The chromosome replication cycle Diffley J.X, Labib K.
J.Cell.Sci. V.115. No 5. P. 869-872. 2002 1,
J.Cell.Sci. V.115. No 5. P. 869-872. 2002 1,
)
Репликация ДНК начинается во множественных исходных точках репликации п распространяется вдоль индивидуальных хромосом. В большинстве типов клеток эукариот источники репликации постоянно активированы в течение всей S фазы в соответствии с временной программой.
Ступень 1. Источники репликации определяются, по крайней мере частично, путем связывания шести субъединиц origin recognition complex (ORC) комплекса распознавания, которые эволюционно законсервирован от дрожжей до человека. ORC соединяется специфически с существенным двучастным сиквенс элементом внутри репликативного источника. ORC связывает АТФ и м. также гидролизовать АТФ, и это связывание необходимо для соединения ORC с ДНК, но гидролиз АТФ необязателен для связывания ДНК и практически ингибируется при связывании ORC с источником. ORC остается связанным с источником репликации в течении всего клеточного цикла у почкующихся дрожже и даже в течение митоза. У многоклеточных эукариот некоторые субъединиц ORC остаются связанными в течение всей G1, S и G2 фаз, однако имеются противоречивые указания на то, как остается ORC связанным с хромосомами во время митоза.
Ступень 2. В конце митоза два белка Cdc6 и Cdt1 поставляются отдельно в ORC. Cdc6 и некоторые из субъединиц ORC являются членами семейства ААА+ АТФаз, которое включает также clamp loader белки, такие как RFC. Cdt1 не обнаруживает существенного сходства с др. белками, хотя и м. содержать суперскурученную область.
Ступень 3. Шесть очень близких белков, известных как, МСМ2-7 комплекс, рекрутируются в хроматин с помощью ORC, a Cdc6 и Cdt1 в комплекс, известный как prereplicative complex (pre-RC). Реакция ансамбля МСМ2-7 известна как 'licensing'. MCM2-7 комплекс необходим в течение всей S фазы как для инициации, так и элонгации. Субкомплекс MCM4, 6 и 7 обладает ДНК helicase активностью, это указывает на его участие в распрямлении ДНК в репликационной вилке. Кроме того, и др. члены семейства МСМ существенны для элонгации, это указывает на то. что функциональный MCM комплекс - в общем-то репликативная геликаза - включает все 6 MCM белка. В организмах от дрожжей до человека обнаруживается примерно 20 копий комплексов MCM2-7 над одним источником репликации в хроматине (или молекул ORC).
Ступень 3а. Факторы, детерминирующие время наступления запуска, изучены слабо, однако, хромосомный контекст является критическим детерминантом. Напр., источники бвлизи теломер имеют тенденцию быть активированными позднее в S фазе, а источники с ранним запуском, перемещенные в субтеломерное положение, становятся поздними. Данные, полученные на дрожжах и клетках млекопитающих, показывают, что временная програма запуска источников репликации устанавливается рано в клеточном цикле, еще до начала репликации ДНК. Покзано, что источник, вырезанный из суб-теломерной области до митоза, реплицируется рано в последующей S фазе. Однако, если эксцизия происходит во время G1 фазы, то после сборки pre-RC источник реплицируется поздно.
Экспериментально установлено, что эта временная программа запуска источников в клетках млекоптающих запускается в ранней G1 фазе. Выявляется корреляция между временем репликации и положением в ядре как у дрожже, так и в клетках СНО.
Кроме того, если ядра СНО на очень ранней G1 фазе инкубировать в экстактах яиц, то инициация происходит в случайных сайтах локуса DHFR. Однако, если используются ядра СНО на поздней G1 фазе , то инициация происходит в строго определенном источнике DHFR. Это было использовано для выявления 'origin decision point', которая появляется как после сборки pre-RC , так и временной точки принятия решения.
Ступень 4. Многие эукариотические клетки вступают в покойное сотсояние (quiescence) с G1 фазы. У почкующихся дрожжей pre-RCs, формируемые в конце митозов, исчезают из источников, как только они вступают в quiescence (стационарную фазу). Покоящиеся клетки млекопитающих кроме того нелицензируются, хотя неясно, теряют ли такие клетки pre-RC или не собирают их с самого начала.
Ступень 5. Pre-RC созревает в pre-initiation complex (pre-IC) за счет ректрутирования дополнительных факторов, включая Cdc45 и Sld3, и вообще др. иниационных компонентов, таких как Dpb11 (шлмлдлг у S. cerevisiae белку S. pombe Cut5 и человеческому TopBP1). Cdc45 впоследствии играет важныу роль во время элонгации, а также во время инициации. Неизвестно, играют ли Sld3 или Dpb11 стоьже важную роль в элонгации. Ряд др. белков участвует в инициации репликации ДНК примерно на этой же стадии, включая Dna43 (изсестного также как MCM10) и Sld2 (известного также как Drc1).
Ступень 6. Две законсервированные протеин киназы играют существенную роль в запуске инициации репликации ДНК во время S фазы. Одна из них это cyclin-dependent kinase (CDK). У одноклеточных грибов, таких как почкующиеся и делящиеся budding and fission дрожжи, единстввенная CDK (Cdc28 у S. cerevisiaeи cdc2 у S. pombe) является в первую очередь ответственнрой за управлением всеми ключевыми переходами клеточного цикла. У многоклеточных эукариот клетоный цикл контролируется множественными CDKs. У всех исследованных организмов S phase обычно активируется с помощью специфической cyclin CDK-комбинации. У S. cerevisiae, Cdc28 действует с двумя B-типа циклинами, CLB5 и 6 для управления S фазой; у S. pombe, S фаза управляется с помощью cdc2 и cig2 B-типа циклина. У метазоа, CDK2 действует как S фазная специфическая CDK вместе с циклинами A и E. Эти два циклина скорее всего играют разные роли в инициации. Хотя большинство факторов инициации фосфорилируются in vivo с помощью CDKs, физиологически подходящие субстраты довольно трудно предугадать.
Др. важной способствующей S фазе киназой является Cdc7. Подобно CDKs, Cdc7 нуждается в некаталитической субъединице, Dbf4, для совей активности. Имеются и др. параллели между Cdc7-Dbf4 и CDKs: напр., у почкующихся дрожжей, Dbf4 нестабилен на ранней G1 фазе из-за того, что метится для убиквитинового протеолиза с помощью anaphase promoting complex, одинаково с B циклинами. Dbf4 взаимодействует с источниками репликации in vivo, а ORC связывающий сайт важен для этого взаимодействия. На дрожжах было устанолвено, что Cdc6, а , следовательно, MCM2-7 не нужны для этого взаимодействия, однако, эксперименты на Xenopus указывают на то, что это взаимодействие нуждается в MCM2-7, но не в ORC или Cdc6. Генетические и биозимические доказательства подтверждают, что MCM2-7 комплекс является важной мишенью для киназ.
Эксперименты по иммунопреципитации хроматина после поперечного связыания формальдегидом в почкующихся дрожжах показали, что pre-ICs собираются на рано запускаемых источниках во время G1 фазы, перед Start (restriction point в клетках млекопитающих), но не не образуют ансамблей на поздно-запускаемых источниках вплоть до самой инициации во время S фазы. Эксперименты по связыванию хроматина без образования поперечных связей у почкующихся дрожжей и Xenopus показали, что pre-ICs ансабли образуются только после активации CDK и Cdc7. Одна из моделей для улаживания этих различий предполагает что до активации киназы факторы, такие как Cdc45, ассоциированы лишь слабо с источниками, а после активации киназы принимают закрытую на замок (`locked') конформацию. После действия этих двух киназ источники раскрываются и гетеротримерный однонитчатый ДНК-связывающий белок RPA рекрутируется.
Ступень 6a. Помимо их роли в запуске инициации CDKs выполняют еще одну важную роль в регуляции репликации ДНК: они ингибируют сборку новых pre-RCs. Это четко предупреждает ре-инициацию репликации с источников, которые активированы во время S фазы. Два обобщения м. сделать о механизмах, с помощью которых CDKs препятсвуют сборке pre-RC. Во-первых, блокирование сборки pre-RCдостигается посредством множественных, перекрывающихся механизмов. Напр., у почкующихся дрожжей, Cdc6, MCM2-7 и ORC , все негативно регулируются с помощью CDKs. Во-вторых, разные организмы используют разные стратегии для блокирования. Напр., у почкующихся и делящихся дрожжей, Cdc6 является нестабильным белком, который направляется на протеолиз с помощью убиквитина в конце G1 фазы, тогда как у метазоа Cdc6 стабилен во время S фазы, но экспортируется из ядра в начале S фазы. У метазоа, Cdt1 ингибируется малым белком geminin. Geminin направляется на убикситином-обеспечиваемый протеолиз с помощью anaphase promoting complex/cyclosome (APC/C), который, в совю очередь, активируется с помощью CDKs.
Ступень 7. После раннего разворачивания рекрутируется первой ДНК полимераза. Межбелковые взаимодействия между Cdc45 и/или RPA мю играть роль в ее поставке. Т.к. ДНК полимеразы неспособны инициировать синтез цепи de novo, то абсолютно нуждаются в `primase' для синтеза коротких треков рибонуклеотидов. Короткие (6-10 нуклеотидов), с матрицей связанные РНК м. затем действовать как `primer' для синтеза ДНК. Этот ранний синтез осуществляется с помощью четырех субъединиц комплекса ДНК полиераза-примаза.
Ступень 7a. Из-за антипараллельной природы ДНК две параллельные нити реплицируются с помощью разных механизмов во время перемещения репликационной вилки. Т.к. репликативная helicase (вообще-то MCM2-7) движется вперед по ДНК (голубые стрелки), то родительская нить, которая является 3' -> 5' по отношению к направлению раскручивания м. реплицироваться непрерывно с помощью ДНК полимеразы, синтезируясь от 5' к 3', т.е. в том же направлении что и helicase. Она известна как ведущая нить (`leading strand'). На др. нити, однако, репликация является трюком (trickier) т.к. ДНК полимераза не м. синтезировать ДНК в направлении от 3' к 5'. Чтобы обойти эту пролему, эта нить реплицируется прерывисто; как только helicase расплетает ДНК, то ДНК полимераза-примаза синтезируют РНК (красная)-ДНК (черная) гибрид на вновь расплетенной ДНК в направлении, противоложном геликазе. Как только геликаза проходит далее, то возникает пробел на матричной нити. Эта часть снова служит как матрица для образования короткой гибридной молекулы РНК-ДНК. Т. о., `lagging strand' реплицируется с помощью повторяющихся синтезов коротких `Okazaki fragments'. Координация синтеза lagging нити с расплетанием ДНК является критичекой , т.к. ДНК полимераза α м. посторно инициировать образование фрагментов Okazaki на интервалах в 150-200 bp, т.к. ДНК не будет расплетена. В бактериальной и вирусной системе это сопровождается критическими взаимодействиями между примазой и геликазой. У эукариот, взаимодействия между ДНК полимеразой α и или MCM2-7 или Cdc45 м.б. важны для этой координации.
Ступень 8. Репликация происходит в двух направлениях из многих источников репликации на хромосоме. Репликационные вилки указывают на то, что происходит перемещение в противоположных направлениях от источника репликации. Во-первых, фрагменты Okazaki на каждой нити служат в качестве праймеров для сборки machinery ведущей нити для каждой репликативнй вилки. Непрерывный синтез ДНК на ведущей нити нуждается в ДНК полимеразе, которая синтезирует длинные куски ДНК процессивным способом (т.е. без уменьшения). ДНК полимераза α не подходит для выполнения этой работы, т.к. обладает очень низкой processivity (30 нуклеотидов на инициацию). Кроме того, ДНК полимераза α не обладает 3' -> 5' экзонуклеазной актинвостью, необходимой для коррекции (`proofreading' (т.е. удаления неправильно включенных нуклеотидов)) и является , следовательно, более склонной к ошибкам, чем др. полимеразы. Значит, для синтеза ведущей нити необходимо переключение полимераз (`polymerase switch'), в результате которого более processive, высоко точная ДНК полимераза заместит эту α ДНК полимеразу. Фактически, из-за низкой processivity и точности ДНК полимеразы α очень вероятно, что большинство ДНК во фрагментах Okazaki синтезируется полимеразами другими нежели ДНК полимераза α. При репликации ДНК SV40 две ДНК полимеразы достаточны для полной, эффектив репликации ДНК и in vitro и in vivo. Имеется DNA polymerase α и DNA polymerase δ. Имеются строгие доказательства того, что есть и третья ДНК полимераза. DNA polymerase ε, необходимая для эффективной репликации хромосомной ДНК, выявлена у дрожжей и Xenopus. Специфмческие роли ДНК полимеразы ε еще до конца не установлены.
Высоко процессивный синтез ДНК с помощью этих ДНК полимераз нуждается в дополнительном факторе, называемом PCNA (proliferating cell nuclear antigen). PCNA является гомотримером, который формирует кольцеобразную структуру. Это кольцо окружает матрицу ДНК и таким образом топологически связан с ДНК. PCNA связывается с ДНК полимеразой и действует как скользящая манжетка (`sliding clamp'), препятсвуя полимеразе отделяться от ДНК. Кольцо PCNA должно быть загружено на конце ДНК праймера. Это осуществляется с помощью RFC, известного как занрузчик манжетки (`clamp loader'). Подобно ORC, Cdc6 и MCM2-7, комплекс RFC является членом сверхсемейства AAA+; он соединяется с 3' концом праймера и использует АТФ, чтобы открыть кольцо PCNA и замкнуть его вокруг ДНК-матрицы.
Ступень 8a. Топология молекулы ДНК меняется,т.е\к. она расплетается во время репликации ДНК. Раскручивание создает позитивное суперскручивание впереди репликативной вилки. Topoisomerase I и II м. ослаблять позитивное суперскурчивание, тогда как topoisomerase II м. и удалять catenanes и precatenanes.
Ступень 8b. Повреждения ДНК и остановка репликативной вилки запускают в действие контрольный пункт (checkpoin) глобальной геномной интеграции. Центральными в этой реакции являются две группы киназ. Первые являются большими белками, гомологичными phosphoinositide 3-kinases. У человека, сюда входят ATM, ATR и DNA PK; у дрожжей это Mec1 и Tel1 (S. cerevisiae) или Rad3 и Tel1 (S. pombe). Др. киназа известна как Chk2 (у людей), Rad53 (S. cerevisiae) и cds1 (S. pombe). Активация этого контрольного пункта предотвращает запуск поздно-запускаемых источников репликации и не позволяет вступать в митоз. Кроме того, этот КПП играет роль в предотвращении разрушения репликативной вилки.
Ступень 9. Как было показано выше отстающая (lagging) нить синтезируется прерывисто в виде серий РНК-ДНК гибридных молекул. Созревание этих фрагментов Okazaki связано с удалением РНК праймеров (и вообще-то и некоторой части ДНК) с помощью сочетанной реакции, нуждающейся в flap endonuclease Fen1 и helicase/endonuclease Dna2, и сопровождаемой их соединением с помощью ligase I.
Ступень 9a. Репликация геномной ДНК является лишь одним из компонетов репликации хромосом. Ряд и др. важных процессов связан с репликацией ДНК. PCNA играет центральную роль в купировании многих процессов с репликационной вилкой за счет непосредственных межбелковых взаимодействий. После репликации, две дочерние ДНК молекулы остаются тесно ассоциированы др. с др. в результате процесса т. наз. слипания сестринских хроматид. Слипание сестринских хроматид нуждается в ряде факторов, включая и Scc1-4, Eco1, Smc1,3, DNA polymerase σ, Ctf8,18, Dcc1, Pds5 и Rfc2-5, и может происходить только во время репликации ДНК.
Сборка хроматина связана с репликацией ДНК, она осуществляется chromatin assembly factor CAF1. У дрожжей, CAF1 не достаточен и, предполагается, что и др. факторы, включая и ASF1, участвуют в сборке хроматина. Высокая точность репликации ДНК достигается, частично, с помощью пост-репликативной репарации. Сюда входят mismatch репарация, рекомбинационный и trans-lesion синтез ДНК.
Элонгация и поддержание теломер также связаны с репликацией ДНК. На дрожжах показано, что белки, которые участвуют в синтезе запаздывающей (lagging) нити, такие как DNA polymerase α, необходимы для синтеза теломер. Наконец, в дополнение к этим основным процессам, участвующим в эффективной репликации и сегрегации хромосом, аккуратная репликация хромосом включает и аккуратное наследование программ генной экспрессии. Активные гены д. оставаться активными и после репликации, а молчащие гетерохроматиновые регионы оставаться неактивными. Это указывает на то, что состояние хроматина наследуется `эпигенетически' во время репликации ДНК.
Ступень 9b. Окончание происходит, когда две оппоцитные репликативные вилки встречаются и синтезируемые ДНК с двух вилок соединяются вместе. Довольно мало известно об этой ступени у эукариот. В отличие от прокариот, специфические последовательности ДНК, по-видимому, не нужны. Белки, которые действуют впереди ДНК молимераз, д.б. устранены прежде чем репликация законится, чтобы позволить полимеразам реплицировать последние биты (bits) последовательностей. Т.к. геликаза, а также и topoisomerase I скорее всего действуют впереди полимераз, то их устранение перед окончанием репликации м. иметь значение для финальной ступени репликации ДНК и decatenation дочерних молекул.
Ступень 10. Итак, две сестринские хроматиды соединены вместе с помощью кохезии. Это, скорее всего, важно для пост-репликативной репарации разрывов двойной нити, которые вызываются ДНК повреждающими агентами. Слипание, по-видимому, не происходит непрерывно вдоль всей длины хроматид, а происходит в специфических и многочисленных cohesion сайтах, включая и центромеры.
Ступень 11. После сборки биполярного митотического веретена в метафазе контролируемый протеолиз кохезий позволяет сестринским хроматидам разойтись к противоположным полюсам. После окончания сегрегации хромосом CDKs инактивируются с помощью сложной реакуии, которая купирована с цитокинезом с помощью mitotic exit network (MEN), известной также как septation initiation network (SIN). Это финальное инактивирование CDKs происходит, частично, и за счет активации anaphase promoting complex, E3 ubiquitin ligase, которая направляет циклины на деградацию посредством протеосом. В дополнение к этому, APC также направляет факторы репликации на протеолиз; сюда входит geminin, ингибитор Cdt1 у метазаоа, и Dbf4, Cdc7 регуляторная субъединица у дрожжей. Клетки вступают в G1, подготовленные для др. раунда сборки pre-RC.