The eukaryotic genome is divided into well-defined DNA regions that are programmed to replicate at different times during S phase. Active genes are generally associated with early replication, whereas inactive genes replicate late. This expression pattern might be facilitated by the differential restructuring of chromatin at the time of replication in early or late S phase.
В клетх животных ДНК расположена в виде определенных хромосомных дисков, которые подвергаются репликации запрограммированным во времени образом во время S фазы. Известно, что и на региональном и сиквенс-специфическом уровне имеется четкая и прямая корреляция между временем репликации и экспрессией гена. Большинство активных генов реплицируется рано (в первой половине) S фазы, тогда как большинство неактивных генных последовательностей реплицируется воздно в S фазе.
Согласно модели 'window of opportunity' на трансляционную компетентность м. влиять время репликации, когда структура хроматина разрывается и затем повторно упаковывается на вновь синтезированной ДНК. Одна возможность, это то, что гены, подвергающиеся репликации в ранней S фазе открыты для факторов, которые необходимы для образования активных транскрипционных комплексов, тогда как гены, которые реплицируются в поздней S фазе, подвергаются действию др. ядерной среды, которая более пригодна для генерации репрессивных структур. В модели три компонента: во-первых, независимый механизм контроля времени репликации; во-вторых, чувствительность хроматина к реструктуированию во время репликации; и в третьих, изменчивость состава ядер как функция прохождения через S фазу.
Replication time zones
Клетки животных характеризуются четким разделением генома на временные зоны репликации (Рис. 1). Высоко разрешающий анализ прометафазных хромосом указывает на то, что средняя длина каждой временной зоны равна приблизительно 1 Mb. Рано реплицирующиеся области картируются непосредственно в светлых G BANDS, которые являются G+C-богатыми ISOCHORES, тогда как поздно реплицирующиеся области картируются в темных G дисках, которые в целом содержат A+T-богатую ДНК.
Напротив у бактерий, у которых геном реплицируется целиком из одного источника, клетеки животных копируют свою ДНК путем инициации синтеза в двух направлениях из мноржественных источников, которые распределены в среднем через каждые ~100 kb. Это указывает на то, что время каждой репликации составлено из репликаций репликонов, которые д. осуществляться координировано — он в точности соответствует тому паттерну, который наблюдается при визуализации синтеза ДНК после мечения H3-thymidine. Сходная организация обнаруживается при использовании технологии микромассивов (microarray) для картирования полного набора точек репликации у дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Их геном также состоит из небольших кластеров, которые содержат по нескольку точек (origins), которые обладают свойствами скоррдинированного времени репликации. Итак, контроль времени репликации осуществляется на региональном уровне, координацией множественных источников репликации.
Время ракликации, установленное для индивидуальных генов, с помощью изолированного BrdU-мечения ДНК в клетках из разных стадий S фазы и анализа специфических последовательностей показало, что рано реплицирующиеся гены концентрируются во фракциях из начинающихся S фаз,тогда как поздно-реплицирующиеся последовательности обнаруживаются только в BrdU-меченных ДНК из клеток поздних стадий S фазы.
Анализ многих генов показал, что имеется четкая корреляция между экспрессией и временнем ранней репликации, но эти взаимоотношения не абсолютны. Анализ микромассивов Drosophila melanogaster показал, что в отличие от большинства генов, есть и те, которые безусловно являются активными последовательностями и которые локализуеются в поздно-реплицирующихся регионах, также как и неактивне гены, которые реплицируются рано в S фазе. Время репликации является субъектом онтогенетической регуляции. Гены домашнего хозяйства, которые транскрипбируются постоянно, напр.,подвергаются репликации относительно рано в S фазе, тогда как многие ткане-специфические реплицируются поздно в большинстве типов клеток, но начинают реплицироваться рано в экспрессируемых тканях.
В отличие от высших организмов не существует общей корреляции между временем репликации и экспрессией генов у S. cerevisiae, но некоторые репрессированные гены локализуются в субтеломерных областях, которые реплицируются поздно в S фазе. HML и HMR гены типов спаривания являются хорошим примером этого феномена. Хотя постоянно молчащие в своей теломерной позиции, эти же самые последовательности, активно экспрессируемые, когда они копированы в early-replicating mating-type (MAT) локус на той же самой хромосоме
Т.к. репликация ДНК, по-видимому, регулируется на региональном уровне, интересно, как эти топографические паттерны меняются для онтогенетически регулируемых генов. Использование fluorescence in situ hybridization (FISH) для визуализации специфических полседовательностей в интерфазных ядрах несинхронизированых клеток выявляет недореплицированные локусы в виде двух отдельных точек в диплоидных клетках, тогда как реплицированная ДНК характеризуется двойными сигналами (Рис. 2a). Высокий процент двойных точек в S-фазных ядрах указывает на раннюю репликацию, тогда как многочисленные одиночные сигналы характерны для поздней репликации. Этот метод применим и при использовании серии зондов, которые окружают специфические гены, с его помощью м. получить хорошую картину величины каждой репликативной временной зоны.
Анализ гена кистозного фиброза (cystic fibrosis)(CFTR), напр., показал, что последовательность, обычно локализуется в большой поздно-реплицирующейся области хромосомы 7 человека. В активных клетках, однако, домен ~700 kb становится рано реплицирующимся, причем генерируется 'новый' хромосомный мини-диск. Сходный процесс происходит в β-globin локусе, локализованном на хромосоме 11, но в данном случае имеется большая область >1 Mb, которая становится рано реплицирующейся в клетках эритроидных предшественников. Итак, онтогенетический контроль времени репликации также осуществляется региональным способом. Следовательно, хромосомные диски представляют собой базовый, но динамический признак генома, который характеризуется специфической структурой, функцией и свойствами времени репликации.
Asynchronous replication timing
Хотя большинство последовательностей генома экспрессируется одинаково с обоих аллелей, имеется небольшой класс генов, которые транскрипбируются преимущественно с одного аллеля в каждой клетке. В свете строгой корреляции между временем экспрессии и репликации гена интересно определить, реплицируются ли эти гены аллель-специфическим образом.
Genomic imprinting.
Геномный импринтинг является классическим примером асинхронной репликации. В данном случае всегда один родительский аллель экспрессируется преимущественно. Одной из наиболее важных характеристик импринтируемых генов является то, что они всегда организованы в кластеры, которые занимают большие хромосомные домне. Регуляция импринтинга и координация между индивидуальными генами в каждом домене диктуется региональным уровнем посредством центров, контролирующих импринтинг (Box 1).
Хотя точный механизм импринтинга еще не расшифрован, ясно, что каждый индивидуальный аллель должен приобретать EPIGENETIC признак еще в гаметах и что эта дифференциальная структура затем поддерживается автономно в течение последущего развития. Имеются доказательства, что гамет-специфическое метилирование выполняет критическую функцию в этом процессе, но неясно м.ли одни эти модификации объяснить все аспекты импринтинга,по-видимому. и др. эпигенетические факторы м. участвовать.
FISH анализ интерфазных ядер используется для определения времени репликации импринтируемых локусов. Для большинства областей генома, оба аллеля, по-вивдимому, реплицируются скооррдинировано, так что ядра в основном (>85%) обнаруживают или single/single или double/double сигналы для набора аллелей. Но в импринтируемых локусах большинства ядер имеется одиночная точка на одном аллеле и двойные точки на другом, это указывает на то, что один аллелей реплицируется раньше др. (Рис.
2а). Этот паттерн асинхронной репликации является региональным по природе и распространяется на весь импринтируемый домен.
Хотя нет прямых доказательств, что время репликации само по себе влияет экспрессию импринтируемых генов, имеется однако косвенное указание, что оно важно. С помощью FISH было показано, что parent-of-origin-specific время репликации предопределяется ('set up') примерно в мейозе и поддерживается в течение остального развития и затем стирается во время следующего раунда гаметогенеза. Это эпигенетическое свойство, следовательно, удовлетворяет всем критериям первичного признака импринтинга (Box 1). Время асинхронной репликации контролируется с помощью тех же самых регуляторных центров, которые предопределяют паттерны импринтированного хроматина и экспрессию двух алллей, это указывает на то, что это в самом деле интегральная часть процесса импринтинга на ширину всего домена.
X-chromosome inactivation.
Др. форма моноаллельной экспрессии представлена X-CHROMOSOME INACTIVATION у самок млекопитающих. В этом процессе, одна X хромосома в каждой клетке выбирается случайно для инактивации у поздних бластоцистов и эта инактивация затем поддерживается клонально в течение остального развития. Как результат, каждая соматическая клетка имеет только одну активную Х хромосому. Этот процесс управляется in cis из X-INACTIVATION CENTRE (Xic), который ответственен за ряд молекулярных событий, включая синтез X-inactivation specific transcript (Xist) и эпигенетические изменения всей хромосомы, которые касаются структуры хроматина, метилирования ДНК и времеми репликации. Хотя внутренние взаимооношения между этими эпигенетическими признаками недостаточно ясны, однако, очевидно, что eсли временной сдвиг к поздней репликации является одним из первых онтогенетических изменений, которые ассоцированы с процессом инактивации, который происходит рано, за несколько дней до de novo метилирования у мышей.
Allelic exclusion.
Помимо последовательностей на X хромосоме и некоторые др. гены такж м. обнаруживать слдучайный паттерн моноаллельной экспрессии. В таких случаях, которые включают гены иммунной системы и обонятельных рецепторов, регуляционный процесс также регионален и характеризуется асинхронной репликацией. Оба аллеля реплицируются синхронно на ранних стадиях эмбриогнеза, но во время имплантации один аллель становится рано реплицирующимся, а др. поздно реплицирующимся в каждой индивидуальной клетке. Этот паттерн поддерживается клонально в течение развития с остцовским аллеем реплицирующимся ранов в некоторых клетках и поздно в др.
Гены immune-system-receptor являются хорошим примером того, как эпигенетический признак м. влиять на функцию. Во время лимфоидного развития локусы, обозначенные B- и T-клеточыне рецепторы, подвергаются перестройке с помощью механизма, генерирующего репертуар B- и T-клеточных рецепторов. Они делают это путем выбюора индидуальных variable (V) и diversity (D) генов из мультигенного кластера, при этом собирается специфическая молекула иммуно-рецептора (Рис. 2b). Деметилирование и открытие хроматина необходимы, чтобы сделать эти области доступными для механизмов (machinery) перестройки и появляются сначала только на одном аллеле в каждой клетке. Это м.б. одним из ключевых механизмов для осуществления ALLELIC EXCLUSION. В большинстве примеров это первое событие перестройки происходит в рано реплицирующемся аллеле (Рис. 2b), это указывает на то, что это решение действительно запрограммировано в локусах иммунно-рецепторов в раннем развитии.
Обоняние еще одна система, которая использует выбор в каждой клетке единственного кандидата из мультигенного ряда. Более чем 1,000 индивидуальных генов обонятельных рецепторов организованы в многичисленные кластеры, которые разбросаны по всему геному. В каждом обонятельном нейроне, однако, только один ген действительно экспрессируется на его поверхности. Это осуществляется с помощью сложного процесса, который стохастически выбирает одиночный ген из онтогенетически предетерминированного кластера и только один родительский аллель, материнский или отцовский экспрессируется в каждой клетке. Хотя механизм подобного типа аллельного исключения неизвестен, но следует иметь в виду, что все локусы обонятельных рецепторов подвергаются случайной асинхронной репликации и это м. отражать унаследованные отличия между двумя аллелями в каждой клетке. Выбор между сцепленными с Х генами зеленого или красного пигментов в клетках колбочек сетчатки м. действовать сходным образом. Итак, рчевидно, что время асинхронной репликации отражает базовые отличия в структуре хроматина между двумя аллелями. Этот эпигенетический маркер закладывается в раннем развитии, поддерживается клонально и м. затем использоваться как механизм аллельного исключения во время терминальной дифференцировки.
N/r/ многие области генома подвергаются случайной асинхронной репликации, то интересно определить, является ли этот процесс скоординированным и если да, то как? Проанализировано несколько регионов в отношении времени репликации в моноклональных линиях клеток. 4 индивидуальных маркера, которые разбросаны по всей длине хромосомы 6, все они реплицировались скоординированным образом; у некоторых клонов все 4 маркера реплицировались рано с материнских аллелей, тогда как в др. все 4 маркера реплицировались рано с отцовских аллелей.Асинхронно реплицирующиеся области на др. хромосомах также обнаруживали внутреннбюю координацию, но разные хромосомы вели себя независимо. Эти данные указывают на то, что каждая аутосома м. иметь один или несколько центральных контролирующих элементов, которые функционируют, координируя несколько асинхронно реплицирующихся доменов in cis, образом, который сходен с Xic.
Cis-acting regulatory sequences
Хотя время репликации в любых геномных последовательностях, по-видимому, является функцией как времени firing, так и расстояния от ближайшего источника — однако, поздняя репликация м. происходить из рано-firing источников — эти элементы сами по себе не выполняют обычно какой-либо функции в действительной раскладке времени репликации. У дрожжей, почти все authentic источники репликации идентифицированы и некоторые проанализированы генетически. При перемещении поздно-реплицирующего источника прочь из его субтеломерной позиции, он становится способным инициировать репликацию в ранней S фазе. Напротив, помещение рано-реплицирующего источника вблизи теломеры автоматически приводит к тому, что он начинает действовать(fire) поздно в S фазе, как в клетках дрожже. так и человека.
Эти эксперименты четко указывают на то, что время репликации управляется с помощью cis-действующих элементов, которые м. осуществлять контроль поверх последовательностей источниклов, которые расположены с области их влияния способом, который возможно сходен с тем, как энхансеры активируют промоторы генов. Т.к. многие из поздно реплицирующихся областей в геноме дрожжей действительно являются субтеломерными, то очень возможно, что последовательности в самих теломерах очень важны. В самом деле, исследования с эписомными плазмидами показали, что что даже короткие C1–3A участки м. управлять поздней репликацией из тестируемого источника. Более того, генетические экспреименты показали, что это м.б. обусловлено белками, связанными с теломерами Kuи Sir3. В противоположность этой сравнительно простой системе поздней репликации из множественных источников, 130-kb не-теломерная область S. cerevisiae хромосомы XIV управляется комбинацией, по крацней мере трех сиквенс-элементов, которые, по-видимому, работают сочетанно.
Источники репликации в клетках животных также являются субъектом онтогенетического контроля. Локусы β-globin мыши и человека, напр., подвергаются двунаправленной репликации с последовательностей источника, который расположен выше β-globin
гена. Тот же самый источник используется как в не-эритроидных клетках, которые реплицируют эту область поздно в S фазе, так и в эритроидных клеткахЮ в которых локус подвергается репликации в ранней S фазе. Эксперименты с клетками человека от пациенторв с hispanic thallassaemia указывают на то, что этот процесс регулируется с помощью цис-цействующих последовательностей, которые локализованы внутри 40 kb, окружающих surrounding the LOCUS CONTROL REGION (LCR). Показано, что время репликации в этой области контролируется с помощью нескольких индивидуальных элементов как внтри, так и вне LCR.
Очевидно, что ни ранняя, ни поздняя репликация не является привычным состоянием в данном локусе. Скорее, LCR оперирует подобно переключателю, который м. управлять доминантно или ранней репликацией в эритроидных клетках или поздней репликацией в др. тканях. Это конечно же обеспечивается ткане-специфическими trans-действующими факторами, т.к. введение обычно поздно-реплицирующегося β-globin локуса в эритроидную среду достаточно для запуска ранней репликации во всей области. Тот факт, что LCR является мультифункциональным эффектором, который ответственен за онтогенетическую регуляцию генной экспрессии, структуру хроматина и время репликации указывает ясно, что все эти параметры непосредственно связаны и центрально контролируются.
Control of replication timing
Процесс определения времени репликации, по-видимому, связан с тремя ключевыми компонентами: эпигенетическое предопределение источников как ранних или поздних; использование белковых факторов, регулирующих клеточный цикл, чтобы активировать источники в соотв. время в S фазе; и система CHECKPOINT генов, которые гарантируют своевременность программы репликации в соответствии с планом.
Epigenetic marking of replication origins.
Хотя репликация сама по себе происходит исключительно во время S фазы, программирование этого процесса начинается на ст. G1 sклеточного цикла, когда любой из источников компетентен к запуску через формирование пре-репликативного комплекса. Тот факт, что это м.б. осуществлено только в G1 является важным аспектом контроля репликации, т.к. он гарантирует, что каждый источник будет использован только однажды в каждом цикле. Сходным образом, инструкции по предопределению времени, когда каждый из источников буде использован в S
фазе, также обеспечивается во время G1. Так, у дрожжей, в которые вносили recombinase распознающие последовательности, чтобы фланкировать поздно-реплицирующиййся источник, который расположен рядом с толомерой, индукция рекомбиназной активности в специфическое время приводила к тому, что фрагмент с источником высвобождался из теломерных регуляторных последовательностей в разные предтерминированные моменты клеточного цикла. Появление рекомбинации после того, как клетка пройдет через первые несколько часов G1, проявится продукцией эписомальных ДНК фрагментов, которые уже предетерминированы реплицироваться поздно в S фазе. Напротив, отсоединение до G1 обусловливает потрею контроля и возникающие плазмиды будут ревертировать к ранней репликации. Эти результаты указывают на то, что cis-действующие последовательности необходимы в ранней G1, чтобы настроить временной профиль репликации, как только это произойдет, эти элементы больше не нужны (Рис. 3).
:bdЖивое клетки м. использовать сходную стратегию для контроля времени репликации. Меченные ядра их животных клеток помещали в экстракты яиц Xenopus, причем ядра из клеток в поздней G1 фазе подвергались ранней и поздней репликации в соответствии с их предварительно запрограмиированным расписанием. Напротив, ядра, которые еще не прошли через критический момент timing decision point (TDP) в начале G1 были неспособны осуществлять организованную по времени репликацию.
Различия во времени репликации, по-видимому, ассоциированы с основными вариациями в организации ядер. Ранняя репликация всегда происходит в определенных локусах, которые разбросаны по всему интерфазному ядру. Напротив, репликация в средне S фазы ассоциирована с периферией ядра, тогда как фокусы поздней репликации колокализуются с HETEROCHROMATIN. Очевидно, что эти структурные свойства, по-видимому, закладываются вместе с временными профилями репликации в ранней G1 фазе. Правда, нет прямых доказательствЮ что установление времени репликации обеспечивается с помощью реструктуирования ядра, которе происходит после каждого прохождения клетокой митоза. В самом деле, как показано на жрожжевых и животных клетках, однажды будучи заложенными инструкции о времени репликации остаются фиксированными yeast, даже если происходят изменения в позиции ядрышек.
Локальная структура хроматина м. также участвовать в детерминации времени репликациию, У дрожжей, напр., рано реплицирующие источники, по-видимому, упакованы вместе с ацетилированными гистонами, тогда как поздно-реплицирующие источники являются частью деацетилированной структуры. Более того, когда HISTONE ACETYLTRANSFERASE (HAT) поставляется искусственно в источники поздной репликации, то этого достаточно для сдвига события репликации к более раннему времени в S. В животных клетках, воздействие ингибитора histone deacetylase также затрагивает время репликации в специфических локусах.
Эти исследования показывают, что ацетилирование гистонов является оддним из эпигенетических маркеров, которые управляют временем репликации, хотя и др. события, включая метилирование ДНК, также м.б. важными в этом процессе.
<
Activation and regulation of origin firing.
На следующей ступени контроля времени репликации сигналы, которые маркируют источники репликации как ранние или как поздние, д.б. считаны и интерпретированы во время S фазы. Оценка с помощью др. процессов, контролирующих клеточный цикл, м. потребовать создания градиента over time и белковых факторов, которые м.б. распознавать предетерминированный эпигенетический паттерн, который создается во время G1 (Рис. 3). Показано, что циклины сами по себе участвуют в контроле времени репликации. Так, у дрожжей, напр., B cyclin Clb5 специфически необходим для репликации поздних источников, а в его отсутствие весь геном копируется, используя исключительно рано-действующие источники. Rad53 и Mec1, по-видимому, используются для координации нормальных процессов контроля времени репликации за счет задержки начала действия поздних источников вплоть до тех пор, пока раннеие репликоны не закончат свой процесс элонгации. Это важный компонент механизма intra-S-phase checkpoint.
Effect of replication timing on gene
expression
Имеются доказательства того, что временной паттерн репликации по всему геному регулируется независимым и запрограммированным образом и не вызывает вторичных следствий на экспрессию гена. Возникает вопрос, м. ли само время репликации влиять на транскрипцию. Согласно модели 'window of opportunity' репликация вызывает нарушение структуры хроматина и как результат создаются уникальные возможности для ядерных факторов взаимодействовать непосредственно с последовательностями ДНК, влияя при этом на компетентность к транскрипции. Т.к. белковая среда в ядре определенно изменяется по ходу S фазы, то время репликации д. играть критическую функцию в установлении профиля экспрессии генома.
Базовым допущением в этой модели является то, что репортерные гены д. транскрипбироваться более эффективно, если вносятся в ядро в ранней S-фазе, в противоположность поздней S-фазе. Проверка показала, что репортерные гены, инъецируемые в ядра в ранней S-фазе, почти в 10 раз более активны транскрипционно, чем внесенные в поздней S-фазе. Однажды установившись, это состояние транскрипции остается стабильным, если клетка продолжает cycling. Сходные результаты получены с различными промоторными последовательностями, этот эффект возможно не м.б. отнесен к вовлечению транскрипционных факторов. Известно, что эта S-фазная специфичность вероятно обеспечивается структурой хроматина. В самом деле, CHROMATIN IMMUNOPRECIPITATION (ChIP) анализ показал, что рано инъецированная ДНК пакуется в хроматин, который содержит ацетилированные гистоны, тогда как поздно-инъецируемые матрицы являются недоацетилированными.
Имеются доказательства, показывающие корреляцию между ранней репликацией и открытой структурой хроматина, на что указывает чувствительность к DNase I sensitivity и ацетилирование гистонов. Показано, что время самой репликации м. играть роль в установлении этого патерна по всему геному. Механизм этого процесса д. использовать histone deacetylase HDAC2, которая, как было показано, локализуется исключительно в фокусах late-S-phase репликации. Итак, хотя все вновь реплицированные ДНК м.б. упакованы первоначально за счет ацетилированного гистона H4, нуклеосомы, которые собираются в поздней S фазе д.б. специфически деацетилированы. Учитывая, что программа replication-timing перенастраивается автоматически в начале каждого клеточного цикла, то это м. означать простую систему поддержания состояний хроматина в делящихся клетках (Рис. 4).
Role of replication-timing control
D отличиВ от генома простых организмов, у которых почти все гены экспрессируются повсеместно, геном животных содержит многочисленные генетические последовательности, которые репрессированы в большинстве типов клеток. Этот процесс контролируется сложным образом с помощью комбинации сиквенс-специфических и глобальных репрессирующих механизмов. В случае метилирования ДНК, напр., все не-CPG ISLAND последовательности метилируются аптоматически рано во время развития независимо от их последовательностей. Этот паттерн приводит к закрытой конформации хроматина, которая м. передаваться из поколения в поколение посредством полу-консервативного поддерживающего механизма. Очевидно, что время репликации ДНК м. работать сходным образом. Области, которые содержат конституитивно активные гены, запрограммированы к ранней репликации, тогда как остальной геном реплицируется позже, причем создается глобальный паттерн репрессии, который м.б. регенерирован во время каждого клеточного цикла. Более того, время репликации м. также регулироваться и, такими образом, позволяется ткане-специфическим генам подвергаться запрограммированной активации во время развития.
Perspectives
Имеются три потенциальных пути поддержания репрессии генов в делящихся клетках. Во-первых, наиболее прямой механизм является генетическим по природе и использует сиквенс-элементы ДНК, которые функционируют, поставляя trans-действующие факторы в специфические регионы генома после каждого раунда репликации. Во- вторых,
метилирование ДНК, которое ингибирует экспрессию генов, изменяя структуру хроматина, это полу-генетический механизм; т.к. он не базируется целиком на информации о последовательностях, а использует ковалентные изменения в структуре ДНК. В-третьих, контроль времени репликации, по-видимому, представляет собой др. механизм для поддержания функциональных состояний путем управления реструктуированием хроматина после репликации ДНК. Этот путь настоящий эпигенетический, однажды возникнув он полностью независим от локальных последовательностей ДНК.