Лицо у млекопитающих собирается in utero в результате серии сложных и взаимозависимых молекулярных, клдточных и тканевых процессов. Формирование орофациального комплекса чрезвычайно чувствительно к генетическим и средовым влияниям и это объясняет, почему расщепления губы и нёба являются столь распространёнными врожденными аномалиями у людей (1 на 700 живорожденных). мРНК выделяли из нёбных половинок эмбрионов мыши, ориентированных ещё вертикально (до подъёма, E13.5), или горизонтально (после подъёма E14.5 или после слияния (E15.5). Изменения в экспрессии генов на этих трёх стадиях анализировали с помощью GeneChipв микромассивов. Были выявлены изменения в активности генов loricrin, glutamate decarboxylase, gamma-amino butyric acid type A receptor beta3 subunit, frizzled, Wnt-5a, metallothionein, annexin VIII, LIM proteins, Sox 1, plakophilin 1, cathepsin K и creatine kinase. Выявлены изменения профилей этих белков в ходе развития нёба и обсуждается возможная роль индивидальных генов/белков в этом процессе. Выявлены предполагаемые гены, кандидаты на роль расщепления нёба.

Keratinization

RT-PCR для loricrin подтвердило данные микромасива, которые выявили 43-кратное увеличение экспрессии мРНК между стадией Е14.5 и Е15.5, мРНК для типа I и II keratin также увеличивалась вследствие слияния нёбных половин (+7.3 и +11.3, соотв.). Т.к. эпителий твёрдого нёба является orthokeratinized после окончания развития, то это объясняет усиление экспрессии loricrin. Это самое большое из всех наблюдаемых изменений. Loricrin является главным белком оболочки эпидермальных cornified клеток и его увеличение вместе с увеличением мРНК кератинов между Е14.5 и Е15.5 отражает кератинизацию орального эпителия нёба после слияния нёбных половин.

GABAergic inhibitory neurotransmission

Между Е13.5 и Е14.5 экспрессия мРНК GAD₆₇ и GABA_Aβ3 снижается (-5.5 и -2.2, соотв.), а между Е14.5 и 15.5 увеличивается (+4.3 и +3.0). Иммунохимия подтвердила эти изменения.

Существуют две изоформы GAD: 65 kDa форма обнаруживается в мембранах и нервных окончаниях, а изоформа в 67 кДа распредлелана более широко в клетках. Оба энзима синтезируют ингибирующий нейротрансмиттер GABA из глютамата. GABA_A наиболее распространённый из двух GABA рецепторов в ЦНС, известны 4 его субъединицы: α β, γ и δ. GABA_A рецепторы имеют сайты связывания для модуляторов из двух семейств benzodiazepines и barbiturates, которые усиливают GABA индуцируемые токи хлора. Benzodiazepines широко используются в качестве антиэпилептических и анти-anxiety(тревожные) лекарства и как мышечные реляксанты. Они соединяются с γ субъединицей рецептора GABA_A. Сходным образом барбитураты, которые также являются анти-конвульсионными леакрствами, соединяются с α и β субъединицами. Изменение GABA-обеспечиваемой передачи сигналов выявляется при эпилепсии, депрессии, подавленности и б-ни Паркинсона. Дефицит GABAergic ингибирования, как полагают, лежит в основе большинства форм эпилепсии. Дети от эпилептичных матерей имеют повышенный риск врожденных уродств (включая и расщелины нёба). Риск связывают преимущественно с тератогенными эффектами анти-эпилептических лекарств, еще одним фактором риска являтся сама эпилепсия. И увеличение (анти-эпилептические лекарства) и уменьшение (эпилепсия) GABAergic передачи м. нарушать нормальное развитие нёба. Трансгенные мыши с генетическими делециями или GAD₆₇ или GABA_Aβ3 нуллизиготы имеют нарушения GABAergic путей непосредственно внутри нёба или оказывают косвенное влияние из-за нарушний в ЦНС. Оба, GAD₆₇ или GABA_Aβ3, выявлены и в ненейральных тканях, включая печень, глаза и кости. Считается, что подъем нёба является результатом контракции нёбных мезенхимных клеток, находящихся под контролем различных нейротрансмиттеров. Серотонин и ацетилхолин стимулируют процесс реориентации нёбных половин, а GABA ингибирует его. Выявленые изменения GAD₆₇ и GABA_Aβ3 между Е13.5 и 14.5 подтверждены иммуногистохимически. Показано присутствие GAD в нёбных половинках на Е13.5 (висят вертикально), уровень которого уменьшается, когда нёбные отростки принимают горизонтальное положение над языком (Е14.5). Сходный паттерн экспрессии для нейротрансмиттера GABA и β3 субъединицы GABA_A рецептора, это подтверждает непосредственное участие GAD-GABA- GABA_A рецептор пути в фазе реориентации нёбных отростков. Увеличение GAD и GABA между Е14.5 и 15.5 несущественно, т.к. рецепторы GABA_Aβ3 больше не присутствуют в нёьных половинках.

Tissue patterning

Гомологи wingless (wnt) и frizzled (fz) семейств и у млекопитающих участвуют в спецификации тканей. Wnt-5а и его рецептор fz подавляются (-2.7 и -1.9, соотв.) Подавление Wnt-5а подтверждено и иммуногистохимически. С помощью Wnt-5а и Frizzled гомологов активируется calcium/calmodulin-dependent protein kinase II. Её роль в палатогенезе неясна, однако Wnt-5а обнаруживает строгую экспрессию в мезенхиме зубных papilla, а мутантные эмбрионы мыши имеют дефекты лица и органов, распространяющихся с тела. Barx-1 является гомеобоксным геном, который экспрессируется в развивающихся зачатках лица, включая и мезенхиму верхней челюсти. Barx-1 является мишенью для FGF-8, который в эктодерме ранних эмбрионов кур предопределяет максиллярно-мандибулярную область посредством эпителиальрно-мезенхимных взаимодействий и последующей активации гомеобоксных генов в локальной мезенхиме. Мы отметили усиление актиности Barx-1 перед контактом нёбных половин и последующее подавление экспрессии после слияния. Его роль в развитии нёба пока неизвестна.

Retinoic acid

Ретиноевая кислота строго ассоциирует с развитием расщелин нёба. Она является жизненнонеобходимым плейотопным гормональным сигналом во время морфогенеза позвоночных. Окисление ретинола в ретиналдегид м. обеспечиваться нескольмики алкоголь дегидрогеназами, а ретинальдегид м. м. эффективно окисляться в ретиноевую кислоту с помощью ретинальдегид дегидрогеназ. Данные по микромассивам не выявили изменений мРНК куештфдвурнву specific dehydrogenase между Е13.5 и 14.5, но отмечено 7-крантное снижение между Е14.5 и 15.5. Её экспрессия выявлялась в респираторном эпителии носовой полости, в разививающихся тканях зубов. Рольэтой группы энзимов в образовании нёба нуждается в дальнейших исследованиях.

Neural development

Zic3 принадежит к классу генов, отвечающих за нейральное развитие, Яшс гены играют важную роль в sjhvbhjdfybb паттерна тела у мышей. На ст. Е13.5 Яшс3 экспрессируется в периферической зоне мезенхимы конченстей и презумптивных мышц, затем его экспрессия снижается. В нёбных половинах между Е13.5 и 14.5 экспрессия мРНК Zic3 снижается, но иммуногистохзимически незначительные уровни Zic3 белка обнаруживаются на всех стадиях, это указывает на недостоверное его снижение. Его роль в формировании нёба неясна, но у нулевых Zic3 мышей имеется комплексное врожденное заболевание сердца, дефекты нервной трубки, нарушения латеральности, позвонков и ребер, но расщепления нёба не встречаются.

Транскрипты SOX1 впервые обнаруживаются в эктодерме нейральных складок на ст. головной складеи, а во время раннего сомитогенеза он экспрессируется в нейроэктодерме. Мезенхима из лицевого зачатка происходит из клеток нейрального гребня, который выделяется из нейроэктодермы. Пролиферация этой мезенхимы является важной частью формирования нёбных выростов. Выявлено 4-кратное снижение мРНК для Sox1 между Е13.5 и 14.5.

Белки, содержащие домены LIM играют важную роль в разнообразных фундаментальных процессах, включая организацию цитоскелета и развитие органов. Мы отметили, что мышечный LIM белок увеличивается в 4 раза между Е14.5 и 15.5 в нёбк мышей. Lhx-8 LIM гомеобоксный ген экспрессируется в мезенхиме нёбных структур в течение всего их развитияЮ а нуллизиготные мутанты по Lhx-8 имеют расщепления нёба.

Cell adhesion molecules and muscle filaments

Для того, чтобы клетки м. развить тракции относительно внеклеточного матрикса или др. клеток, необходимо образование приклеплений между внутриклеточными актиновыми филаментами и внеклеточным матроиксом, посредством трансмембранных линкерных белков. Vinculin и α-актинин являются белками прикрепления, необходимыми для актиновых филамент, чтобы развить тракционные силы в отношении ВКМ и др. клеток. Увеличение мРНК vinculin и α-актинина наблюдается между вертикальным и горизонтальным положением нёбных половин, т.е. они важны для их реориентации. Сходным образом мышечные предшественники и маркеры мышечной дифференцировки являются превалирующими признаками во время подъёма нёбных створок. Контракции скелетных мышечных волокон, предполагаются в качестве механзма реориентации нёбных створок. У мышей, дефицитных по скелетным мышцам, обнаруживается высокий показатель расщеплений нёба вместе с др. дефектами развития. Трудно определить, являются ли эти расщепления результатом мышечных потерь в нёбных половинах или языке. Мы нашли, что уровень мРНК актиновых филамент растёт в ходе развития нёба. Быстрое исчезновение МЕЕ, обнаруживаемое во время слияния нёбных половин, предваряется экспрессией α гладкомышечного актина в эпителии. Калмодулин также участвует в модуляции контракций гладких мышц и в усилении активности мРНК калмодулина (+9.1) между Е14.5 и 15.5. Калмдулин участвует в обеспечении активности ряда фундаментальных регулируемых кальцием внутриклеточных систем энзимов, включая фосфодиэстеразы, аденилат циклазы и различные киназы, все они регулируют или регулируются с помощью внутриклеточного цАМФ. Скоординировананый во времени и количественно синтез цАМФ, по-видимому, является критическим для нормального развития вторичного нёба у млекопитающих. Помимо этого creatine kinase (CK) тесно связана с энергетической системой гладких мышц и значительное усиление её экспрессии (+18.4) обнаруживется на ст. Е15.5. Plakophilin 1 является структурным компонентом десмосом его экспрессия увеличивается междв Е14.5 и 15.5. Плакофилин 1 играет роль как в кожной межклеточной адгезии, так и в морфогенезе эпидермиса. Мутации в гене plakophilin 1 вызывают эктодермальную дисплазию, врожденное нарушение, характеризующееся ломкостью кожи и гиподонтией. Несколько клинических синдромов характеризуется эктодермальной дисплазией, ассоциированой с расщеплением нёба и губ. ЕЕС синдром (ectodermal dyxplasia, ectrodactyly, CL/P); Rapp-Hodgkin синдром с эктодермальной дисплазией, CL/P и гипоплазией средины лица; и Hay-Wells или AEC синдром (ankyloblepharon, ectodermal defects, CL/P). Роль молекул клеточной адгезии и развитие мышечной ткани во время палатогенеза представляет особый интерес.

Bonr development

Jsteopontin является высоко фосфорилированнм сиалопротеином, который является важным компонентом минерализованного внеклточного матрикса костей и зубов. Его экспрессия увеличивается на ст. Е15.5 . Cathepsin K расщепляет костные белки, в мРНК его предшественника увеличивается на стю. Е14.5. Катепсин К ограничивается остеокластами во время развития плодов мыши и, по-видимому, присутствует в центрах оссификации верхней челюсти во время развития нёба. Эти изменения полностью согласуются с развивающейся остеогенной бластемой нёба.

Other gene changes

Annexin VIII является кальций-зависимым фосфолипид-связывающим белком с неизвестной физиологической функцией, хотя он м. играть роль как антикаогулянт. Интересно, что экспрессия мРНК его падает между Е13.5 и 14.5. Увеличение сосудистого давления выдвигается в качестве одного из механизмов подъёма нёбных половин. Плотное сосудистое сплетение видно со строны ротовой полости нёбных половин перед их реориентацией со значительными терминальными расширениями по самым медиальным краям поднимающитхся нёбных половин, это создаёт значительную силу для родъёма нёбных половин. Annexin VIII потенциально функционирует как антикаогулянт по время увеличения сосудистого давления в нёбных половинах. Metallothionein (MT) обнаруживает сходный паттерн экспрессии. Он является металл-связывающим белком и обладает антиоксидантной функцией у млекопитающих. МТ саособен предупредить образование свободных радикалов, а МТ нулевые мыши экспрессируют изменённые гены во время развития. Transketolase и vanin-3 усиливаются, тогда как contrapsin подавляется у неонатальных МТ нулевых мышей. Трехкратное увеличение материнского печеночного МТ м.б. индуцировано butyl benzyl phthalate у Wistar крыс. У возникающих в результате выводков наблюдается плохая оссификация скелета и высокая частота расщеплений нёба. МТ связывает цинк и кальций с высоким сродством, но его тератогенный эффект, как полагают, не зависим от метаболизма цинка. Maternally expressed gene (Meg1), по-видимоу, отвечает импринтированные эффекты задержки пренатального роста или ускорения роста, вызываемых материнской или отцовской дупликацией проксимальной части хромосомы 11 с реципрокной нехваткой. У людей удвоение 7р11.2-р13, включая Grb10, является ответственным за Silver-Russell synd. (SRS). Гомологом Grb10 у мышей является Meg1. Имеются достоверные отличия в черепнолицевых и зубных характеристиках у пациентов с SRS как по пренатальной, так и постнатальной задержке роста и др. дисморфологиям. Мы наблюдали 4-кратное увеличение мРНК Meg1 между Е13.5 и 14.5.

Мы нашли, что некоторые из кандидатов на роль генов, вызывающих расщепление, не флюктуируют во время изученных стадий развития нёба. Напр., такой кандидат TGF-β2 обнаруживается при изучении массива но не изменяется в ходе развития. Такие гены м. экспрессироваться постоянно на высоком уровне без флюктуаций. Так, среди 6800 изученных генов, некоторые из генов-кандидатов, не были выявлены в массиве. Следовательно, они м. следовать др. паттерну экспрессии.

Microarray analysis of murine palatogenesis: Temporal expression of genes during normal palate developmentN.L.Brown, l.Knott, E.Halligan, S.J.Yarram. J.P.Mansell, J.R.Sandy (Jonathan.Sandy@bristol.ac.uk)Dev.Growth and Differ. V. 45, No 2, p. 153-165, 2003

Microarray analysis of murine palatogenesis: Temporal expression of genes during normal palate development
N.L.Brown, l.Knott, E.Halligan, S.J.Yarram. J.P.Mansell, J.R.Sandy (Jonathan.Sandy@bristol.ac.uk)
Dev.Growth and Differ. V. 45, No 2, p. 153-165, 2003