Stokes, M. P. & Michael, W. M. DNA damage-induced replication arrest in Xenopus egg extract. J. Cell Biol.163, 245-255 (2003) | | | |
Two mechanisms for damage-induced replication arrest have been described so far; one that involves activation of the DNA-damage checkpoint and a checkpoint-independent one that causes slowing of replication-fork progression. Now, reporting in The Journal of Cell Biology, Matthew Stokes and Matthew Michael have uncovered a third damage-induced replication arrest pathway.
Ранее авт. показали, что если поврежденный хроматн спермиев от Xenopus (обработанных алкилирующим агентомmethyl methanesulfonate (MMS)) инкубировать с неповрежденным хроматином спермев, то репликация неповрежденной ДНК задерживается. Этот результат был подтвержден, когда они совместно инкубировали MMS-обработанную ДНК плазмид с неповрежденным хроматином спермиев в ДНК репликационном assay, и нашли, что репликация хроматина спермиев ингибируется. Они также показали, что период совместной инкубации важен — репликация хоматина спермиев затрагивается только в течение первых 10 мин совместной инкубации.
Затем Stokes and Michael использовали поврежденную ДНК плазмид, котораябыла иммобилизована на кусочке магнита. После инкубации плазмид с яйцевым цитозолем Xenopus, плазмиды на кусочках собирались, а супернатнт восстанавливался. Инкубирование этого экстракта (который подвергся воздействию поврежденной ДНК лишь временно), с хроматином спермиев в репликационном assay, блокировало репликацию хроматина спермиев. Это заставило авт. поверить, что экстракт содержит ингибитор репликации.
Но какя ступень репликации блокируется этим ингибитором? Stokes and Michael инкубировали совместно хроматин плазмиды и спермиев как в стандартном DNA-replication assay, затем отделяли плазмиды и остальную часть экстрата от хроматина, который они тестировали в отношении хроматин-ассоциированных белков с помощью immunoblotting. Они установили, что совместная инкубация поврежденных плазмид, но не undamaged плазмид, вызывает в результате снижение количества ассоцированного с хроматином пролиферирующих клеток ядерного антигена (), который существенен как фактор репликации. Однако поставка DNA в хроматин не изменена. Это указывает на то, что блок появляется после того как pol α соединится с хроматином, рно прежде чем PCNA будет загружена в репликативную вилку.
Используя ингибитор checkpoint kinases, чтобы блокировать DNA-damage checkpoint путь, авт. показали, что способность MMS-обработанных плазмид блокировать репликацию хроматина спермиев не меняется, следовательно, MMS-индуцированный арест репликации является checkpoint независимым. Интересно, что они также показали, что стимуляция ареста репликации неповрежденного хроматина спермиев активирует checkpoint ответ.
Итак, хотя диффундирующих ингиитор все ещё не установлен полученные данные показывают, что "...the coupling of replication arrest and checkpoint activation pathways suggest an integrated response to MMS-induced damage...".