rRNA genes
рРНК Гены

Three-dimensional organization of active rRNA genes within the nucleus
T.Cheutin, M-F. O'Donohue, A. Beorchia, M. Vandelaer, H. Kaplan, B. Defever, D. Pioton, M. Thiry
J.Cell Sci., Vol. 115, Issue 16,3297-3307, 2002


Локализованы транскрибирующиеся гены рРНК и описана их трехмерная организация в ядре с помощью электронной томографии. Используя pulse-chase эксперименты с BrUTP и ингибитор элонгации, cordycepin, м. точно локализовать инициальные сайты BrUTP инкорпорации. BrUTP сначала включается в фибриллярные центры , а элонгирующиеся рРНК быстро вступают в окружающие плотный фибриллярный компонент. Детальный томографический анализ выявил, что РНК полимаразa I в основном локализуется внутри дискретных кластеров. В каждом из них молекулы РНК полиеразы I сгруппированы как несколько спиралей, 60 нм в диаметре. предложена модель трехмерной организации транскрибирующихся рРНК генов внутри ядрышек.


(Рис.1.)
 |  Ultrastructural localization of nascent rRNA molecules within the nucleolus.


(Рис.2.)
 |  Densities (gold particles/µm2) on the FC, DFC, GC and resin (R) in nucleoli isolated from ELT cells


(Рис.3.)
 |  Effect of actinomycin D upon BrUTP incorporation.


(Рис.4.)
 |  Immunogold detection of BrUTP-labelled rRNAs on ultrathin sections of isolated nucleoli from ELT cells


(Рис.5.)
 |  Ultrastructural identification of initiation sites of rDNA transcription within the nucleolus.


(Рис.6.)
 |  Ultrastructural localization of RNA polymerase I within A549 cells.


(Рис.7.)
 | Tomographic study of A549 cells immunolabelled with anti-RNA polymerase I antibodies.


(Рис.8.)
 |  Organization of the coils.


(Рис.9.)
 | A model of the three-dimensional organization of an active rDNA gene within a fibrillar center.

рРНК гены у высших эукариот появляются в видем множественных тандемно повторяющихся копий, котрорые разделены нетранскрипбируемыми "спейсерами". Первичные рибосомальные транскрипты (пре-рРНК) синтезируются РНК полимеразой I (RPI) и постпенно подвергаются процессингу, давая 18S, 5.8S и 28S рРНК, которые и интегрируются в рибосомы. Итранскрипция и процессинг осуществляются внутри ядрышке, которые состоят из трех основных субструктур в клетках млекопитающих: fibrillar center (FC), dense fibrillar component (DFC) и granular component (GC).
После гипотонической обработки ядрышка каждый транскрибируемый ген деконденсируется и принимает вид т.наз 'Christmas tree', 4.5 -6 µm длиной. Это дерево состоит из 135 до 180 фибрил растущих пре-рРНК, каждая из которых соединена с осью рДНК при помощи молекулы RPI. Локализация этих 'Christmas tree' по отноешнию к разным компартментам внутри ядрышка составляет сложную проблему. Считается, что транскрипция происходит в фибриллярных регионах ядрышка, но где, в DFC или на границе DFC и FC или внyтри FC, неясно.
Разработан новый метод инкорпорации BrUTP. позволяющий отслеживать кинетику синтеза и созревания рРНК. С его помощью было установлено, что BrUTP меченная рРНК первоначально локализуется в внутри FC и во внутренней части DFC. Однко скорость синтеза рРНК in vivo столь высока (25-50 нуклеодидов/сек), что локализация BrUTP м. отражать и место включения и место накопления. Использована электронная томография.
В данной работе изучена точная локализация инициальной BrUTP инкорпорации на ультраструктурном уровне. Использованы идолированные ядрышки со сниженной скорость транскрипционной активности. Использование pulse-chase процедуры и ингибитора элонгации позволило показать, что рибосомальные трнаскрипты элонгируются в кортексе FC и затем вступают в окружающией DFC. Мечение RPI перед embedding показало, что молекулы RPI локализованы внутри кортекса FC, где они организованы внутри 3-5 изогнутых спиралей, состоящих из колец (bent twines). Известно также, что рДНК гены в FC, также преимущественно находятся в их кортикальной части.
Предолжена модель объемной организации 'Christmas trees', которая объясняет все данные, касающиеся рДНК генов в FC и растущих рРНК молекул в FC и в DFC. Электронная томограйия выявляет два уровня организации. Во-первых, некоторые спирали, обнаруживающие общее происхождение, обнаруживают пространственное расположение, напоминающее венчик (corolla), что подтверждается присутствием центральной полости. Во-вторых, внутренняя организация спиралей напоминает кольца (bent twinws) приблизительно 6- нм длиной и 20 нМ толщиной. Предполагается, что спирали состоят из RPI молекул, связанных с генами рДНК, и что их пространственное распределение м.б. использовано для моделирования трехмерной организации рДНК генов in situ (Рис.9). Использовали картину расправленной транскрибируемой области гена рДНК млекопитающих (~6000 nm в длину), покрытую 30 RPI молекул/µm. Размер RPI молекулы определен в 16 nm, a длина полностью элонгированной рРНК - 350 nm (эти пре-рРНК молекулы 3 nm в диаметре и заканчиваются частицей шириной в 20 nm)(Рис.9 А). Выявляется 4-5 спиралей, исходящих из общего источника, это коррелирует с ранее полученными результатами, показавшими присутствие ассоцированных с матриксом областей как в 5'NTS, так и в 3'NTS генов рДНК. Более того, termination transcription factor (TTF1), который м. олигомеризоваться и формировать агрегаты, связывается и с иниационным и терминационным сайтами генов рДНК, превращая тем самым каждый ген рДНК в петлю. Эти результаты схематизированы путем сложения гена рДНК в 4 петли (Рис.9 В), каждая из которых подвергается складыванию еще на одном уровне, в результате формируются два параллельных ряда (Рис.9 С). Эти ряды (~200 nm в длину) состоят из последовательных маленьких петель ~60 nm в длину, каждая из которых содержит 3-4 молекулы RPI. Складывание (bending) всех петель на матриксе цилиндра дает спираль в 60 nm в диаметре и 200 nm в длину (Рис.9 D,E), сходную с той, что возникает после иммуномечения RPI. Следовательно, спираль м.б. получена в результате складывания (stacking) примерно 6 открытых колец (квадратные скобки на Риc. D ), каждое из которых представлено двумя twines (Рис.9, F,G). Данная картина согласуется с поперечными и продольными срезами спиралей. Наивысший уровень изгибания и петлеообразования в данной модели достигается за счет UBF, обчень обильно представленного белка в ядрышках. В самом деле UBF обладает способностью изгибать рДНК и его связывание не ограничивается регуляторными последовательностями рибосомальных ДНК повторов, оно м. происходить вдоль всех этих последовательностей.
Наконец, транскрибируемый ген РДНК м.б. пространственно организован внутри ограниченного объема в виде 4, одинаково организованных спиралей (Рис.9 H,I) с фактором компакции равным примерно 7. Эта модель все еще оставляет достаточно пространства между молекулами RPI и рДНК для пре-рРНК молекул, чтобы они могли удлинняться без стерических помех. Отверстия колец (стрелки Рис.9 F) lf.n две продольные борозды вдоль каждой спирали, которые м. наблюдать при поворачыивании модели целиком (Анимация jcs.biologist.org/supplemental ). Поперечные срезы, представленные на Рис.9 Н, (270 nm в диаметре) сравнимы с FC, т.к. представлют собой то же самое увеличение. что и на ультратонких срезах (Рис.9 J). Данные по включению BrUTP, которые демонстрируют, что растущая пре-рРНК синтезируется в FC и вступает в окружающий DFC, схематизированы на Рис.9 J в виде поляризованных нитей. Модель предполагает позиционирование растущих рРНК концов в двух разных компартментах, что подтверждается находками, что пре-рРНК находятся в расправленной конформации во время транскрипцции.
Модель коррелирует с тем фактом, что присутсиве DFC в ядрышке сильно зависит от начала транскрипции генов рРНК. Микроинъекции анти-RPI антител редуцируют синтез рРНК, это модифицирует также морфологию ядрышка; DFC быстро дизорганизуется и формируются внеядрышковые тела, которые лишены RPI. Блее того, после гипотонического шока, ведущего к полной реорганизации структуры ядрышка, FCs и DFCs полностью разделены, а рДНК обнаруживается тоько в остатках FCs. Следовательно, интимная ассоциация FCs с DFC м. служить рабочей рамкой, которая сохраняет продукты транскрипции в специфической топологической организации (order), необходимой для последующего каскада стпеней созревания и процессинга.


Сайт создан в системе uCoz