Global approaches to protein–protein interactions Current Opinion in Cell Biology 2003, 15:199–205 | |
|
The availability of complete, annotated genome sequences for a
variety of eukaryotic organisms has paved the way for a
paradigm shift in biomedical research from the ‘one gene–one
hypothesis’ approach to more global, systematic strategies that
analyse genes or proteins on a genome- and proteome-wide
scale. One daunting task in the post-genome era is to determine
how the complement of expressed cellular proteins — the
proteome —is organised into functional, higher-order networks,
by mapping all constitutive and dynamic protein–protein
interactions. Traditionally, reductionist approaches have
typically focused on a few, selected gene products and their
interactions in a particular physiological context. In contrast,
more holistic strategies aim at understanding complex biological
systems, for example global protein–protein interaction networks
on a cellular or organismal level. Several large-scale proteomics
technologies have been developed to generate comprehensive,
cellular protein–protein interaction maps.
| |
Биологические процессы осуществляются и контролируются с помощью белков. Присущие им биохимические и/или каталитические активности в значительной степени регулируются/модулируются с помощью динамических, в пространстве и времени предопределенных физических (прямых) и функциональных (косвенных) межбелковых взаимодействий. Функция м. , следовательно, действительно зависеть от идентификации партнеров по взаимодействию (‘guilt by association’ концепция). Исчерпывающее описание всех статических и динамических клеточных межбелковых взаимодействий д. облегчить понимание функции всех генных продуктов.
Разработаны и используются некоторые протеомные технологии для картирования межбелковых взаимодействий на шкале всего протеома. Дрожжевой двугибридный метод позволяет картировать бинарные или парные взаимодействия, протеиновые чипы позволяют выявлять белок-белок, белок-липид, белок-лиганд взаимодействия, а метод affinity
capturing вместе с базирующейся на mass spectrometry
(MS) технике идентификации белков позволяет биохимическую очистку и анализ бимолекулярных и макромолекулярных белковых комплексов.
Yeast two-hybrid
High-throughput interaction proteomics
technologies
Yeast two-hybrid
Дрожжевая дигибридная система это ex vivo методе, который выявляет бинарные физические взаимодействия. Взаимодействие между ‘bait’ слиянием и ‘prey’ слиянием воссоздает функциональный транскрипционный фактор, который в свою очередь активирует репортерные гены или избирательные маркеры. И гомодимерные и гетеродимерные взаимодействия м. б. обнаружены, но, благодаря природе формируемых биомолекулярных комплексов, кооперативные взаимодействия между более чем двумя белками не выявляются. Система экономична, масштабируема и довольно хорошо подходит для автоматизированных высоко-технологичных подходов. Но имеются определенные ограничения: во-первых, взаимодействия вынуждены происхродить в ядре, это создает проблемы для определенного класса белков (напр., интегральные мембранные белки). Во-вторых, транскрипционные факторы и др. белки — обычно 5–10% случайно выбирают open reading frames (ORFs) — аутоактивируя транскрипцию репортеров. В-третьих, эктопически экспрессирующиеся белки не всегда подвергаются post-translationally modification (PTM) им присущим, исключая динамические, PTM-зависимые бинарные взаимодействия. Для преодоления этих препятствий имеется несколько модифицированных высоко адаптированных версий этой двугибридной системы. Эти настроенные системы м.б. применены к белкам, которые ауто-активируют транскрипцию (напр., SOS recruitment system), или являются специально приспособленными для выявления взаимодействий между мембранными белками (напр.,
Ras recruitment system, базирующаяся на G-белках система скрининга и split-ubiquitin система). Более того, разработана двугибридная система для млекопитающих.
Имеется несколько путей использования дрожжевой двугибридной системы. Наиболее разработанным и элегантным является скрининг предопределенной библиотеки белков полной длины (‘ORFeome’) against itself или в форме клональных массивов или пулов (‘matrix model’). Однако, база подобных наборов предопределенных ORFs доступна только для дрожжей Saccharomyces cerevisiae, для др. модельных животных она строится.
Protein microrarrays
Protein microrarrays
Белковые чипы позволят выявлять бинарные взаимодействия разных типов in vitro.Белки ковалентно закрепляются на на твердой подложке и скринируются флюоресцентно меченными зондами (напр., белковыми или липидными). Недавно получен высокой плотности дрожжевой протеомный микромассив, состоящий из 5800 GST–HisX6 слитых белков. Хотя такие белковые микромассивы в принципе пригодны для скрининга параллельно для взаимодействий по всему протеому, но техника пока используется только для идентификации новых calmodulin- и phospholipid-связывающих белков, междоменовых взаимодействий и антител и антигенов.
Mass spectrometry analysis of purified protein complexes
Mass spectrometry analysis of purified protein complexes
Разработка мощной, чувствительной, высоко-технологичной MS техники позволяет выявлять пептиды в низких femtomolar пределах, это стимулировало разработку методов для биохимической очистки целых клеточных белковых ансамблей. Традиционные affinity методы, использующие специфические антитела или сродство (affinity) лигандов, были скомбинированы с MS для идентификации белковых комплексов из клеток или тканей, таких как белковая сеть вокруг рецепторов нейротрансмиттеров из синапсов у мышей. Очевидно, что эти подходы зависят от доступности специфических антител или др. лигандов. Однако, в процессе разработки имеются подходы, которые нацелены на создание на заказ structure-driven design белковых доменов в качестве лигандов. Общие подходы для очистки белковых комплексов используют целенаправленно слитые белки со стандартными affinity метками (tag) в качестве bait или точки вхождения, которые в свою очередь распознаются антителами или affinity resins (смолами). Белковые комплексы элюируются из кусочков (beads), специфическим образом — напр., за счет использования собственных fusion tag peptide (‘affinity elution’). Процедура tandem affinity purification (TAP) разработана Seraphin и сотр., использует fusion tag, состоящий из двух белковых доменов, связывающих A immunoglobulin (Ig)G, плюс калмодулин-связывающего пептидного тэга, разделенных спейсером, содержащим специфический сайт распознавания для tobacco etch virus (TEV) протеазы. Следовательно, очистка состоит из 4-х специфических ступеней: во-первых, связывание с высоким сродством IgG шариков; во-вторых, элюция с помощью TEV протеазы; в-третьих, связывание с высоким сродством калмодулиновых шариков в присутствии Ca 2+ ; и, наконец, элюция с помощью Ca 2+-chelating агентов. Этот метод
affinity очистки комплексов в купе с MS detection обладает определенными преимуществами, но также имеет и ограничения. В целом он более физиологичен, т.к. действительные молекулярные ансамбли, создающиеся с помощью всех комбинаций прямых и кооперативных взаимодействий, анализируются in vivo скорее, чем воссоздаются бимолекулярные взаимодействия ex vivo или in vitro. Подход не ограничивается одним данным типом клеток или организмов. Можно также установить, какие белки и изоформы принадлежат данному клеточному потеому (Рис. 1). В то время как вдрожжевой двугибидной системе оба взаимодействующих компонента экспрессируются как слитые белки, при подходе сложной очистки только один компонент комплекса экспрессируется как слитый белок, это минимизирует возможность стерических интерференций. Все описанные выше методы высоко комплементарны и должны использоваться в комбинации для получения высоко-качественных, исчерпывающих карт межбелковых взаимодействий в данной клетке (Рис. 1).
Large-scale studies in yeast
Дрожжевая двугибридная система успешно используется в исследованиях по большой шкале от вирусов и бактерий до дрожжей S. cerevisiae (Табл. 1). Проведены два масштабных исследования на дрожжах. Доступность высокого качества геномных последовательностей с действительными ORF предсказаниями, средние размеры протеома ( 6200 генов, ограниченный альтернативный сплайсинг), и богатство опубликованной информации создают преимущества для этого объекта. Детальное сравнение обоих screens показывает, что в обеих базах данных идентифицируется только 15–20% основных взаимодействий с высокой достоверностью. Сравнение надежных, в ручную выявленных взаимодействий выявляет низкую величину (около 12.5%)перекрывания. Причиной столь низкого перекрывания м.б.: во-первых, внутренне присущие различия экспериментальных подходов, напр., разная строгость критериев; во-вторых, PCR-генерируемыми мутациями; в-третьих, неправильной упаковкой; и, в-четвертых, тем, что оба screens не были насыщенными (Табл. 1).
Две группы сообщили недавно об широкомасштабном анализе очищенных белковых комплексов S. cerevisiae. Ho et al. использовали временную избыточную экспрессию flag-tagged ORFs, которые и были субъектом для одноступенчатой affinity очистки с помощью sodium dodecyl sulphate–polyacrylaminde gel electro-
phoresis (SDS–PAGE). Комплекс составляющих идентифицировался с помощью tandem MS. Gavin et al. интегрировали TAP-tag кассеты с помощью гомологичной рекомбинации в 3' конец каждой ORF и использовали гаплоидные клетки. преимуществом tagging стратегии было то, что не было конкуренции за ‘untagged’ белки и что экспрессия находилась под контролем эндогенных промоторов (http://www.uni-frankfurt.de/fb15/mikro/euroscarf/index.html). После TAP и SDS–PAGE использовали peptide-mass finger-printing с помощью matrix-assisted laser desorption/ionisation (MALDI)-MS для идентификации белков. Gavin
et al. обработали 1739 ORFs, включая набор из 1143 человеческих ортологов. Ho et al. отоблали 725 ORFs с упором на сигнальные белки, такие как протеин киназы и фосфатазы,а также белки, связаннные с ответом на повреждения ДНК. Общее количество ассоциаций, выявленное в обоих исследованиях сравнимо (Табл. 1). Оба подхода имеют два принципиальных недостатка: искусственные или следовые взаимодействия (ложно-позитивные) и невыявленные генуинные ассоциации genuine associations (ложно-негативные). Обе группы провели детальное биоинформационное сравнение биохимических/MS-базирующихся подходов. Парные взаимодействия м.б. абстрагированы из комплексов неизвестной топологии двумя путями: модель ‘spoke’ подсчитывает ассоциации только между bait и interactors, тогда как ‘matrix’модель суммирует все комбинации между составляющими макромеолекулярный комплекс. Прямое сравнение обоих screens с помощью spoke модели выявляет относительно небольшое количество общих физических взаимодействий (198 взаимодействий на 222 белка) внутри стержневой отфильтрованной базы данных. , filtered datasets [24]. Сравнение с надежными вручную полученными взаимодействиями выявлено 27.8% соответствия с TAP-MS методом и 6.8% для HMS-PCI стратегии и с 3.7% в среднем для дрожжевого двугибидного скрининга.
В целом, Ho et al. выявили более высокий уровень взаимодействий на bait, чем Gavin et al. Эти различия связаны скорее всего с экспериментальными подходами, которые связаны с избыточной экспрессией затравки (bait), которая за счет изменения баланса масс в клетке м. давать более высокие количества неспецифических взаимодействий, и с более исчерпывающим возможностями метода MS идентификации. Ложная позитивность м.б. демаскирована с помощью анти-корреляционной gene ontology (GO) annotation. 80% взаимодействующих пар имеют ту же самую GO классификацию, тогда как для высоко-технологичной базы данных взаимодействий он составляет только 21%. Др. важным наблюдением является существенная фракция неперекрывающихся ложно-отрицательных данных для всех широкомасштабных баз данных, указывая тем самым, что эти screens ненасыщены.Все это указывает на то, что интеграция разных протеомных подходов необходима для получения с высокой достоварностью всех клеточных межбелковых взаимодействий (Рис. 1).
На базе оперонной модели, установлено, что ко-экспрессирующиеся гены у эукариот имеют высокую вероятность взаимодействовать функционально и физически. Kemmeren et al. определяли какие из выявленных взаимодействий в 4-х дрожжевых базах данных обнаруживают ко-экспрессию мРНК. Когда выбирались только ранее известные надежные взаимодействия белковых пар, то процент ко-экспрессии был примерно 60% по всем базам данных. Однако, когда выбирались большие количества вновь открытых взаимодействий, то % ко-экспрессии составлял 56% и 43% в двух базах сложной очистки и 39% и 35% в широкомасштабных двугибридных скринингах.
Systems biology
Динамические пространственные и временные изменения в постоянных бинарных и макромалекулярных ансамблях и при сборке комплексов de novoв ответ на варьирующе внушние стимулы еще не картированы исчерпывающе. Важно интегрирование получаемой информации по взаимодействиям с др. функциональными подходами, такими как данные по динамике экспрессии генов, количественным аспектам экспрессии генов, локализации белков и функциональным аспектам, выявляемых при скрининге генетической и синтетической летальности. Выявлены большие группы кластеров и synexpression генов, ко-транскрибируемых, а иногда и ко-транслируемых, благодаря эволюционной консервации общих цис-регуляторных элемнтов в генах и мРНК. очевидно, что существуют также разработанные скрытые ‘cis codes’ в белковых структурах, которые управляют сборкой конституитивных и динамических бимолекулярных (‘interactome’) и макромолекулярных комплексов (‘complexome’). Возрождение старого адажио ‘systems biology’, которое следует за эфимерным ‘omics’ жаргоном лучше объясняет сложность клеточных процессов, которые необходимо рассматривать как многослойные, высоко взаимосвязанные системы.
Conclusions
The generation of comprehensive protein–protein and
multiprotein complex interaction maps have provided a
wealth of information on the core interactome and higher-order
organisation (complexome) of the yeast proteome.
Analogous interaction maps or networks for higher eukar-yotes
have not yet been published. Pilot studies using
subsets of functionally related proteins have been per-formed
in Caenorhabditis elegans [38,39,40]. Large-scale
yeast-two hybrid studies on human cells have been per-formed
by commercial enterprises but not yet been
published. Complex purification approaches such as
TAP-MS are also applicable to human cells [27].
In the meantime, we have processed several hundreds of
human proteins involved in different disease areas by
applying TAP-MS to human cells and mouse tissues
(G Drewes and T Bouwmeester et al., unpublished data).
We anticipate that not too distant in the future, a com-
plete map of protein–protein interactions in a model
human cell will become available.