Yamaguchi и Newport заметили, что когда они добавляют хроматин спермиев в цитозоль яиц Xenopus, то быстро собирается pre-replication complexes (pre-RCs) на ДНК спермия. Напротив, если добавить хроматин спермия в ядерный экстракт, то MCM helicase — фактор инициации и компонент pre-RC — неспособен соединяться с хроматином. Т.к. ядерный экстракт содержит высокую концентрацию Ran–GTP по сравнению с цитозолем и учитывая множество ее функций в ядерных процессах, поэтому авт. исследовали, м. ли Ran–GTP быть ответственной за предупреждение сборки MCM в pre-RCs. Они показали, что добавление к ядерным экстрактам мутантного Ran белка, RanT24N, которая слабо соединяется с GDP и не соединяется с GTP, то происходит восстановление MCM сборки в pre-RCs, тогда как дикого типа Ran к этому не приводит.

Затем проверяли, м. ли RanT24N оказывать тот же самый эффект в интактных ядрах. Как и ожидалось, MCM связывание было ингибировано в pre-formed ядрах, которые добавлялись с цитозолем, содержащим MCM, и в самом деле, такое ингибирование м.б. ревертировать добавлением RanT24N. Более того, в присутствии RanT24N, репликация происходит быстрее и продолжается дольше, а включение bromodeoxyuridine (BrdU) добавлялся в reconstituted ядра непосредственно после репликации (ядра G2), то MCM ре-ассоциировал с хроматином и репликация возобновлялась.

При увеличении низкой цитозольной концентрации Ran–GTP, связывание MCM с хроматином снижалось. Более того, в присутствии мутантной Ran , RanQ69L — которая м. связываться, но не гидролизует GTP — то загрузка MCM полностью блокируется. Yamaguchi и Newport ролагают, что низкая концентрация Ran–GTP в цитозоле позволяет MCM собираться в ансамбль pre-RCs прежде сборки ядра.

Т.к. уровень Ran–GTP в ядре постоянно высок, то авт. предполагают, что Ran–GTP д. соединяться с др. регуляторным компонентом, чтобы сделасть возможным образовние pre-RC во время G1. Cdk2 kinase скорее всего и является тем кандидатом, т.к. она, как известно, существенна для ингибирования повторной репликации. Когда Cdk2 инактивирована с помощью Cdk2 ингибитора p27Kip1, то MCM загрузка боее не ингибируется с помощью RanQ69L. Итак, Ran–GTP-индуцированное ингибирование MCM зависит от Cdk2.

Используя антитела против MCM7, Yamaguchi и Newport иммунопреципитировали белок ядерного экспорта exportin-1/Crm1. Более того, увеличение концентрации Ran–GTP при добавлении RanQ69L увеличивало ассоциацию Crm1 с MCM. Напротив, добавление RanT24N дестабилизировало Crm1–MCM комплекс. Иммуноистощение Crm1 показывает, что RanQ69L гн м. более ингибировать сборку MCM, а ингибирование м.б. восстановлено при добавлении Crm1 обрано в экстракт.

Итак, авт. идентифицировали др. ядерную функцию для малой GTPase Ran, и открыли один из возможно нескольких (redundant) механизмов для предупреждения повторной репликации в тепчение одного клеточного цикла у метазоа.