RECOMBINATIONAL REPAIR AND RESTART OF DAMAGED REPLICATION FORKS
Peter McGlynn (peter.mcglynn@nottingham.ac.uk), Robert G. Lloyd Nature Reviews Molecular Cell
Biology3, No 11, P. 859-870 (2002)
Genome duplication necessarily involves the replication of imperfect
DNA templates and, if left to their own devices, replication complexes
regularly run into problems. The details of how cells overcome these
replicative 'hiccups' are beginning to emerge, revealing a complex
interplay between DNA replication, recombination and repair that ensures
faithful passage of the genetic material from one generation to the
next.
(Рис.1.) | Potential types of replication-fork damage.
(Рис.2.) | Restarting DNA replication by junction cleavage.
(Рис.3.) | Restarting DNA replication without cleavage.
(Рис.4.) | PriA-directed reloading of the replication machinery.
(Рис.5.) | Potential mechanisms of replication restart.
Способность клеток реплицировать миллионы пар оснований ДНК во время каждого деления явлется одним из чудес биологии. Точность, с которой это осуществляется также поразительна, она гарантирует аккуратную передачу генетического кода. Однако, удвоение генома, хотя и аккуратно и высоко производительно, нуждается в тесном взаимодействии с рекомбинацией и репарацией ДНК. В самом деле, основной функцией рекомбинации является удвоение генома. Репликационная кухня (machinery) часто наталкивается на загарждения ('roadblocks'), которые обладают потенциалом останавливать репликацию. Эти блоки возникают из-за повреждений внутри или на ДНК матрице и являются потенциально летальными, если они препятствуют завершению репликации.
Недавние исследования на Escherichia coli с помощью инактивации белка — который, как полагают участвует только в сборке репликационной вилки — привели к заключению, что 18% клеток нуждаются в перезанрузке репликационной вилки во время одного раунда удвоения хромосомы в отсутствие каких-либо внешних повреждающих ДНК агентов. Други подсчеты дают уровень до 50%. Частота репарации репликационной вилки у эукариот еще менее определена, но, уитывая большие размеры генома и присутствие множественных вилок, репликативные проблемы м. возникать не менее часто, чем у бактерий.
Важная роль рекомбинации в цикле репликации бактериофага T4 и ее вовлечение в специфические типы репликации эукариотической и прокариотической ДНК известна давно, но ее значение в нормальном удвоении хромосом полностью неизвестно.
Генетические исследования, в основном на бактериях и дрожжах,пролили свет на взаимодействия между репликацией и рекомбинацией ДНК.
Potential sources of replication-fork
blockage
Все клетки обладают многочисленными системами, которые вырезают и замещают поврежденные нуклеотиды. Эти системы эксцизии минимизируют частоту, с которой репликационная кухня (machinery) сталкивается с повреждениями нуклеотидов. Однако, некоторые повреждения остаются нерепарированными влоть до прибытия .
Некоторые повреждения оснований заставляют репликативную полимеразу включать неправильные нуклеотиды, вызывая точковые мутации в ДНК (Рис. 1a). Др. повреждения или пробелы в остове ДНК м. блокировать продвижение реплисомы и м. б. летальными, если в дело не вмешивается повторный старт репликации (Рис. 1b). Пробелы м. также приводить к потере одного из плеч вилки, тогда свободный дуплексный конец ДНК (Рис. 1c), который должен быть субстратом для рекомбинационных энзимов м. провоцировать несоответствующую рекомбинацию, приводя к хромосомным перестройкам. Однако, частоты с которыми пробелы попадаются репликационой кухне, неясны, а генетические исследования на E. coli показывают, что такие события редко встречаются в клетках, облученных УФЛ.
Аддукты белок-ДНК, ассоциированные с нормальным метаболизмом, также м. составлять препятствия для репликации. Транскрипция обычно происходит конкурентно с репликацией и учитывая, что репликация на порядок величby быстрее, чем транскрипция, коллизии неизбежны. ДНК полимераза бактериофагов м. переступать через остановившуюся или транскрибирующуюся РНК полимеразу у E. coliin vitro, но полимеразы, которые действуют в более сложных репликационных вилках м. и не обладать такой способностью. В самом деле, генетические доказательства указывают на то, что коллизии ведут к остановке и разрывам репликативных вилок и у прокариот и у эукариот.
Важность удаления РНК полимераз, которые остановились на месте повреждения транскрипбруемой ДНК подчеркивается наличием системы энзимов, которые удаляют РНК полимеразы и облегчают репарации исходных повреждений ДНК. Др. физиологически нормальные комплексы белок-ДНК, такие как нуклеосомы и транскрипционные факторы, свфзанные с местом впереди вилки, также м. задерживать продвижение репликационной вилки. Вторичные структуры, включая повторы триплетов, в ДНК также м. ингибировать продвижение вилки.
What does a damaged replication fork look
like?
Разные блоки вызывают разного типа повреждения репликационной вилки; это подчеркивается потребностями в recombination- и repair-генах, имеющих дело с воздействиями разных ДНК-повреждающих агентов.
Должна иметь место непрерывнаяи в противоположность прерывистой природе синтеза leading- и lagging-нити (Box 1). Блоки матричной lagging-нити м.б. преодолены за счет повторного запуска синтеза ниже блока, это будет приводить к тому, что повреждение однонитчатого пробла будет репарировано позденее с помощью рекомбинации с интектным сестринским дуплексом (Рис. 1d). Такой мехенизм призначется всеми, хотя убедительные доказательства отсутствуют, Повреждения в матричной leading-нити м. представлять собой большие препятствия, т.к. повторный синтез РНК затравок для запуска синтеза ДНК, как полагают, не происходит на матричной leading-нити. Однако, доказательства неспособности повторного запуска синтеза ДНК на опережающей (leading) нити получены в основном в экспреиментах in vitro, тогда как некоторые исследования in vivo указывают на то, что синтез на опережаюющей нити м. происходить прерывисто, также как и в случает синтеза на отстающей нити. Несмотря на это, суть в том, что любой блок полимеразы на опережающей нити будет останавливать репликацию из-за неспособности запуска синтеза ДНК ниже блока.
Наблюдали блокаду синтеза и опрежающей и отстающей нити в бесклеточных экстрактах от человека на ДНК, которая содержит в матричной опережающей нити. Однако, синтез запаздывающей нити становился независимым (uncoupled) от синтеза опережающей нити и продолжался за пределами конца опережающей нити, чтобы создать вилку, в которой опережающая нить смещена от точки разветвления (Рис. 1e). В др. исследовании с использованием препрограммированного блока репликационной вилки в (rDNA) Saccharomyces cerevisiae, в котором вилки, которые приближаются с одного направлния останавливаются в специфических последовательностях. Очень мало single-stranded DNA (ssDNA) присутствует в блокированной вилке. Более того, 5' конец запаздывающей нити распространяется на три нуклеотида далее 3' конца опережающей нити.
Однако, это м.б. специфическим свойством блока rDNA. Репликационные вилки E.coli, которые останавливаются на белок-ДНК комплексе — препрограммированном блоке, который гарантирует конвергенцию репликативных вилок внутри небольшой области циркулярной бактериальной хромосомы по завершенибю репликации — имеют разную структуру. Синтез опережающей нити держит соседнюю в Tus–ter, тогда как финальные затравки запаздывающей нити располагаются между 50 и 70 нуклеотидами, выше блока, который покидается матричными запаздывающими нитями в виде одннитчатой вилки. Эти примеры подчеркивают одрно возможное отличие меду типами повреждений — что повреждение, затрагивающее одну матричнцю нить, но не др., м. блокировать полимеразу, но не всю вилку, возможно блаогодаря прохождению (progression) вторичной полимеразы. Однако, блок rDNA и Tus–ter комплекс, как полагают, м. выступать как 'brick walls', который не м.б. преодолен любой частью репликативной кухни (machinery).
Судьба репликационных белков в остановившейся вилке также важна для понимания природы повреждений вилок. Любое смещение этих белков будет вызывать поребность в из повторной загрузке. В самом деле, если ДНК полимераза и теряют связь, то перезагрузка реплисом м.б. важной. Напротив, v/ оставаться связанной с дочерними нитями поврежденных вилок и препятствовать полной диссоциации реплисомы. Какие блеки необходимы для перезагрузки на поврежденной вилке, неизвестно, но картина м. отличатья в зависимости от природы блока.
Possible solutions to replication-fork damage
Независимо от своего происхождения репликативный блок или устраняется или преодолевается и репликация м. стартовать вопторно. Устранение блока указывает на то, что существует соответствующая система репарации, но она неспообна действовать на повреждение, пока его не достигенет реплисома. Напротив, преодоление блока необходимо для тех повреждений, которые не м.б. репарированы, или из-за недоступности репаративной системы или из-за того, что репаративная система не м. действовать на повреждение из-за остановившейся репликационной вилки.
Удаление белкового блока, который не связан с повреждением ДНК, м. б. достигнуто легко в ДНК, которая не подвергается репликации. Это потому, что не происходит потери генетической информации, так что интактная комплементарная нить не нужна для репарации повреждения. Итак, проблема м.б. только в одном, в повторном старте репликации. Однако, реплисома м. скорее принять паузу — скорее, чем остановиться необратимо — и возобновить репликацию, когда белковый блок будет устранен.Примеры этого м. включаить коллизии между реплисомой и РНК полимеразами, нуелеосомами или др. физиологически нормальными белок-ДНК комплексами.
Мало информации о природе или частоте таких событий. Возможно потому, что блоки временны, а рекомбинация или репаративные белки необязательны для их преодоления. Однако, такие блоки м.б. источником феноитипа медленной репликации у мутантов E. coli rep, базирующихся на способности Rep разрывать белок-ДНК взаимодействия in vitro (Табл. 1). Геликаза S. cerevisiae также участвует в подержании продвижения вилки через белок-ДНК комплексы, а – (Williams syndrome transcription factor–imitation switch protein) хроматин-ремодулирующий комплекс позвоночных м.б. необходим для разрушения , чтобы облегчить репликацию.
Химические повреждения матричнрой ДНК являются столь же значительной проблемой. Некоторые типы вовреждений нуклеотидов — такие как УФЛ-индуцированные пиримидиновые димеры — м. останавливать репликацию, предупреждая инкорпорацию нуклеотидов с помощью обычно репликативной полимеразы. Др., такие как поперечные связи между нитями двух матриных нитей, м. останавливать продвижение репликативной геликазы. Если повреждение ДНК не репарируется до достижения его репликативной вилкой, то повреждение м.б. замаскировано с помощью репликативной machinery и вызывать преблему.Репликативные вилки, которые остановлены in vitro сохраняют свою способность возобновалять репликацию по истечении нескольких мин., и тем самым доступ систем эксцизионной репарации м. б. ингибирован, несмотря на то, что репликационные энзимы удалены из повреждения. Сходным образом, транскрипция с помощью РНК полимераз также м.б. ингибирована повреждениями в транскрипбируемой нити, из-за превращения повреждния ДНК в стабильное белковое заграждение, которое м. остановить продвижение репликативной вилки.
Специализированные ДНК полимеразы м. инколрпорировать нуклеотиды в оппозитные сайты повреждения ДНК, которое блокирует нормальную репликативную полимеразу. Такое 'преодоление' — или 'translesion' — осуществляется за счет полимеразного синтеза ДНК нитей, распространяющихся на место поврежденных нуклеотидов матрицы, и затем за счет нормальных репликативных полимераз, реиницирующих синтез ДНК. Однако, скорости misincorporation этими translesion полимеразами в целом выше, чем скорости нормальных репликативных полимераз.
Рекомбинация обязательна для репарации поврежденнфх репликационных вилок, т.к. она снижает риск мутагенеза с помощью bypass полимераз. Рекомбинационные энзимы используют присутствие двух сестринских дуплексов, продуциремых с помощью (поврежденной) репликативной вилки, чтобы осуществить репарацию и вторичный старт. Ключевой промужуточной структурой в возобновлении работы остановившеся вилки считается четерехнитчатая ДНК (Holliday) соединения. Это соединение образуется за счет разворачивания остановившейся вилки так, что вновь синтезируемые нити отжигаются (anneal), а родительские нити reanneal (Рис. 2a).
Популярность модели с участием Holliday junction intermediates обусловливается генетическими и in vitro биохимическими исследованиями у бактерий и эукариот и тем фактом, что они прекрасно демонстрируют, как взаимодействуют энзимы репликации и рекомбинации, чтобы поддержать удвоение хромосом. Holliday junctions, образующиеся в результате остановки репликативной вилки, наблюдаются непосредственно с помощью ЭМ, хотя неясно как часто такие структуры возникают в клетках дикого типа при физиологических условиях. Желательны прямы доказательства образования Holliday junctions из остановившихся вилок в клетках дикого типа. В самом деле, вилки, остановившиеся в естественно возникших последовательностях, заканчивающих репликацию, в противоположность случаным остановкам, м. и не развертываться для образования Holliday junctions.
У E. coli образование Holliday junctions, как полагают, происходит тогда, когда репликация останавливается дефектами репликативных энзимов или когдаклетки подвергаются действию ДНК-повреждающих агентов, таких как УФЛ. Последующий процессинг этих соединений м.б. критическим для поддержания продвижения вилки, т.к они м. обеспечить пути образования ДНК структур, которые делают возможной последующую загрузку репликативной кухни (machinery). хотя молекулярные детали того, как Holliday junctions м. облегчать репликацию через места повреждения ДНК, все еще неясны, генетика и энзимология белков, которые формируют и меняют Holliday junctions у E. coli, м. пролить свет на то, как м. осуществляться повторный старт репликации (Табл. 1).
Restart by Holliday junction formation
Holliday junctions? формируемые разворачиванием остановившихся репликационных вилок обозначаются также как 'chicken feet'. Они, по-видщимому, подвергаются процессингу одним из двух путей у E. coli — они или вырезаются из двух оппозитных нитей в точке разветвления соединения с помощью helicase/endonuclease комплекса, а пробелы потом устраняются ДНК лигазами, или они подвергаются процессингу, не связанному с участием расщепления. Вырезание Holliday junction, по-видимому, необходимо для нового старта репликации, когда повреждения затрагивают обе нити матричной ДНК, тогда как однонитчатые повреждщения м. б. преодолены без вырезания.
Restart by cleavage.
Предложены две модели для объяснения порядка вырезания и событий рекомбинации на Holliday junction, образованных остановившейся репликационной вилкой. Одна возможность заключается в том, что концы double-stranded DNA (dsDNA), которая разматывается с junction, рекомбинируются обратно в хромосому с помощью бактериального рекомбинационного белка , чтобы сформировать (Рис. 2b). Эта D-петля должна затем быть найдена, которая благодаря серии межбелковых взаимодействий способна снова загрузить актитвную реплисому на ДНК. Вырезание с помощью RuvABC — из оригинального Holliday junction, сфоримрованного остановившейся вилкой, и из Holliday junction, сформированного на D-петле — должно затем удаляться соединение между двумя сестринскими дуплексами позади восстановленной реплисомы (Рис. 2d).
Или альтернативно, Holliday junction на остановившейся вилке будет вырезаться с помощью RuvABC до того как DNA конец будет рекомбинирован обратно в хромосому (Рис. 2e). Это позволит высвободить одно из сестринских dsDNA плеч в виде свободного конца ДНК (Рис. 2f), которое м. затем рекомбинировать обратно в хромосому путем образования D-петли (Рис. 2g). Вырезание Holliday junction, образованного D-петлей и повторная загрузка репликативной machinery будет восстанавливать активную репликационную вилку (Рис. 2h). В обеих моделях,структура RuvABC комплекса м. также гарантировать, что вырезание Holliday junctions будет минимизировать проблемы расхождения хромосом после завершения репликации.
В обеих моделях потребность в рекомбинации dsDNA конца, который смотан с вилки, указывает на то, что несоответствующая рекомбинация между dsDNA концом и повторяющимися последовательностями где-либо в геноме возможна. Однако, модели оиличаются по времени вырезания Holliday junction, которое зависит от разматывания (unwinding) вилки. Первая модель (Рис. 2b–d) не предсказывает, что одна из сестринских хроматид будет высвобождаться как свбодная dsDNA, тогда как вторя модель предсказывает это (Рис. 2e–h). Высвобождение свободного dsDNA конца м. увеличивать возможность неаккуратной рекомбинации. К несчатью, т.к. эти модели базируются на анализе мутантных линий, то не совсем ясно, любой или оба механизма используются клетками дикого типа.
Независимо от времни устранения Holliday junction не совсем ясно, как рекомбинация посредством образования Holliday junction на остановившейся вилке м.б. использована для репарации или преодоления репликативного блока. Генетический анализ показывает, что RuvABC является важным для репарации репликационной вилки, останавливаемой повреждением обеих нитей матрицы (таким как поперчные связи между нитями) или остановкой РНК полимеразы. RuvABC, по-видимому, необходим для работы с блоками, которые держат репликацию обеих и опережающей и запаздывающей (leading and lagging) нитей.
В обоих механизмах. описанных выше событие рекомбинации (Рис. 2b,g) происходит выше исходного блока. Так, если блок остается, то восстановленная реплисома м.б. задержана на блоке второй раз. Единственная возможность, что размотанная остановившаяся вилка позволит репликативной machinery убраться с блока прочь, чтобы облечить последующую репарацию. В этой модели, событие рекомбинации д. функционировать только обеспечивая структуру D-петли для посторной загрузки реплисомы с помощью .
Возможно, однако, что рекомбинация непосредственно облегчает преодоление блока. Хотя E. coli имеет одиночную циркулярную хромосому, часто имеется множество копий хромосомы к влетке. Так, dsDNA конец, который образуется благодаря Holliday junction, м. осуществлять обемен нитями с др. копией хромосомы. Это делает возможным продолжение репликации поврежденной хромосомы благодаря использованию несозревшей копии в качестве матрицы для репликации позади места блока. Однако, это предположение ставит проблему наличия репликативной вилки, восстановленной на др. копии хромосомы. Реплицированная dsDNA должна быть повторно инкорпорирована в исходную хромосому, чтобы сформировать интактную циркулярную копию генома.
Could such mechanisms be used in eukaryotes? Holliday junction структуры выявлены в rDNA локусе S. cerevisiae во время S фазы, и они м.б. сформированы с помощью развернутой репликативной вилки, которая остановлена известным блоком в rDNA.
Образование этих структур коррелирует с усиленными уровнями рекомбинации. Клетки S. cerevisiae, которые дефектны по репликации отвечают также накоплением Holliday junctions в репликативных вилках и это коррелирует с остановкой вилки и разрывом хромосом.
Однако хотя эти корреляции и убедительны у кариот нет прямых доказательств, что остановившиеся репликационные вилки репарируются посредством образования и удаления Holliday junctions. Однакл, специфичные для Holliday junction активности helicase/endonuclease выявлены в клетках млекопитающих. Итак, эукариоты м. иметь активность, аналогичную E. coli RuvABC. Репликационные вилки м. также вобираться на рекомбинационных промежуточных образованиях у эукариот, преимущественно благодаря образованию D-петель. Комплекс , который законсервирован от дрожже до человека, также участвует в выщеплении Holliday junctions, сформированных остановившимися вилками. Частично очищенный Mus81 комплекс из Schizosaccharomyces pombe и человека м. расщеплять синтетические Holliday junctions in vitro. Однако, др. исследования показывают, что Mus81 м. вырезать структуру остановившейся вилки непосредственно скорее, чем находит Holliday junctions, сформированные такими вилками. Незвисимо от того, или Holliday junctions иди структура вилки являются субстратом in vivo для Mus81, этот энзим облегчает выживание S. pombeпосле облучения УФЛ. Mus81 способствует также выживанию клеток, которые имеют дефектную ДНК полимерауз, это подтверждает его роль в репарации оснановившейся репликационной вилки.
Restart avoiding cleavage.
Вырезание из — и рекомбинация с — репликативных вилок посредством формирования Holliday junctions увеличивает риск несоотв. рекомбинации между dsDNA концом, формируемым на вилке (Рис. 2) и гомологичными последовательностями где-либо еще в геноме. Это особенно вероятно у высших эукариот, таких как человек, у которых повторяющиеся или дуплицировнные последовательности составляют 5–7% генома.
Имеются, однако, альтернативные методы процессинга остановившихся репликационных вилок — по крайней мере у E. coli. Свободный dsDNA конец, который образуется при формировании Holliday junction на остановившейся вилке (Рис. 2a) м.б. переварен экзонуклеазами, так что структура вилки будет непосредственно реформирована так, что это позволит повторную загрузку реплисомы. Эта прямая перестройка вилки д.б. лишена риска несоответствующей рекомбинации.
Повреждение одиночной нити матричной ДНК во время репликации м. также репарироваться или преодолеваться, а репликация будет стартовать снова благодаря обнаружению остановившейся вилки геликазой . Это, как полагают, м. б. достигнуто без какого-либо сопровожадеющего выщепления Holliday junction ДНК и оно м. также минимизировать риск ареррантной рекомбинации.
Повреждение одиночной нити м. предоставлять др. проблему, т.к. повреждение м. первоначально затрагивать только одну из полимераз в репликационной вилке. Т.о., одна из вновь синтезированных нитей ДНК м. оказаться длиннее, чем др. Такая проблема возможна, когда блок происходит на опережающей нити, вызывая удлиннение конца запаздывающей нити за границы опрежающей нити (Рис. 1e).
BvtИмеются потенциальные проблемы с такими осановившимися вилками. Во-первых, повреждение д.б. локализованным на ssDNA, так, чтобы комбементарная нить не могла выствупать в качестве матрицы для gjdht;ltybz. И, во-вторых, 3' конец опережающей нити должен быть смещен от точки ветвления вилки, возможно на несколько сотен нуклеотидов. Предполагая, что синтез опережающей нити не м.б. запущен с помощью генерации РНК затравки (primer) как синтез запаздывающей нити, поэтому отсутствие 3'
конца опережающей нимти в вилке будет ингибировать повторный запуск синтеза опережающей нити.
Как RecG м. поступать с блокированными вилками такой природы, показано в исследованиях in vitro, установивших, что RecG м. специфически разворачивать forked ДНК структцры, чтобы сформировать Holliday junctions (Рис. 3a). Более того, предпочтительный forked ДНК субстрат in vitro содержит запаздывающую нить, но не опережающую нить в точке разветвления. Т.о., RecG м. направлять такие вилки, в которых продолжается синтез запаздывающей нити, еще несколько по пути после блока синтеза опережающей нити (Рис. 1b). Разматывание вилки с укороченной опережающей нитью будет приводить к разматыванию удлинненой запаздывающей нити и, в конечном счете, будет достигнута прерванная (recessed) опережающая нить.
Продолжающееся расплетение и опережающей и запаздывающей ритей с помощью RecG будет приводить к отжигу (annealing) двух нитей, чтобы сформировать Holliday junction (Рис. 3b), а данные генетических исследований указывают на то, что Holliday
junction подвергаются процессингу, чтобы восстановить структуру вилки, которая становится пригодной для повторной загрузки реплисомы. Экзонуклеазой обусловленное переваривание увеличеной запаздывающей нити м. устранять разсхождение между обеими нитями (Рис. 3c), так что, если Holliday junction будет расплетено достаточно обратно, чтобы сформировать вилку, то затем 3' конец ведущей нити сменит позицию в вилке, станет готовым к запуску синтеза опережающей нити (Рис. 3d). в матричной ДНК м. способствовать спонтанному раскручиванию Holliday junction, чтобы реформировать вилку. Напротив, экзонуклеазы м. продолжать переваривать опережающую и запаздывающую нити обратно к основанию вилки, удаляя Holliday junction не имея нужды раскручивать его. Однако, хотя раскручивание остановившейся вилки, чтобы сформировать Holliday junction и м. облегчать доступ к (и репарировать) повреждение, но исходный блок все еще д.б. удален, прежде чем репликация будет продолжена (Рис. 3d).
Альтернативная стратегия, известная как template switching м позволить преодолеть блок. 3' конец ведущей нити в Holliday junction, формируемый RecG, м.б. отожжен до удлинненной запаздывающей нити.Эта запаздывающая нить .б. использована как матрица для увеличения длины опережающей нити (Рис. 3e), возможно с помощью индуцируемой ДНК повреждением ДНК полимеразы II. Если образование Holliday junction ревертировано, то реформированная вилка д.б. иметь 3' конец опережающей нити в точке разветвления уже перед запуском возобновленного синтеза опережающей нити (Рис. 3f). Более того, опережающая линия должна теперь продолжиться после исходного блока, так чтобы репликация м. стартовать вновь, оставляя репарацию повреждений на потом.
Образование Holliday junctions с помощью RecG открывает также возможность, что RuvABC находит эти соединения, это приводит в конечном счете к их выщеплению и рекомбинации (Рис. 3g). И RuvAB и RecG м. раскручивать структуру Holliday junction in vitro, так что оба м. находить Holliday junctions in vivo независимо от их происхождения. Обе helicases м., , следовательно, участвовать в некоторых рекомбинационных процессах, в которых возникают Holliday junctions, таких как возможная репарация пробелов запаздывающей нити (Рис. 1d). Более того, синергичное увеличение дефектов репарации ДНК, которе наблюдается у recG ruv двойных мутантов, по сравнению с одиночными мутантами, указывает на то, что RecG и RuvABC представляют собой два альтернативных механизма, имеющих дело с поврежденной ДНК. Клетки м. , следовательно, иметь по крайней мере две специализированные геликазные системы, имеющие дело с разными типами повреждений репликативной вилки.
Alternative ways to unwind stalled forks
Если Holliday junctions, которые обнаруживаются RuvABC, не являются в целом сформированными RecG, то м. ли др. механизмы м. способствовать формированию Holliday junctions на остановившихся репликативных вилках? In vitro в матричной ДНК, как было показано, управляют заскручиванием остановившихся репликационных вилок, чтобы сформировать Holliday junctions. In vivo, области positive supercoiling появляются временно — напр., впереди advancing РНК полимеразы — лобовые коллизии между репликационной и транскрипционной machinery м. приводить к остановке репликационной вилки в positively supercoiled ДНК. Однако, хромосомная ДНК в целом поддерживается в негативно суперскрученном состоянии. RecG м. все еще способствовать раскручиванию вилок в негативно суперскурченных ДНК, но негативное суперскручивание ингибирует спонтанное образование Holliday junctions. Итак, степень, с которой позитивное суперскручивание способствует раскручиванию остановихшися репликативных вилокin vivo неизвестна.
М.б. др. энзиматические средства раскручивания остановившихся репликационных вилок. Формирование Holliday junction субстратов для RuvABC в осановившихся вилках путем ингибирования репликативных геликаз зависит от recA in vivo. Более того, in vitro, на вилке, в которой имеется пробел в ведущей нити (Рис 1e, 3b), RecA катализирует обмен нитей между однонитчатой матричной опережающей нитью и дуплексом запаздывающей нити, в результате формируется Holliday junction.
Геликазы иные, чем RecG м. также катализировать процессинг остановившейся вилки. RuvAB м раскручивать forked ДНК в правом направлении для образования Holliday junction in vitro, хотя она преимущественно раскручивает в противоположном направлении. Однако, процессинг остановившейся вилки не обязательно д. вовлекаться в образование Holliday junctions, если из раскрученных используется только опережающая или запаздывающая нить для облегчения репарациии рестарта репликации. Одним из кандидатов на такой процесс является геликаза, которая участвует в минимизации у E.coli и м. раскручивать различные разветвленные ДНК структуры in vitro. Исследования с мечением In-vivo показали, что RecQ раскручивает (winding back) запаздывающую нить в остановившейся вилке, чтобы обеспечить специфическую деградацию этой нити с помощью RecJ экзонуклеазы. Эта деградация, как полагают, облегчает стабилизацию остановившейся репликационной вилки за счет обеспечения связи на вилке вместе с RecA акцессорными факторами и .
Unwinding stalled forks in eukaryotes?
Гомологи recG обнаружены у растений, но не в доступных геномных последовательностях др. эукариот, и fork-unwinding активности, аналогичные RecG также еще не обнаружены у эукариот. Однако, присутствие у эукариот гомолога RecA открывает возможность того, что Rad51-катализируемый обмен нитей в остановившейся вилке м. способствовать образованию Holliday junctions тем же способом, каким действует RecA.
Семейство геликаз, которое родственно E. coli RecQ, также участвует в процессинге поврежденных вилок. У людей разрушение этой геликазы вызвает генетические нарушения, характерным признаком которых являются хромосомные перестройки, которые м. приводить к предрасположенности к опухолям или преждевременному старению. Два таких генных продукта — BLM и WRN (разрушение которых вызывает и синдромы, соотв.) — как известно, раскручивают разветвленные ДНК структуры, включая и Holliday junctions, in vitro. Они м.б. также ассоциированы с репликативным аппаратом in vivo. Более того, гомолог S. pombe RecQ , участвует в преодолении повреждений ДНК репликационной вилкой, на это указывает чувствительность к УФЛ rqh1 мутантных клеток и потребность в Rqh1 в клетках с дефектами синтеза ДНК.
Это ведет к предположению, что очевидная anti-recombinogenic функция BLM м. участвовать в раскручивании Holliday junctions, чтобы реформировать остановившуюся вилку. Это м. предупредить вырезание Holliday junction с помощью активности, аналогичной бактериальной RuvC, и тем самым ингибироватьлюбую несоответствующую рекомбинацию со свободным dsDNA концом, который высвобождается при таком вырезании. Частичная комплементация репарации ДНК и митотических дефектов мутантных клеток S. pombe rqh1 с помощью экспрессии бактериальной Holliday junction resolvase указывает на то, что Holliday junctions, образующиеся из остановившихся вилок, м.б. удалены с помощью Rqh1-катализируемого раскручивания в обратную сторону вилки (unwinding back to a fork). В отсутствие Rqh1, однако, удаление этих Holliday junctions посредством вырезания с помощью бактериальной м. частично компенсировать неспособность их удаления с помощью Rqh1. Нежизнеспособность клеток S. pombe, у которых отсутствует и Mus81 эндонуклеазный комплекс и Rqh1 геликаза, также подкрепляет идею двух механизмов репарации репликационной вилки.
Напротив, предполагается, что гомолог S. cerevisiae RecQ — — раскручивает остановившиеся вилки в противоположном направлении по сравнению с Rqh1. Раскручивание вилок с помощью Sgs1 м. позволить доступ репарационным энзимам к месту блокирующего повреждения, тогда как прямое вырезание вилски с помощью Mus81 м. высвобождать одно плечо вилки в виде свободного конца ДНК, который м. затем рекомбинировать с сестринской хроматидой как только исходное повреждение будет репарировано. Эти контрастирующие модели для активностей Mus81 и Rqh1/Sgs1 у S. pombe и S. cerevisiae четко зависят от природы мишени для Mus81 эндонуклеазы, подчеркивая важность идентификации настоящего субстрата in vivo для Mus81.
Ghtklgjkfuftvsq баланс между Mus81 и Sgs1 активностями у S. cerevisiae обнаруживает параллели с E. coli RuvABC-зависимой репарацией посредством вырезания остановившейся вилки и RecG-зависимой репарацией без вырезания.
В самом деле, любое раскручивание вилки с помощью Sgs1 м. приводить к образованию Holliday junction, особенно если учесть, что Sgs1 м. раскручивать различные ветвящиеся структуры ДНК in vitro и м. , следовательно, использоваться переключения матриц (template switching). Однако, геликазы семейства RecQ, включая Sgs1, по-видимому. действуют как часть комплекса с . Эти комплексы RecQ–TopoIIIучаствуют в разрушении нелегальных промежуточных образований такой рекомбинации скорее, чем в процессинге поврежденных вилок.
Restarting replication in prokaryotes
Инициация репликации рутинно происходит в заранее запрограммированных источниках посредством серии специфмческих межбелковых взаимодействий. Эти события в точности контролируются так, что каждый источник задействуется только однажды на клеточный цикл и в соотв. время. Повторная загрузка репликационной machinery в месте повреждения репликационной вилки д. свергать этот нормальный контроль, так что реплисома м. собираться вдали от нормальных источников и способом, который не является субъектом регуляции того же самого клеточного цикла.
У бактерий это достигается с помощью PriA. Мутанты E. coli priA, чувствительные к УФЛ, являются дефицитными по рекомбинации, растут медленно и имеют пониженную жизнеспособность. Это подчеркивает важность повторной загрузки репликационной вилки. PriA обеспечивает такую повторную загрузку, связываясь с forked ДНК структурой и рекрутируя, посредством серии межбелковых взаимодействий,репликативную геликазу на матричную запаздывающую нитьи посредством последуюдщей ассоциации primase c DnaB. Эта 'primosome' м. затем раскручивать родительскую dsDNA и синтезировать праймеры для синтеза запаздывающей нити.
Однако, затравка синтеза опережающей нити также необходима остановившейся вилке. DnaG вероятно не м. оперировать на матричной ведущей нити, так что 3' конец предсуществующей ведущей нити м.б. необходим для для повторного запуска синтеза опережающей нити. Эта необходимость, по-видимому, имеет место, т.к. предпочтительным субстратом для PriA in vitro является forked ДНК, в которой ведущая опережающая нить позиционирована в точке разветвления (Рис. 4a). Итак, PriA облегчает затравку синтеза и опережающей и запаздывающей нитей в месте, удаленном от нормального источника репликации, oriC, тем самым избегается контроль клеточного цикла, который регулирует активность инициаторного белка DnaA в oriC.
PriA также обладает геликазной функцией, она м. разворачивать любую запаздывающую нить dsDNA, которая присутствует в точке разветвления остановившейся вилки. Это необходимо для загрузки DnaB на такую вилку, т.к. DnaB нуждается примерно в 20 нуклеотидах ssDNA для стабильного свфзявания (Рис. 4b). Однако, priA мутанты, у которых специфически отсутствует геликазная функция, обеспечивают комплементацию дефектов рекомбинации, жизнеспособности и роста priA нулевых мутантов. Это указывает на то, что репликация повторно стартует in vivo посредством промежуточных образований, которые не имеют запаздывающей нити в вилке. Т.к. D-петли не содержат запаздывающей нити в точке разветвления, то образование D-петли (Рис. 2) м.б. эффективным механизмом рестарта репликации, по крайней мере, в отсутствие дикого типа PriA геликазной активности. Однако, генетические доказательства указывают на то, что остановившаяся репликационные вилки с запаздывающей нитью в точке разветвления возникают in vivo и что PriA и RecG геликазы участвуют в повторной сборке репликационной вилки на этих промежуточных образованиях.
Эти находки указывают на то, что имеются, по крайней мере, два рекомбинационных механизма рестарта репликации у E. coli (Рис. 5). Один нуждается в RuvABC-управляемом вырезании вилки и функции сборки primosome — но не в геликазной функции — PriA (Рис. 2). Др. механизм нуждается в сборке примосомы и геликазной функции PriA и в геликазе RecG, но не нуждается в RuvABC-зависимом вырезании остановившейся вилки (Рис. 3).
Способность PriA-helicase-deficient белков комплементировать priA-нулевых мутантов м.б. объяснена способностью RuvABC обеспечивать процессинг поврежденных вилок, которые обычно обнаруживаются с помощью RecG и PriA геликазных активностей. В отсутствие PriA или RecG геликазной функции вилки с запаздывающей нитью в точке разветвления все еще м. формировать Holliday junctions, которые будут затем вырезаться с помощью RuvABC и рекомбинироваться, чтобы сформировать D-петли (Рис. 3g). Повторная загрузка реплисомы посредством геликаза-дефицитоного PriA м. затем происходить с этих D-петель. Потенциал перекрывания между RecG- и Ruv-зависимым рестартом репликации м. также объяснить, почему и ruv и recG мутантные клетки имеют слабо выраженнрые дефекты репарации ДНК по сравнению с клетками ruv recG, которые крайне чувствительны к ДНК-повреждающим агентам.
Тяжелые дефекты роста и чувствительность к ДНК-порвеждающим агентам клеток E. coli, у которых отсутствет PriA, указывает на то, что PriA является главным инициатором повторной сборки поврежденной репликационной вилки. Однако, д.б. альтернативные механизмы рестарта, которые не зависят от PriA. Такие механизмы м. зависеть от Rep геликазы, указывая тем самым, что Rep м. также раскрцчивать некоторые свойства поврежденной репликационной вилки, облегдчая повторную загурзку реплисомы в отсутствие PriA.
Restarting replication in eukaryotes
Повреждение ДНК и белковые препятсвия м. вызывать сходные проблемы для репликации у эукариот, следовательно, д.б. аналогичные системы для рестарта репликации. В самом деле, репликационные вилки м. собираться на рекомбинационных промужуточных образованиях эукариот. Однако, эукариоты д. также использовать присутствие множественных источников репликации на каждой из хромосом, так что вилка от соседнего источника м. доходить до поврежденной вилки, чтобы закончить репликацию этой области. Т.о., рестарт репликации с остановившейся вилки м.и не являться критическим, хотя исходные блокирующие повреждения д. удаляться, чтобы позволить второй вилке закончить репликацию. В подтверждение этой идеи, наблюдаются аберантные структуры репликационной вилки, включая Holliday junctions и области ssDNA, появляющиеся значительно чаще в дрожжевых клетках, которые дефицитны по checkpoint реакции. Это указывает на то, что раскручивание репликационой вилки м.б. скорее патологическим. чем физиологическим в ответ на репликативные повреждения у эукариот.
К сожалению, такая модель не объясняет, как поврежденные вилки, которые выходят из источников репликации, оказываются вблизи концов хромосом и почему вилки не конвергируют одна с др. Может ли транскрипционное молчание субтеломерной ДНК быть одним из механизмов редукции потенциального количества репликативных блоков в форме остановленных РНК полимераз на хромосомных концах и вообще решить проблему отсутствия converging fork?
Coordination of replication and repair
processes
Учитывая сложную природу репликации и связанных с ней механизмов репликационной репарации, м. предположить, что энзимы, отвественные за эти процессы организованы в структуры высшего порядка. Репликация и у прокариот и у эукариот м. происходить в т. наз. 'replication factories', в которых матричная ДНК разматывается с помощью стационарных репликационных вилок, собранных в фокусы. Рекомбинационные энзимы, которые необходимы для репарации репликационных вилок м. также ко-локализоваться с этими репликационными факториями у эукариот, при этом каждый из фокусов рекомбинационных энзимов спосоен репарировать множество повреждений. Однако, такая ко-локализация м.б. только временной, связана с динамической ассоциацие и диссоциацией репаративных энзимов в местах повреждений ДНК, когда это необходимо. Остается посмотреть, существуют ли специфические белок-направляющие механизмы, которые делают созможной быструю репарацию поврежденных репликационных вилок к эукариот, или для этого достаточно диффузии в ядро. Интересно бы посмотреть, находятся ли у бактерий энзимы, такие как PriA и RecG ко-локлизованными в репликационными вилками в определенных фокусах, даже в отсутствие экзогенных повреждений ДНК.
Возникает также вопрос, как определенные репарационные механизмы выбираются, чтобы преодолеть определенный репликативный блок. E. coliкорординируют некоторые аспекты репарации репликационных вилок; напр., воздействие на клетки УФЛ вызывает усиление транскрипции translesion polymerase генов благодаря . Таким образом потенциально мутагенный механизм репарации вилки ограничивается условиями, повышающими повреждения ДНК. Итак, translesion синтез м.б. последней (last-ditch) попыткой рестартовать репликацию сильно поврежденной ДНК, когда высокой точности механизмы рекомбинационной репарации не м. справиться (Рис. 5).
Эукариоты, по-видимому, координируют репликацию и репарацию посредством каскадов пердачи сигналов, которые чувствительны к присутсвию повреждений ДНК или репликационным стрессам и которые регулируют репарацию ДНК, ход клеточного цикла, апоптоза. Сheckpoint репликации ДНК у S. cerevisiae также участвует в стабилизации поврежденных вилок, это м. облегчать восстановление репликации с остановленной вилки после того как будет снят блок. В самом деле, отсутствие активного КПП (checkpoint) ведет к накоплению Holliday junctions и ssDNA в репликационных вилках и к появлению хромосомных разрывов в медленно реплицирующихся областях хромосом.
Checkpoint белки м , следовательно, облегчать ход репликативной вилки, чтобы минимизировать образование аномальных репликативных промежуточных образований, таких как Holliday junctions, возможно за счет фосфорилирования энзимов, которые участвуют в репликации или метаболизме нуклеотидов. Сheckpoint реакция м. б. , следовательно, больше чем просто механизм выявления повреждений и м.б. вовлечен непосредственно в отслеживание нормального перемещения репликационной вилки. В результате только клетки с критическим числом поврежденных вилок будут приведены к акресту клеточного цикла или апоптозу. Клетки с небольшим количеством поврежденных вилок будут или продолжать репликацию, тогда как остановленные вилки будут репарироваться или дожидаться прихода реплисом с от др. источника репликации. Находка, что checkpoint белки м.б. связаны с и фосфорилируют рекомбинационные энзимы уазывает на то, что checkpoint белки м. также оказывать непосредтвенное влияние на регуляцию рекомбинационной активности в остановленных репликационных вилках. Взаимодействия между рекомбинационными и репликационными энзимами также м. непосредственно влиять на активность др. др. Итак, сложное взаимодействие междy репликационными, рекомбинационными и checkpoint энзимами м.б. необходимы для эффективного удвоения хромосом даже в отсутствие экзогенных ДНК-повреждающих агентов.
