которая формирует нервную пластинку) (De Robertis, E. M. & Sasai, Y. A common plan for dorsoventral patterning in Bilateria. Nature 380, 37-40. 1996). Однако кроме инверсии оси есть и другие объяснения присутствия гомологичных сигнализационных событий. Например, в древности такие события могли играть определенную роль в детерминации невральной и эпидермальной эктодермы, которая функционировала независимо от детерминации дорсовентральной оси.

Conclusion

Традиционные методы экспериментальной эмбриологии, используемые для идентификации тканей и клеток, участвующих в индуктивном сигнализировании, или эти же методы, но в сочетании с молекулярно-генетическими подходами для идентификации сигнальных молекул, их рецепторов и нижестоящих (downstream) эффекторов, были теми инструментами, с помощью которых открывались ключевые законы, управляющие развитием нервной системы. Использование этих методов в XXI в. позволит нам узнать гораздо больше о нервной системе и не только об ее онтогенезе, но и о филогенезе.

CUTTING, PASTING AND PAINTING: EXPERIMENTAL EMBRYOLOGY AND NEURAL DEVELOPMENT Gary C. Schoenwolf Nature Reviews Neuroscience V.2. № 11. P. 763-771 (2001)

CUTTING, PASTING AND PAINTING: EXPERIMENTAL EMBRYOLOGY AND NEURAL DEVELOPMENT
Gary C. Schoenwolf
Nature Reviews Neuroscience V.2. № 11. P. 763-771 (2001)