Посещений:
14-3-3 PROTEINS IN THE NERVOUS SYSTEM
Белки 14-3-3 и нервная система

14-3-3 PROTEINS IN THE NERVOUS SYSTEM

Daniela Berg, Carsten Holzmann & Olaf Riess

Nature Reviews Neuroscience 4, № 9, P.752-762 (2003)

перевод И.Г. Лильп (lilp@mail.ru)
14-3-3 белки – сигнальные молекулы, избыточно экспрессирующиеся в мозге. Они также определяются в спинномозговой жидкости больных с некоторыми нейродегенеративными заболеваниями. И хотя функции этого семейства высококонсервативных белков до конца не изучены, последние данные указывают на их участие в большом числе клеточных процессов. Взаимодействуя с более чем 100 партнерами, 14-3-3 белки модулируют действие белков, вовлеченных в клеточный цикл и контроль транскрипции, сигнальную трансдукцию, внутриклеточные передвижения и регуляцию ионных каналов. При исследованиях таких взаимодействий было обнаружено участие 14-3-3 белков в процессах апоптоза и нейродегенерации.


(Рис.1.)  | Side view of a 14-3-3 dimer of the isotype.


(Рис.2.)  | Figure 2 | Phylogenetic tree of human 14-3-3 isoforms.


(Рис.3.)  | General role of 14-3-3 proteins in the mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathway.


(Рис.4.)  | Role of 14-3-3 proteins in apoptosis.


(Рис.5.)  | | Immunostaining of Lewy bodies in pigmented neurons of a patient with Parkinson's disease.


(Рис.6.)  | Involvement of 14-3-3 proteins in dopamine synthesis and neurodegeneration.

(Табл.1) Known isotypes of 14-3-3 and results of isotype-specific investigations

Box 1 | 14-3-3 in neurological disorders

14-3-3 proteins have been detected in the cerebrospinal fluid of patients with the following disorders:

Inflammatory

  • Meningoencephalitis7, 89, 90, 93, 145-149
  • Aseptic meningitis91
  • Central nervous system vasculitis91
  • Multiple sclerosis7, 148

    • Vascular

  • Stroke7, 79, 83, 89, 146, 147
  • Subarachnoid haemorrhage79, 146
  • Cerebral amyloid angiopathy149
  • Vascular dementia79, 83, 85

    • Other dementias

  • Frontotemporal dementia85
  • Dementia of unknown causes80, 83, 146, 150
  • Amyotrophic lateral sclerosis with dementia147

    • Malignomas

  • Brain tumours and metastases79, 83, 91, 146, 150
  • Paraneoplastic disorders146, 151
  • Central intravascular lymphoma83
  • Carcinomatous meningitis85

    • Metabolic

  • Anoxic encephalopathy85, 149
  • Hashimoto's encephalopathy83, 149, 152
  • Mitochondrial encephalomyopathy, lactic acidosis and stroke (MELAS)148

    • Others

  • Delirium in Down's syndrome83
  • Status epilepticus7, 91
  • Tuberous sclerosis83
  • Rett syndrome79
  • Transverse myelitis153
  • Neuropathy7, 80




    • Links

    DATABASES
    LocusLink: 14-3-3<β | 14-3-3γ | 14-3-3ε | 14-3-3η | 14-3-3ζ | 14-3-3σ | 14-3-3τ>/θ
    Genbank: XP_086931 | XP_170226 | XP_016044 | XP_070972 | XP_005100 | XP_018019 | XP_062204 | XP_018019 | XP_066597 | XP_066543
    14-3-3-белки – сигнальные молекулы, которые изначально были описаны как активаторы нейротрансмиттерного синтеза – взаимодействуют с различными протеин киназами, рецепторными белками, ферментами, структурными и цитоскелетными белками, белками, участвующими в клеточном цикле и контролирующими транскрипцию, а также с белками, участвующими в апоптозе (Yaffe, M. B. How do 14-3-3 proteins work? -- Gatekeeper phosphorylation and the molecular anvil hypothesis. FEBS Lett. 513, 53-57, 2002). Функции 14-3-3 белков в этих клеточных процессах до конца не ясны. Тем не менее, очевидно, что они не только регулируют активность ферментов, но и контролируют субклеточную локализацию белков, а также функционируют как адаптерные молекулы, стимулируя межбелковые взаимодействия (van Hemert, M. J., Steensma, H. Y. & van Heusden, G. P. 14-3-3 proteins: key regulators of cell division, signalling and apoptosis. Bioessays 23, 936-946, 2001).
    14-3-3 белки получили свое название еще в 1967 г при классификации белков мозга, основанной на их фракционном числе после диэтиламиноэтил (DEAE)-целлюлозной хроматографии и их положению после последующего крахмального гель-электрофореза. Этот класс белков был обнаружен у всех изученных к настоящему времени эукариот. У млекопитающих их известно 7 изотипов (β, γ, ε, η, ζ σ, τ/θ). Формы, первично обозначенные как α и δ являются фосфорилируемыми формами β и &dzeta; (Табл.1). Самая высокая концентрация этих белков найдена в ткани мозга – около 1% всех растворимых белков. Они содержатся в цитоплазме, плазменной мембране и клеточных органеллах. Кроме их возможной роли в нейрональных функциях, 14-3-3 белки в настоящее время привлекли внимание исследователей из-за своего возможного участия в патофизиологии некоторых неврологических заболеваний.

    Структура 14-3-3 белков


    Х-дифракция &dzeta; и τ изотипов (у млекопитающих) показала бокаловидную (cup-shaped) димерную структуру 14-3-3 белков, у которых каждый мономер содержит 9 α-спиралей, организованных антипараллельным способом, чтобы сформировать структуру в виде L-формы (Рис.1). Внутренняя часть этой структуры состоит из двух спиралей со множеством заряженных и полярных аминокислот (αC и αЕ) и из двух спиралей с гидрофобными аминокислотами (αG и αI) образуя высококонсервативное вогнутое амфипатическое углубление – участок взаимодействия 14-3-3 белков с фосфорилированными и нефосфорилированными лигандами.
    Белковая последовательность 14-3-3 белков состоит из 5 высококонсервативных блоков, разделенных менее консервативными областями. Блоки содержат остатки, которые важны для пептидного связывания и некоторое количество остатков, участвующих в димеризации. Карбоксильный (С) конец 14-3-3 белков имеет небольшую sequence conservation. Предполагали, что этот карбоксильный конец регулирует функции 14-3-3 белков или стабилизирует свободную структуру посредством взаимодействия с двумя внутренними углублениями 14-3-3 димера.
    Для связывания 14-3-3 белка важно следующее. Во-первых, многие из них содержат фосфосерин/треонин (phosphoserine/threonine) согласованные последовательности, которые распознаются всеми подтипами 14-3-3 белка. Однако не только это важно для связывания – другие части белка могут модулировать 14-3-3 связывание. Повышенное лигандное связывание было показано, например, при использовании «усеченного» мутанта (truncated mutant) 14-3-3ζ у которого С-терминальный конец был удален. Эта находка свидетельствует об ингибиторной роли С-терминальной петли в лигандном взаимодействии. Этот домен может, следовательно, предотвращать нежелательное взаимодействие с 14-3-3 белками. Отсюда ясно, что таргетированное белковое взаимодействие является не результатом различной специфики фосфопептидного связывания, а скорее возникает из варьирующих контактов на вариабельной поверхности 14-3-3 белков с наружной части участка связывания (outside the binding cleft). Высококонсервативная фосфопептидная структура состоит из минимальной последовательности, необходимой для связывания. Большинство 14-3-3 лигандов нуждается в фосфорилировании остатков серина или треонина в таргетированной последовательности, хотя есть и другие партнеры связывания с вариациями этих структур.
    Интересным примером связывания между 14-3-3 белками и другими молекулами является их связывание с серотонин N-ацетилтрансферазой. Этот фермент связывается в центральном канале (выемке)14-3-3&dzeta; димера, заполняя большую часть пространства центральной выемки (channel) в строго определенной связи. Такое связывание увеличивает активность и аффинность серотонин N-ацетилтрансферазы с ее субстратом и защищает от дефосфорилирования и/или протеолиза.
    Для димеризации необходимы амино(N)-терминальная спираль αA одного 14-3-3 мономера и спирали αС и αD другого мономера. Высокая вариабельность N-терминальной части белка может представлять собой механизм, ограничивающий число возможных гомо- и гетеродимеров. Несколько гидрофобных и полярных остатков в димерном соединении являются наиболее консервативными у 14-3-3 изотипов млекопитающих, давая возможность осуществлять гомо- и гетеродимеризацию между разными 14-3-3 изотипами. Показано, что димеризация является функциональным признаком 14-3-3 белков. Отсюда и возможность связывания двух разных участков одного и того же белка. В случае двух слабо взаимодействующих частей, результатом может быть более стабильное взаимодействие с партнером, тогда как при связывании двух высокоаффинных сайтов связывания специфическая белковая конформация может быть нестабильной. C другой стороны, димер может связать два идентичных или разных белка-мишеней и функционировать как адаптер, соединяя несовместимые лиганды вместе, чтобы модулировать активность каждого. И хотя точные функции димеризации поняты не окончательно, скорее всего, этот феномен является важным для функций белков этого семейства.

    Эволюционая история белков


    Кроме 7 известных изотипов 14-3-3 белков млекопитающих, имеются другие члены этого семейства. При изучении генома человека найдено, по крайней мере, 10 белков, высокогомологичных известным 14-3-3 белкам: XP_086931, XP_016044, XP_070972, XP_005100, XP_018019, XP_062204, XP_018019, XP_066597 и XP_066543. Большинство из них – это усеченные белки (по сравнению с известными изотипами), однако 3 из этих белков (XP_086931, XP_005100 и XP_018019) имеют полную длину. Маловероятно, что XP_086931 является псевдогеном, остальные, скорее всего, также являются функциональными генами, так как оба гена транскрибируются и состоят из полномерной открытой рамки чтения (неопубл. данные O.Riess).
    Недавние сравнительные исследования последовательности 14-3-3 у организмов разных таксономических групп показали, что у них имелся общий предок, давший начало разным η/ γ and β/&dzeta; /σ /θ предкам еще до появления позвоночных. Впоследствии появились отдельные η and γ изотипы и &dzeta; /β и θ/ σ изотипы соответственно. Показано, что ε изотип формировал свою собственную группу, независимо от других изоформ белка.
    На рис.2 показано филогенетическое древо известных 14-3-3 изоформ человека и три предполагаемых новых члена этого семейства. Их изучение дало возможность поместить 2 из них (ХР_005100 и ХР_018019) на &dzeta; ветвь древа. Третий изотип (ХР_086931) ближе к 14-3-3 ε белку. Как и ожидалось 14-3-3 ε значительно расходится с другими известными изотипами 14-3-3 человека, подтверждая свое особое эволюционное положение. Из-за относительного сходства 14-3-3 ε и ХР_086931 (идентичнсть составляет 61%), кажется вероятным, что развитие ХР_086931 было обусловлено ранними дупликационными событиями.

    Функции 14-3-3 белков


    14-3-3 белки играют решающую роль в многочисленных физиологических клеточных процессах – сигнализации, клеточном росте, делении, адгезии, дифференцировке, апоптозе и регуляции ионных каналов. Окончательные функции этих белков до конца не изучены, но основные очерчены. Они участвуют в регуляции ферментативной активности, контроле субклеточной локализации связывающихся с ними белков-партнеров, и стимулируют межбелковые взаимодействия. Взаимодействие этих белков в клеточных каскадах очень сложное, поскольку они могут действовать на разных уровнях. Пример такого сложного взаимодействия изображен на Рис.3, где показано участие 14-3-3 белков в митоген-активированном протеин-киназном (mitogen-activated protein kinase, MAPK) сигнальном каскаде.

    Внутриклеточная сигнализация, клеточное деление и дифференцировка


    Лучше всего изучена роль 14-3-3 белков в регуляции ферментативной активности, а именно в регуляции Raf1, серин/треонин киназы, имеющей важное значение для клеточного роста, дифференцировки и онкогенной трансформации. Показано, что 14-3-3 могут стимулировать быструю транзицию между неактивной и активной формой Raf1 и опосредовать связь Raf1 с другими белками, активизирующими Raf1 – такими как Bcr, protein kinase C (PKC) and kinase suppressor of ras (KSR). Raf1 фосфорилирует MAP-kinase kinase (MEK), которая в результате стимулирует MAPK и, в конечном счете, транскрипцию генов, участвующих в клеточном делении. Участие 14-3-3 в этом пути стало более ясным, после того как было установлено, что мутация N-терминального 14-3-3, связывающего сайт Raf1, делает неспособной активацию MEK пути от индукции клеточной трансформации и дифференцировки.
    Важность Raf1 пути для дифференцировки нейронов и нормального функционирования центральной нервной системы (ЦНС) была изучена в мозге мышей, хотя точный вклад основных ветвей этого сигнального каскада пока не выяснен. Предполагают, что в поврежденных двигательных нейронах активация Raf1 участвует в регенерации нервов.
    Rsk1 – другая серин/треонин киназа, регулируемая 14-3-3, – участвует в клеточном росте, пролиферации, дифференцировке и выживаемости, но ее роль в функционировании нервной системы пока не понята окончательно. Больше известно о важности активации PKC в невральных функциях. Персистирующая активация PKC необходима для синаптической пластичности, обучения и памяти. Недавно показано, что связь 14-3-3 &dzeta;. с различными подклассами PKC постоянно и автономно активирует эти киназы в мозге грызунов, увеличивая возможность того, что 14-3-3&dzeta;/PKC комплекс может играть определенную роль в синаптической трансмиссии и пластичности. Роль PKC γ в нейродегенерации была недавно установлена посредством косегрегации различных неконсервативных миссенс-мутаций в высококонсервативных остатках гена при доминантной не-эпизодической мозжечковой атаксии (dominant non-episodic cerebellar ataxia) (Chen, D.-H. et al. Missense mutations in the regulatory domain of PKCγ: a new mechanism for dominant nonepisodic cerebellar ataxia. Am. J. Hum. Genet. 72, 839-949. (2003).Однако пока не ясно, влияют ли эти мутации на взаимодействие PKC γ с 14-3-3 белками.

    Апоптоз


    То, что 14-3-3 белки влияют на субклеточную локализацию связывающихся с ними белков-партнеров и их способность стимулировать белковые взаимодействия, является крайне важным для апоптоза (Рис.4). Различные изотипы 14-3-3 белков секвестируют (изолируют) разные проапаптозные белки. Например, θ изотип связывает Bad и Bcl2-ассоциированный Х-белок (Bax), а &dzeta; изотип связывает апоптозную сигнал-регулирующую киназу 1 (apoptosis signal-regulating kinase 1 – Ask1) и Fkhrl1 (член семейства Forkhead transcription factors).
    Связывание Bad с сильными антиапоптозными Bcl-xL и Bcl2b инактвирует последние, что ведет к клеточной гибели. Однако, будучи фосфорилированным, Bad может образовывать комплекс с 14-3-3 белком в цитоплазме, предотвращая тем самым связь Bad с митохондриально локализованными Bcl-xL и Bcl2b и, таким образом, подавляя апоптоз. Сходным образом фосфорилированный Fkhrl1, связанный с 14-3-3 белками остается в цитоплазме. Однако при отсутствии сигналов выживаемости дефосфорилирование Fkhrl1 приводит к его диссоциации с 14-3-3 и перемещению в ядро клетки, что в результате ведет к активации апоптозных генов. Фосфорилированный yes-associated protein (Yap), связанный с 14-3-3, также остается в цитоплазме, и не попадает в ядро, где он функционирует как ко-активатор р73-опсредованного апоптоза. Таким же образом активности Ask1, способствующей клеточной гибели, препятствует ее связывание с 14-3-3 белками, независимо от Ask1 киназной активности. Однако взаимодействие Bax с 14-3-3 не зависит от фосфорилирования и негативно регулирует его проапоптозную активность. И, если 14-3-3 контролирует локализацию Bad, Fkhrl1 и Yap, то взаимодействие 14-3-3 и теломеразы реверсирует транскриптазу (Tert) – каталитическую единицу теломеразы, предотвращающую апоптоз, способствуя ее удержанию в ядре.
    14-3-3 могут также модулировать активность связывающихся с ними партнеров при апоптозе. Обнаружено лиганд-зависимое связывание Nade (p75 neurotrophin receptor (p75NTR)-associated cell death executor) с p75NTR. Показано, что взаимодействие Nade и p75NTR может «рекрутировать» 14-3-3 белки, приводя к индукции активации caspase-3 и клеточной гибели.
    И, наконец, роль 14-3-3 белков как адаптерных молекул была обнаружена при их связывании с А20, белком «цинковые пальцы» (zinc-finger), подавляющим апоптоз, индуцируемый фактором некроза опухолей. Было показано, что для взаимодействия А20 и Raf необходим 14-3-3. Кроме того, 14-3-3 влияет на субклеточную локализацию А20, удерживая его в цитоплазме.

    Функции ионных каналов и 14-3-3


    Последние исследования указывают на важную роль 14-3-3 белков в контроле функционирования и локализации ионных каналов. Так, P-тип H+ АТФазы, которая ассоциируется с АТФ гидролизом для протонного транспорта из клетки, регулируется 14-3-3 регуляторными белками [Bunney, T. D., van den Wijngaard, P. W. & de Boer, A. H. 14-3-3 protein regulation of proton pumps and ion channels. Plant Mol. Biol. 50, 1041-1051 (2002)].Исследования у растений показали, что 14-3-3 белки превращают неактивные outwardly-rectifying K+ cannals в voltage-activated состояние. В ооцитах Xenopus подтверждена их ингибирующая роль в модулировании Ca2+-activated Cl- channel. В пресинаптических нервных терминалях дрозофилы комплекс 14-3-3 с белком Slob, который связывается с подтипом Ca2+-dependent potassium channels, заметно меняет активность этих каналов. У крыс chloride intracellular channel protein (Clic4) мозга связывается непосредственно с 14-3-3 &dzeta; и dinamin I, влияя, возможно, на его роль в мембранном траффике.
    В тканях человека функциональную модификацию ионных каналов 14-3-3 белками наблюдали для ether-a-go-go related (HERG) канала, который регулирует мембранный потенциал и стабильность в сердце (Kagan A.,et al., 2002). В этом случае 14-3-3 модулировали киназную активность. Недавно описан другой способ действия 14-3-3 на ионные каналы в мозге. Rajan et al. (2002) представили доказательства о важной роли 14-3-3 белков в контроле мембранной локализации и функциональной экспрессии KCNK potassium channels. KCNK белки, также охарактеризованные как LEAK CHANNEL, интенсивно экспрессируются в ЦНС и регулируют уровень мембранных потоков (membrane currents), контролируя таким образом возбудимость. Подсемейство TASK (two-pore-domain, acid-sensitive K+ channel) белков ингибирует K+ потоки посредством внеклеточного окисления (extracellular acidification). Конечные 40 остатков TASK канала важны для взаимодействия с 14-3-3 белками. Эксперименты с TASK-1 мутантами показали, что только каналы со способностью к ассоциации с 14-3-3 белками были локализованы в клеточной мембране и могли индуцировать значительные внешние К+ потоки, в то время как большинство мутантного белка остается в цитоплазме. Эта находка свидетельствует, что взаимодействие 14-3-3 белков со специфическими TASK белками может регулировать сборку и/или траффик каналов к поверхностной мембране и таким образом регулировать возбудимость нейронов.

    14-3-3 при неврологических заболеваниях


    Большое число партнеров, связывающихся с 14-3-3 белками и их ключевая роль в различных физиологических процессах делают 14-3-3 интересной мишенью для исследования их роли в патологических процессах. 14-3-3 белки определяются в спинномозговой жидкости (СМЖ) при разных неврологических заболеваниях (см. Табл). Более того, оказалось, что 14-3-3 белки скапливаются в некоторых поврежденных областях мозга и образуют там белковые агрегаты. Важно установить, являются ли 14-3-3 белки в СМЖ и поврежденных участках мозге маркерами тканевой деструкции и участвуют ли они в патогенезе некоторых неврологических болезней.

    Дефекты миграции нейронов


    Важная роль 14-3-3 белков в развитии фоторецепторов нейронов была установлена в исследованиях на дрозофиле. Мутации некоторых генов 14-3-3 дрозофилы приводят к нарушениям дифференцировки нейронов и нарушениям синаптической пластичности. У человека найдено значительное снижение уровня 14-3-3 γ в коре мозга эмбрионов с синдромом Дауна, что указывает на возможное участие этих белков в дифференцировке нейронов, синаптической пластичности и сигнальных путях (Peyril, A.et al. Aberrant expression of signaling-related proteins 14-3-3γ and RACK1 in fetal Down syndrome brain (trisomy 21). Electrophoresis 23, 152-157. 2002). Показано, что важное значение для миграции нейронов имеют 14-3-ε. У некоторых больных с тяжелой формой лиссэнцефалии обнаружена крупная делеция 17р13.3 – хромосомного сегмента, содержащего 14-3-3 ε (Kato, M. Lissencephaly and the molecular basis of neuronal migration. Hum. Mol. Genet. 12, R89-R96. 2003).
    Зависимость тяжести лиссэнцефалии от 14-3-3 ε показана у мышей с отсутствием 14-3-3 ε белка. У них обнаружен дефект миграции нейронов, зависящий в значительной степени от дозы. Оказалось, что в этот процесс вовлечено два пути – Lis1/Nudel/dynein и Cdk5/p35. Nudel (Lis1 связываемый белок) вместе с Lis1 принимает участие в регуляции цитоплазматического dynein через фосфорилирование Cdk5/p35 (Toyooka, K. et al. 14-3-3ε is important for neuronal migration by binding to NUDEL: a molecular explanation for Miller-Dieker syndrome. Nature Genet. 34, 274-285. 2003).Все эти белки оказывают положительный эффект на моторные функции dynein и, следовательно, на миграцию нейронов. Связывание 14-3-3 ε с Cdk5/p35-фосфорилированным Nudel сохраняет Nudel фосфорилирование, защищая его, таким образом, от дефосфорилирования серин/треонин фосфатазой РР2А.

    Болезнь Крейцфельдта-Якоба


    Наиболее широко обсуждается роль 14-3-3 белков при болезни Крейцфельдта-Якоба (Creutzfeldt–Jakob disease –CJD). Клинически это заболевание характеризуется быстро прогрессирующим слабоумием и специфической комбинацией неврологических признаков. Точный диагноз может быть установлен только при гистопатологическом исследовании. В связи с этим ведутся поиски маркеров для лабораторной диагностики CJD. Потенциальными маркерами могут быть два обнаруженных в СМЖ белка –p130 и p131. Оказалось, что p130 соответствует одному (или более) изотипам 14-3-3, а в некоторых работах показано, что 14-3-3 белки могут быть маркерами для CJD (Brandel, J. P. A. Diagnosis of Creutzfeldt-Jakob disease: effect of clinical criteria on incidence estimates. Neurology 54, 1095-1099. 2000). Поскольку сообщалось о высокой степени чувствительности и специфичности для диагностики белков 14-3-3, то их присутствие в СМЖ в настоящее время считается стандартным диагностическим критерием для спорадической формы CJD [World Health Organization. Global surveillance, diagnosis and therapy of human transmissible spongiform encephalopathies: Report of a WHO consultation WHO/EMC/ZDI/98/9 (World Health Organization, Geneva, 1998)].
    Однако возникает два вопроса. Первый – насколько специфичными являются 14-3-3 белки в СМЖ больных CJD? И второй – может ли присутствие белков в СМЖ CJD больных дать больше информации о патогенезе этого заболевания? Однако в первом исследовании, при котором были найдены 14-3-3 белки в СМЖ у CJD больных сообщалось, что эти белки регистрируются и при других заболеваниях с обширной деструкцией мозга – таких как acute stroke с и без деменции, subarachnoidal haemorrhage (субарахноидальном кровоизлиянии) и Rett syndrome (синдроме Ретта). Это указывает, что присутствие 14-3-3 белков в СМЖ может быть обусловлено сильной деструкцией мозговой ткани и «подтеканием» нормальных клеточных белков подобных 14-3-3 в СМЖ. Другие исследования подтвердили эту гипотезу – т.е обнаружили присутствие этих 14-3-3 белков у больных с различными неврологическими расстройствами, сопровождающимися массивными деструкциями нервной ткани (Box 1). По мере исследований этот список, вероятно, будет увеличиваться. Принимая во внимание эти находки, 14-3-3 тест следует рассматривать лишь как маркер для деструкции ткани мозга. Поэтому при диагностике CJD повышенный уровень 14-3-3 белков может быть полезен только как дополнение к определенным клиническим признакам.
    Следует, однако, принимать во внимание, что 14-3-3 тест дает низкие или негативные значения при вариантных формах CJD (variant CJD). Лишь у небольшого числа больных с variant CJD выявлена положительная реакция на 14-3-3 по сравнению с пациентами со спорадической формой CJD. Кроме того, при других заболеваниях с быстро прогрессирующей деструкцией мозга (Rasmussen’s encephalitis, Schilder’s disease и diffuse Lewy body disorder (DLBD)) с подострым клиническим течением, 14-3-3 белки в СМЖ не определяются.
    Общее содержание 14-3-3 белков в СМЖ во время нейродегенерации находится в пределах ng ml-1 и этот уровень значительно выше в СМЖ больных с установленной или предполагаемой CJD. Отсюда и спекулятивные предположения о том, что 14-3-3 белки могут участвовать в патогенезе CJD. Интересно, что только β, γ, ε и η изотипы найдены в СМЖ этих больных. Уровень &dzeta; изотипа, ассоциирующегося с болезнью Альцгеймера, не повышен в СМЖ больных CJD. Возможно, что этот изотип белка, которого достаточно много в нормальных нейронах, не поступает в СМЖ при некоторых нейродегенеративных состояниях. Но этот изотип 14-3-3 белка определяется при иммунноокрашивании в амилоидных бляшках при спорадической и вариантной CJD, другие изотипы в этих отложениях не определялись. Эти находки свидетельствуют о том, что, либо в амилоидных бляшках при CJD присутствует только &dzeta; изоформа или о том, что эпитопы, распознаваемые антителами против других изотипов, недоступны для них в этих отложениях. 14-3-3 γ, ε и η были обнаружены в аппарате Гольджи. Предполагается, что они играют секреторную роль. Внутриклеточно γ, ε, η, β и &dzeta; изотипы найдены в мембранах синаптических визикул и есть предположение, что некоторые изотипы (γ, ε, η) могут локализоваться в месте синаптического слияния и связываться с синаптической мембраной. Интересно то, что нормальные клеточные прионовые белки локализуются в синаптической плазменной мембране. В соответствии с этими наблюдениями, а также учитывая тот факт, что 14-3-3 играют определенную роль в конформационной стабилизации других белков, специфические 14-3-3 изотипы вполне могут участвовать в аксонном транспорте прионовых белков и их доставке через секреторные пути к клеточной поверхности. Будущие исследования должны показать, вовлечены ли непосредственно специфические изотипы 14-3-3 белков (определяемые в СМЖ) в патогенез CJD или другие нейродегенеративные заболевания.

    Болезнь Альцгеймера


    Болезнь Альцгеймера (АБ) нейропатологически характеризуется присутствием кортикальных и периваскулярных амилоидных бляшек и нейрофибриллярных клубочках (neurofibrillary tangles – NFTs). NFTs состоят из спаренных спиральных филаментов с белком tau (белок, связывающийся с микротрубочками). В норме белки, ассоциированные с микротрубочками, регулируют сборку и диссоциацию микротрубочек. Tau – один из основных ассоциированных с микротрубочками белков в нейронах, связывающийся с микротрубочками и стабилизирующий их структуру. Единственный механизм, контролирующий структуру и функции микротрубочек – это фосфорилирование tau, снижающее его аффинность для микротрубочек. При АБ аномально фосфорилированный tau связывается со спаренными спиральными филаментами, нарушая нормальные функции, ассоциированные с микротрубочками. Предполагали, что такое фосфорилирование вызывает утрату функций tau, нестабильность микротрубочек, образование NTFs и, в конечном итоге, нейродегенерацию.
    У больных АБ повышены уровни 14-3-3 γ и ε в некоторых регионах мозга. Более того, Layfield et al. сообщили, что все случаи АБ, которые они исследовали иммуногистохимически, показали положительное окрашивание NTFs. Около трети гиппокампальных NTFs, визуализированные с помощью анти-tau, также определялись с антисывороткой к 14-3-3 белкам. Но окрашивания с анти-14-3-3 в амилоидных бляшках почти не наблюдали.
    14-3-3 белки участвуют в связывании и изменении конформации таргетированных белков. Детекция 14-3-3 белков в NTFs повышает возможность того, что tau может быть фосфрилирован киназами в присутствии 14-3-3 белков, делая tau чувствительными к фосфорилированию. Было показано, что 14-3-3 &dzeta; стимулируют фосфорилирование tau протеин киназой А и нейрональной Cdc2-подобной протеин киназой (neuronal Cdc2-like protein kinase – NCLK) in vitro. Более того, такое фосфорилирование блокировало взаимодействие tau с микротрубочками, что могло приводить к нестабильности последних. И совсем недавно был описан «комплекс tau-фосфорилирование». В мозге быка tau, GSK3β и 14-3-3&dzeta; являются интегральными частями этого комплекса. GSK3β является регуляторным ферментом, фосфорилирующим несколько субстратов, включая tau в нормальном мозге. 14-3-3 &dzeta; димеры связывают и соединяют tau и GSK3β, стимулируя GSK3β-катализированное tau фосфорилирование. Поскольку GSK3β в отсутствие 14-3-3 связывается с tau с низкой аффинностью , тем самым подтверждается важная роль 14-3-3 &dzeta; в гиперфосфорилировании tau. Тот факт, что 14-3-3 &dzeta; индуцирует олигомеризацию этих таргетированных белков, а также то, что белки, связанные с 14-3-3 &dzeta; относительно резистентны к фосфопротеиновым фосфатазам, может иметь отношение к патогенезу заболевания. Так, при АБ 14-3-3 &dzeta; может превращать фосфорилированный tau в состоянии дефосфорилирования посредством фосфотаз.
    Увеличение 14-3-3 белков в мозге больных АБ никак не влияет на их уровень в СМЖ. И хотя есть несколько исследований, в которых сообщалось о позитивных 14-3-3 тестах в СМЖ больных АБ, у большинства исследованных больных результаты были отрицательными. Только в одной работе сообщалось о присутствии 14-3-3 η в СМЖ у шести больных с АБ. Поэтому 14-3-3 белки не могут рассматриваться как диагностические маркеры для АБ. Будущие исследования должны быть нацелены на понимание точной роли 14-3-3 белков в фосфорилировании NTFs и их вклада в фосфорилирование и дефосфорилирование tau.

    Нейродегенеративные заболевания с тельцами Lewy


    Тельца Lewy являются отличительным патологическим признаком болезни Паркинсона (ПБ) и DLBD (diffuse Lewy body disorder). ПБ клинически характеризуется прогрессирующей ригидностью, брадикинезией, тремором и постуральной нестабильностью. Тельца Lewy найдены в стволе мозга (brainstem), особенно в черной субстанции (substantia nigra). Для DLBD характерна прогрессирующая деменция, паркинсонизм, флуктуирующие когнитивные нарушения, и нейролептическая гиперчувствительность. Lewy тельца в основном присутствуют в кортикальной и субкортикальной областях.
    Так же как и при АБ, иммуногистохимические исследования телец Lewy обнаружили интенсивное положительное окрашивание при ПБ и DLBD (Ubl, A. et al. 14-3-3 protein is a component of Lewy bodies in Parkinson's disease-mutation analysis and association studies of 14-3-3η. Brain Res. Mol. Brain Res. 108, 33-39. 2002). Недавно была обнаружена колокализация ε, γ, &dzeta; и θ изотипов с тельцами Lewy, в то же время окрашивания 14-3-3 β, η и σ изотипов не наблюдали. (Рис.5).
    Гибель дофаминергических нервных клеток, сопровождаемая снижением уровня дофамина в мозге, является основным признаком ПБ. Скорость синтеза дофамина ограничивается тирозин гидроксилазой – ферментом, который связывается с 14-3-3 белками. Связывание 14-3-3 белков с тирозин гидроксилазой необходимо для ее оптимальной активации посредством фосфорилирования. Более того, 14-3-3 белки ингибируют дефосфорилирование, приводя к пролонгированной стимуляции тирозин гидроксилазы. Роль 14-3-3 белков в регуляции биосинтеза катехоламина является изотип- специфичной как для 14-3-3 белков, так и для тирозин гидроксилазы.
    Недавно показано, что α-synuclein – один из главных компонентов телец Lewy – связывается с 14-3-3 белками. Кроме того, 14-3-3 белки имеют 40% гомологию с α-synuclein и ассоциируются с одними и теми же связывающимися партнерами. В норме α-synuclein снижает активность тирозин гидроксилазы (снижает синтез дофамина) путем связывания с дефосфорилированной тирозин гидроксилазой, в то время как связывание 14-3-3 белков с фосфорилированной тирозин гидроксилазой увеличивает образование дофамина. В случае снижения α-synuclein, обусловленного секвестрацией белка, 14-3-3 протеин-индуцированное образование дофамина могло бы «завалить» клетку цитозольным дофамином с последующим образованием quinones и reactive oxygen species (ROS) (Рис.6). Кроме того белки 14-3-3 вовлечены в апоптоз. Проапоптозный белок Bad подавляет антиапоптозные функции Bcl2 Bcl-xL в митохондриях. Связывание 14-3-3 белков с Bad в цитоплазме может подавлять этот процесс. Однако комплекс 14-3-3 белков с α-synuclein снижает антиапоптозную активность путем увеличения уровней свободного Bad или других проапоптозных связывающихся партнеров, таких как, например, Fkhrl1 (Welch K. et al. 2002). Показано селективное увеличение 14-3-3/ α-synuclein комплекса в черной субстанции мозга у больных с ПБ, что делает клетки более чувствительными к апоптозу (Рис.6). Изоляция 14-3-3 белков α-synuclein-ом может играть решающую роль в патогенезе ПБ и, следовательно, указывать на участие этой молекулы в патогенезе заболевания. Доказательством того, что α-synuclein вовлечен в патофизиологию ПБ является идентификация двух миссенс мутаций в семьях с аутосомно-доминантной формой заболевания и исследованиями спорадических форм ПБ.

    Полиглутаминовые болезни


    Показано прямое участие 14-3-3 белков в нейродегенеративной спиномозжечковой атаксии типа 1 (spinocerebellar ataxia type 1–SCA1), вызванной экспансией polyglutamine stretches. Для этого и других полиглутаминовых болезней ядерные агрегаты в пораженных участках мозга являются отличительным патологическим признаком. В случае SCA1 ataxin-1 стабилизируется 14-3-3 белками (Chen H. et al., Cell, 113, 457-468. 2003) Важно то, что чем больше экспансия, тем выше аффинность 14-3-3 белков, хотя это не ведет к секвестрации в ядерных включениях. Вероятно, что ataxin-1 и 14-3-3 белки формируют главным образом растворимые комплексы in vivo. Связывание 14-3-3 белков с ataxin-1 требует ataxin-1 фосфорилирования, которое опосредуется phosphotidylinositol 3-kinase (PI3K)/Akt pathway. У дрозофил, экспрессирующих мутантный ataxin-1, активация PI3K/Akt способствует ataxin-1-индуцированной клеточной гибели.
    Кроме того, транскрипционные факторы, такие как CREB-binding protein (CBP), TATA-binding protein (TAB) and TAB-associated factor II-130 (TAFII130) также присутствуют в ядерных агрегатах, указывая на то, что транскрипция может меняться в нейронах, экспрессирующих экспансированные polyglutamine tracts. Известно, что некоторые из этих молекул имеют гистоновую ацетилтрансферазную активность, активность, которая полностью меняется благодаря гистоновым деацетилазам (histone deacetylases). 14-3-3 белки связываются с histone deacetylases, изолируя их в цитоплазме. Поэтому утрата 14-3-3 связывания дает возможность histone deacetylases быть транспортированной в ядро и репрессировать генную транскрипцию. Подавление диацетилазной активности или добавление транскрипционных факторов в культуру клеток (моделей полиглутаминовых болезней) значительно улучшает жизнеспособность клеток. Более того, подавление histone deacetylases частично блокирует гибель нейронов у мутантных дрозофил – моделей полиглутаминовых болезней. Имеются также доказательства, полученные при исследовании клеток человека, что histone deacetylases ингибиторы, такие как вальпроат (valproate) могут быть эффективны при лечении полиглутаминовых заболеваний.

    Боковой амиотрофический склероз и нарушения моторных нейронов (Amyotrophic lateral sclerosis and motor neuron injury)


    Дегенерация и регенерация после повреждения моторных нейронов еще не понята окончательно. Однако оказалось, что мультифункциональное семейство 14-3-3 белков участвует в этом процессе. После повреждения подъязычного нерва (hypoglossal nerve) у крыс в моторных нейронах показано повышение регуляции mRNAs (upregulation of the mRNAs) 14-3-3&dzeta; и θ. Как говорилось ранее, одной из функций 14-3-3 белков является регуляция Raf1. Стимулирование генов, участвующих в клеточном делении через активацию Raf1 или блокирование апоптоза может быть результатом 14-3-3 upregulation. Таким образом стимулируется регенерация.
    Эти находки у экспериментально-биологических моделей привели к исследованиям 14-3-3 mРНК при боковом амиотрофическом склерозе (amyotrophic lateral sclerosis – ALS), смертельном заболевании, характеризующимся прогрессивной селективной гибелью верхних и нижних моторных нейронов. Постоянная upregulation 14-3-3 изоформ была обнаружена в спинном мозге больных с ALS. Наиболее высокий уровень наблюдали в случаях с преобладанием участия нижних моторных нейронов. На их роль в дегенерации и регенерации указывает роль 14-3-3 белков в поддержании целостности нейронов.

    Заключение



    Наличие 14-3-3 белков у всех исследованных к настоящему времени эукариот и их участие во многих клеточных процессах побудили исследователей вести работы в двух направлениях. Первое – выявить пути, в которых участвуют 14-3-3 белки и их взаимодействие с другими белками. Второе – необходимо сконцентрироваться на дисфункциях 14-3-3 белков у человека, ассоциирующихся с определенными заболеваниями. Если эти белки являются лишь общими маркерами повреждения мозга, то их присутствие в СМЖ будет полезным как дополнительный диагностический тест к клиническим признакам. В этих случаях необходимо исследовать механизмы появления специфических изоформ 14-3-3 белков в СМЖ при разных неврологических заболеваниях.
    Однако данные, полученные in vitro, исследования на модельных животных и анализ мозга post mortem у больных с ПБ, АБ, SCA и ALS указываю на участие 14-3-3 белков в процессах, связанных с заболеваниями. Это открывает пути для будущих исследований – изучения способов действия 14-3-3 белков и их связывание с белками-партнерами при этих болезнях. Нет сомнения в том, что эти исследования выявят широкий спектр партнеров 14-3-3 белков. Необходимо идентифицировать реальные регуляторы и модификаторы каскадов, в которые вовлечены 14-3-3 белки, и определить ключевые моменты, ответственные за их изменения при неврологических заболеваниях. Мутационный анализ генов, кодирующих 14-3-3 белки при этих болезнях, покажет, влияют ли вариации последовательностей на патогенез этих заболеваний, а это даст возможность оценить значимость описанных сигнальных молекул 14-3-3 в их патогенезе.
    Сайт создан в системе uCoz