Do cell-surface growth-factor receptors and their ligands accumulate in the nucleoplasm under physiological conditions? And, if so, how do they get there and what function do they serve in this location? Recent advances have provided tantalizing hints to the answers to these questions, and hold the key to identifying a new mode of signal transduction.
(Рис.1.) | Putative mechanisms by which the epidermal growth factor receptor
(EGFR) might move to the nucleus.
(Рис.2.) | Postulated functions of nuclear growth-factor receptors.
Boxes
Box 1 | Classical EGFR signalling pathways
The epidermal growth factor receptor (EGFR), the prototypal receptor with intrinsic tyrosine-kinase activity, initiates many signalling cascades from the plasma membrane.
Among the most strongly activated and best studied are those that
initiate cascades through Ras, phospholipase Cγ (PLC-γ)
and signal transducer and activator of transcription (STAT)
proteins.
EGFR autophosphorylates on ligand binding, which provides docking
sites for proteins with Src-homology-2 (SH2) domains and phosphotyrosine-binding domains.
The SHC (SH2-containing) and Grb2 (growth-factor-receptor-bound protein 2)
adaptor proteins attract the GTP-exchange factor Sos (son-of-sevenless), which activates Ras. This
activates other small GTPases (Cdc42, Rho and Rac), which control
the cytoskeleton. In addition, Ras initiates a kinase cascade that
activates the extracellular-signal-regulated kinases 1 and 2
(ERK1/2)/mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathway through Raf
and MAPK/ERK kinase (MEK). ERK acts either to activate the
intracellular-limited protease calpain II or to translocate to the
nucleus to function as a transcription factor.
PLC-γ binds to EGFR phosphotyrosines to
align itself for cross-phosphorylation and activation. Subsequent
hydrolysis of phosphoinositide bisphosphate by the activated,
tyrosine-phosphorylated PLC-γ releases the actin-binding
protein gelsolin, which severs actin filaments under the membrane,
and generates inositol trisphosphate (which releases intracellular
calcium stores) and diacylglycerol. These second messengers then
activate the classical protein kinase C isoforms. Calcium also
triggers a wide range of intracellular enzymes and processes.
STAT1, STAT3 and STAT5 are directly phosphorylated by EGFR.
They then rapidly translocate to the nucleus to affect
transcription. Many other pathways are initiated upon EGFR
activation, including the activation of phosphatidylinositol
3-kinase, which is probably triggered by the kinase-deficient ErbB3
or by EGFR directly when this receptor is overexpressed. There are
also pathways that lead to the Na+/H+
antiporter, to phospholipase D and to Src, among
others.
Наиболее изученными механизмами перадачи сигналов — является передача сигналов через рецепторы факторов роста, которыя обладают внутренне причущей тирозин-киназной активностью. Связывание лиганда запускает автофосфорилирование, которое затем активирует многие нижестоящие каскады. Эти пути включают и extracellular-signal-regulated kinase (ERK)–mitogen-activated protein kinase (MAPK) путь, и phospholipase Cγ–protein kinase C путь, и phosphatidylinositol 3-kinase путь, а также пути, которые регулируют малые GTPases, такие как Rho, Rac и (Box 1).
Хотя большинство изменений, обуславливаемых этими сигнальными каскадами, происходят в цитозоле, очевидно, что предача сигналов через рецепторы ростовых факторов в основном затрагивает ядерные события, такие как митогенез и изменения транскипции. Фактически, непосредственно отвечающие гены, такие как те, что кодируют транскрипционные факторы и Fos, были установлены благодаря тому, что они быстро транскрибируются после связывания ростовых факторов. Эти сигналы, как полагают, передаются чрез многоступенчатые каскады, такие как транслокация ERK в ядро. Сравнительно недавно выявлен новый способ, прототипом которого является взаимодействие epidermal growth factor (EGF) со своим рецептором (EGFR) непосредственно активирующее signal transducers and activators of transcription (STAT) белки. И вот мы имеем новый 'one-hop' механизм изменения транскрипции. Более того открыта новая возмножность третьего способа активации транскрипции, который нуждается в 'zero переносчиках' информации между плазматической мембраной и ядром — прямая транслокация в ядро рецепторов ростового фактора полной длины или его фрагментов.
Возможность прямой транслокации в ядро интегральных рецепторов пламатической мембраны известна уже более десятка лет, но принятие этой концепции сдерживалось. Во-первых, во многих клеточных системах такие рецепторы, которые транслоцируются в ядро, не были известны. Во-вторых, рецепторы, ограниченные плазматическими мембранами, по-видимому, чтобы передавать сигналы д. отвечать в полных доспехах. В-третьих, ключевой вопрос, как такие рецепторы м. перемещаться в ядро, оставался нерешенным.
Background
Накапливались доказательства, что рецепторы ростовых факторов на клеточной поверхности и их пептидные лиганды накапливаются в нуклеоплазме — в ядерном пространстве, не связанным с ядерной оболочкой — в определенных физиологических ситуациях. Данные, предшествовашие вычленению сигнальных каскадов (Box 1), предоставлили три линии доказательств, что каким-то образом ростовые факторы и их рецепторы м. непосредственно влиять на ядерные события. Во-первых, было обнаружено, что EGFR подвергаются упорядоченному, регулируемому протеолитическому расщеплению при активации, высвобождению способных к катализу фрагментов из цитозольных киназных доменов. Затем было установлено, что EGFR киназа обладает активностью topoisomerase, это указывало на то, что она м. регулировать гены посредством изменения их конформации.
Однако, затем было показано, что это обеспечивается белком, который очищается вместе EGFR.
Во-вторых, было установлено, что экзогенные факторы роста накапливаются в ядрах во время регенерации органов. Это впервые было продемнострировано для EGF, а затем для и кислого fibroblast growth factor (FGF). В-третьих, идея, что эти небольшие белки, лишенные ферментативной активности, м. запускать определенные события в ядре, подтвердилась с открытием в ядре EGFR почти полной длины. Неожиданно, оказалось, что это не просто EGFR, переместившиеся ретроградно из грубого endoplasmic reticulum (ER) в продолжающуюся ядерную мембрану: оказалось, что EGFR нахотяся в нуклеоплазме и не связаны с мембраной.
Возникали вопросы — как внутренне присущие мембранам белки транслоцирутся в нуклеоплазму и какова функция этих тирозин киназ в этом месте?
Mechanisms for nuclear translocation
В последних работах были предложены возможные механизмы для всех трех линий доказательств, упомянуьых выше. Самым простым объяснением, того как секретируемые ростовые факторы в большом количестве поступают в ядро, является то, что осуществляют это распознаваемые ими рецепторы. Тогда возникает вопрос, как рецепторы перемещаются из плазматической мембраны в ядро. Недавние исследования показали, что рецепторы находятся в нуклеоплазме, а не в ядерной оболочке.
Возможность, что рецепторы ростовых факторов м. 'сбегать' из липидного бислоя, была предсказана десяток лет тому назад с помощью polymerase-chain-reaction клонируемого сплайс-варианта члена семейства FGF receptor (FGFR) family member , секретируемого варианта, содержащего внеклеточный, связывающий лиганд, и цитозольный киназный домены. Это показало, что способные к катализу рецепторы ростовых факторов м. б. продуцированы в форме, не связанной с мембраной. Гипотеза, что такие варианты рецепторов м. б. интернализованы и транспортированы в ядро получила принципиальное подтверждение, когда сходным образом сконструированный вариант EGFR стал накапливаться в ядрах фибробластов. Интересно, что такое накопление нуждалось и в лиганде и в интегрировнных с мембраной EGFR полной длины (Рис. 1a). Итак, существует механизм выделения из липидных мембран внутренне присущих рецепторов, лишенных их трансмембранных последовательностей.
Проблемой оказалось обнаружение 'естественно возникающих' EGFR вариантов даже в ситуациях, когда многочисленные EGFR оказываются в ядре, напр., при регенерации печени и некоторых карциномах. Были предложены альтернативные механизмы, что или меняется гидрофобность membrane-spanning области, и это позволяет рецепторам растворяться в отсутствие липидного бислоя, или образуется комплекс с др. белками, который маскирует этот гидрофобный домен. Изменения гидрофобности обнаружены в случае инсулиновых рецепторов и href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/LocusLink/LocRpt.cgi?l=2064"
target=_new>ErbB2 (известного также как human EGF-receptor 2 или HER2) при определенных условиях. Однако, чтобы транслоцироваться в ядро ErbB2 д.б. дикого типа и не содержать точковых мутаций, снижающих гидрофобность трансмембранной области. Механизмы выхода из мембран м. напоминать те, что действуют во время удаления неправильно сложенных (misfolded) интегральных мембранных белков, или быть противоположными тем, что вставляют трансмембраныне белки.
Возможность образования комплексов связана с chaperone-подобными или др. акцессорными белками для маскировки гидрофобности membrane-spanning области, это делает возможным покидать мембрану и/или транспортировать рецепторы в ядро (Рис. 1b). Установлено, что FGFR1 достигают ядра с помощью такого механизма импорта в ядро, обеспечиваемого акцессорным белком. И связывание лиганда и стресс (возможно через высвобождение эндогенного лиганда и последующую аутокринную активацию) вызывают накопление FGFR1 в нуклеоплазме, как это показано с помощью конфокальной микроскопии и субклеточного фракционирования. Полной длины FGFR1 м.б. идентифицированы в ядерной фракции, для такой транслокации в ядро необходим классический белок транспорта в ядро — .
Возможны разные ситуации, если транслоцируются только активные фрагменты EGFR в ядро (Рис. 1c). На Drosophila melanogaster убедительно показано, что фрагменты рецепторов клеточной поверхности 'идут в ядро' после протеолитического расщепления. ErbB4, четвертый член семейства EGFR, подвергается регулируемому протеолизу причем отщепленная цитозольная половинка транспортируется в ядро. Это регулируемое событие происходит после связывания лиганда и после инициального протеолитического удалени я внеклеточного домена. Затем внутриклеточное расщепление обеспечивается γ-secretase, которая ответственна также за разрезание интегрального мембранного белка Notch у Drosophila. Фрагмент ErbB4, содержащий киназу, активен в GAL4 transcription assay, который выявляет транскрипционные активаторы.
Нет ответа на вопрос, как рецепторы достигают ядра. Возможно с помощью обычных механизмов, использующих акцессорные белки или nuclear-localization sequences (NLSs). Напр., в белке ~1,163 аминокислот (длина предполагаемого варианта EGFR, лишенного трансмембранного домена), нет жестко закрепленных NLSs с множественными потенциалами, как это продемонстрировано для .
Function of the 'nuclear' receptor
Мы только в начале выявления многочисленных молекулярных ролей рецепторов ростовых факторов (Рис. 2),а клеточные реакции на них неизвестны.
Molecular functions.
Недавние исследования выявили прямые контакты EGFR с хроматином и/или ДНК, поэтому предполагается, что таким образом EGFR м. регулировать транскрипцию (Рис.
2a). Установлено, что С-терминальный домен EGFR управляет транскрипцией с AT-богатых последовательностей in vitro, хотя вся цитоплазматическая область делает это очень слобо. Далее было установлено, что EGF м. управлять транскрипцией с этих экзогенно кодируемых AT-богатых последовательностей в клетках, которые избыточно экспрессируют EGFR. Кроме того, транспортируемая в ядро цитозольная половина ErbB4 содержит С-терминальный домен, который управляет транскрипцией с GAL4 репортера, хотя это и делается значительно слабее, чем у сходного домена EGFR (Рис. 2b). Интересно, что полные цитозольные домены и ErbB4 и EGFR, по-видимому, неактивны в этих transcription assays, тогда как С-терминальные хвосты активны. Эта дихотомия м. указывать на наличие контролирующего элемента или на то, что белки подвергаются дальнейшему процессингу. Получить доказательства трудно. Во-первых, необходимо показать in vivo взаимодействия и активацию транскрипции, а также необходимо устранять эти эффекты, блокируя транспортировку в ядро EGFR. Но прежде необходимо выявить молекулярные события, которые делеают возможным такой транспорт. Т.к. эта активация траскрипции происходит в дополнение к хорошо документированным изменениям транскрипции, которые происходят ниже большинства классических путей, инициируемых EGFR, то это чрезвычайно трудно. Все же имеющиеся данные показывают, что EGFR обладают потенциалом менять транскрипцию непосредственно.
Простейшей молекулярной функцией м.б. та, что тирозин-киназная активность ядерных рецепторов направляет к цели ядерные белки, тем самым влияет на транскрипцию (Рис. 2c). Форсированная транслокация в ядро FGFR1 вызывает повышенную экспрессию c-Jun (транскрипционного фактора, который часто активируется перед пролиферацией), но экспрессия драйвера клеточного цикла увеличивается только в присутствии лиганда, а действительная скорость пролиферации этих клеток не меняется. Как же экзогенный лиганд увеличивает транскрипцию, если рецепторы уже в ядре. Эта далекая от разрешения идея м.б. разрешена с использованием глобальных подходов протеомики, путем определения набора белков, которые фосфорилируются по тирозину в ядре, и выявленим прямых взаимодействий EGFR.
Помимо их роли как киназ в плазматической мембране выявлено их взаимодействие с ДНК, подтверждающее вторую роль EGFR как транскрипционного фактора, и классические методы демонстрируют, что эта функция м.б. существенной. Превичные последовательности и структура рецептора не м. помочь, т.к. помимо новых ex-vivo-выявленных AT-богатых последовательностей не выявлено очевидных мотивов и гомологий.
Интригующая возможность в том, что ядерные рецепторы ростовых факторов влияют на chromatin stress, подобно топоизомеразам (Рис. 2d). Эта идея впервые была высказана, т.к. фосфотирозиновые связи, формируемые рецепторами ростовых факторов, обладают некоторыми структурными аттрибутами временных добавок (adducts), образуемых топоизомеразами. Ранеее было показано, что EGFR не обладают топоизомеразной активностью, но это не устранило возможности ковалентного EGFR–ДНК взаимодействия. Локальные и региональные транскрипционные события, как известно, контролируются с помощью ДНК stress, так что скачок к регуляции транскрипции м.б. легко осуществим, если будет доказано такое взаимодействие.
Возможны и др. роли EGFR. Важно доказать, что многие метаболические и по поддержанию клеток функции осуществляются внутри ядерного компартмента, включая различные киназные каскады.
Cellular functions.
Обнаружение EGFR в ядрах карцином и при регенерации печени подтвержадет предположение об участии в митотических процессах, т.к. это сильно пролиферирующие ткани. Однако, это не является универсальной находкой для всех пролиферирующих клеток. Фактически хорошо известно, что факторы роста м. запускать митогенные программы в отсуствии их транслокации в ядро. Итак, необходимо выбирать между специальными свойствами подобных условий или тем. что рецепторы факторов роста м. способствовать клеточным реакциям иным, нежели просто пролиферации.
EGFR накапливается в ядрах между 4 и 16 ч после частичной гепатэктомии (удаление 2/3 печени) и достигает пика после ~12 ч. Столь позднее появление EGFR указывает на то, что он играет роль в инициации морфогенеза и что его появление м.б. даже истолковано как антипрлиферативный механизм. В такой модели эти рецепторы ростовых факторов м.б. рассматриваться как сигнальные митогены от плазматической мембраны через классические сигнальные каскады. Как часть этого процесса некоторые рецепторы м. перемещаться в ядро, где они м. выполнять функцию 'стоп' сигнала. Это м. происходить только, если обычные механизмы ослабления действия рецепторов были существенно превышены и/или собственно митогенные ко-стимулирующие сигналы — так что соотвествующие адгезией обеспечиваемые сигналы, которые снабжают клетки информацией об окружающей среде — отсутствуют. В ядре рецепторы ростовых факторов м. тогда останавливать дальнейший митогенез, действуя как финальный тормоз нерегулируемой клеточной пролиферации. При регенерации печени это м. оказаться успешным, т.к. клетки быстро подвергаются только двум раундам митогенеза. В опухолях, этот стоп-сигнал м. игнорироваться каким-то образом, как игнорируются и др. стоп-сигналы. Это очень спекулятивно, модель сможет быть проверена, когда будут установлены точные молекулярные механизмы, лежащие в основе транслокации в ядро.
В клеточных системах, ядерная транслокация EGFR осуществляется, по-вилдимому, довольно быстро, в течение от минут до часа. Более того, c-Jun индуцируется с помощью ядерных FGFR1, а клетки с NLS-нагруженными FGFR1 индуцируют cyclin D1 до наивысшего уровня. Эти данные указывают на то, что ядерные рецепторы являются пролиферативными. Однако, ни базовая, ни индуцированная пролиферация не увеличиваются, когда присутствуют ядерные рецепторы ростовых факторов, так что увеличение c-Jun и cyclin D1 м.б. epiphenomena.
Function of the 'nuclear' ligand
Имеющиеся данные строго подтверждают, что лиганды необходимы, но не получено прямых даказательств, что они обеспечивают и как. Если специфические внутриклеточные фрагменты расщеплены и затем транспортированы, то связываение лиганда вряд ли необходимо для чего-либо кроме как инициации процесса расщепления на плазматической мембране. Однако, т.к. множественные лиганды для этих рецепторов отличеются по своей способности сохранять связь с рецептором и переноситься, то вполне возможно, что разные лиганды обладают разными способностями запускать процесс переноса в ядро.
Обнаружене EGFR почти полной длины в ядре с его внеклеточным лиганд-связывающим доменом и со сходными связывающими свойствами такового домена у EGFR на клеточной поверхности открывает возможность, что эти рецепторы м.б. связаны и регулируемы своими распознаваемыми лигандами. ТОт факт, что лиганды также переносятся в ядро, подтверждает это и указывает на то, что комплекс, транлоцируемый в ядро, является активным. Определенно природа EGFR, с его множественными лигандами м. играть при этом важную роль. Напр., связывание лиганда, чтобы пережить acidification эндосом, EGF м.б. более предпочтительным по сравнению с transforming growth factor-α (TGF-α) и heparin-связывающими лигандами ( и ) благодаря своим специальным свойствам, если транслокационный комплекс использует протеогликаны. Предпочтительность EGF подтверждается тем, что EGF м.б. перекрестно связан (cross-linked) со своим рецептором во время регенерации печени. Предполагается, что TGFα управляет ядерной локализацией EGFR также как EGF, это указывает на то, что транспорт в ядро осуществляется не с помощью хорошо известного эндосомного эндоцитотического пути. Вместо этого, д. иметь место отдельный челночный механизм от поверхности клетки, согласующийся с очень быстрой скоростью перехода.
Возможно, что оперативными молекулами в ядре являются скорее лиганды, чем рецепторы. Insulin и FGF обнаруживаются в ядре в отсутствие распознаваемых ими рецепторов. Их присутствие объясняется высвобождением их из эндосом и последующим их случайным поступлением или случайным отлавливаением с помощью реформированной ядерной оболочки после митоза. Однако, наиболее разумным для этих факторов роста, накапливающихся в ядре — особенно в активном центре процессинга РНК (ядрышке) — является тирозин-киназная активность, обнаруживаемая здесь, это возраждает идею, что эти лиганды связаны со своими ядерными рецепторами (Рис. 2e). Если лиганд необходим для активации, то это м. объяснить, почему направляемые в ядро FGFR1 оказывают незначительный, если вообще оказывают, фентипический эффект.
Интригующая возможность роли лигандов открывается благодаря недавнему открытию matricrine передачи сигналов; т.е. передачи сигналов с помощью доменов белков внеклеточного матрикса благодаря прямому связыванию с классическими рецепторами факторов роста. Это исследование показало, что ультра-низкого сродсва, на вид очень загадочные лиганды для рецепторов ростовых факторов кодируются внутри интегральных компонентов матрикса. Привязанность и мультивалентность этих лигандов увеличивает их жадность точно также, как это обнаруживается для интегрин-связывающих доменов. Может ли их закрепление в матриксе или их предполагаемая fast off-rates в отношении их связывания предупреждать и непрерывную передачу сигналов и перенос внутрь специфических рецепторов. Эти лиганды м.б. ограничены реакциями своих рецепторов, так что они не м. индуцировать транслокацию в ядрои последующие клеточные реакции. Или напротив, если такие matrikines (т.к. эти загадочные домены известны) м. обеспечивать транслокацию скорее, чем участовать просто в инициации процессов на плазматической мембране.
Future directions
В дальнейшем необходимо выяснить механистические основы молекулярных и клеточных функций таких транслоцируемых рецепторов. Только это позволит говорить, что это не epiphenomenon. Эта задача осложняется возможностью множественных типов ядерных рецепторов (рецепторов полной длины, вариантов рецепторов и фрагментов рецепторов).
Остается надеяться, что функции этих ядерных рецепторов будут довольно неожиданными. Напр., м. оказаться, что транслокация в ядро скорее будет останавливать, чем запускать пролиферацию и что, по крайней мере рецепторы полной длины, будут нуждаться в отдельном определенном классе ядерных лигандов.
