γ-SECRETASE-MEDIATED PROTEOLYSIS IN CELL-SURFACE-RECEPTOR SIGNALLING
Mark E. Fortini (ortini@ncifcrf.gov) Nature Reviews Molecular Cell Biology3, No 9, 673-684 (2002)
Many cell-surface receptors transmit signals to the nucleus through
complex protein cascades. By contrast, the Notch signalling pathway uses a
relatively direct mechanism, in which the intracellular domain of the
receptor is liberated by intramembrane cleavage and translocates to the
nucleus. This critical cleavage is mediated by the γ-secretase
complex, and new findings reveal that this mechanism is used by various
receptors, although many questions remain about the biochemical
details.
(Рис.1.) | Structures of representative Notch receptors and ligands, and of the putative γ-secretase-complex components.
(Рис.2.) | Proteolytic regulation of Notch-receptor maturation and activation.
Do all γ-secretase-mediated proteolytic events result in the release of a biologically active fragment of a membrane-bound receptor? Possibly not, judging from a
recent finding that E-cadherin is also cleaved by γ-secretase.
In this case, the cleavage is induced by Ca2+ influx or
by apoptosis, and it results in the release of the cytoplasmic
portion of E-cadherin along with its bound proteins, including α-catenin and β-catenin. These events are thought to promote dissociation of E-cadherin from the cytoskeleton and disassembly of the E-cadherin–catenin complex,
and are not known to generate an intracellular signalling domain
from E-cadherin. Another difference is that this γ-secretase
cleavage apparently occurs at the membrane–cytosol interface, rather
than at a presumed intramembrane position, and, in fact, E-cadherin
lacks the conserved transmembrane valine that is seen in Notch,
amyloid precursor protein and ErbB4 (Рис. 4 ).
In addition, a new family of presenilin homologues has recently
been described, which have features that are consistent with
proteolytic activity, such as the conserved transmembrane aspartate
residues.
Some members of this family function as signal-peptide peptidases
that are responsible for the cleavage and release of signal-peptide
fragments from endoplasmic reticulum (ER) membranes.
In view of the small size of signal peptides and the large variety
of proteins that contain them, it seems likely that this cleavage of
signal-peptide fragments is a clearance mechanism and does not
generate specific signalling molecules. Remarkably, the membrane
topology of signal-peptide peptidase is reversed relative to that of
presenilin, perhaps because signal peptides are inserted into ER
membranes in the opposite orientation to type I integral membrane
substrates of presenilin. So, the relative orientation of the
putative catalytic site to the substrate is equivalent for both
presenilin and signal-peptide peptidase.
(Box 3.) | Intramembrane proteolysis for ligand release during signalling
Путь передачи сигналов м. объяснить, как серия протеолитических событий м. контролировать созревание и активацию рецепторов клеточной поверхности. Этот путь контролирует многочисленные спецификации клеточных судеб у многоклеточных эукариот (от морского ежа до человека), он обеспечивает межклеточные взаимодействия, вовлекая клетки в прямые контакты, которые часто приводят к тому, что клетка или группа клеток воспринимают клеточную судьбу, которая отличает их от непосредственных соседей. Рецептор Notch является , с большим внеклеточным доменом, который состоит из тандемных epidermal growth factor ()-подоных повторов и трех Ca2+-связывающих Notch/ повторов, одиночного трансмембранного домена и внутриклеточного домена с 6 тандемными ankyrin повторами (Рис.1). Этот рецептор активируется после связывания лигандов из семейства //, для всех для них характрены тандемные внеклеточные EGF-подобные мотивы, а также законсервированный Delta/Serrate/ (DSL) домен, который обеспечивает связь с Notch (Рис. 1a).
В отличие от др. сигнальных путей, которые используют каскады белков для передачи сигналов с плазматической мембраны в ядро, внутриклеточный домен Notch связывается непосредственно с нижестоящими транскрипционными факторами из семейства эволюционно законсервированных C promoter binding factor// (CSL), тем самым контролируя транскрипционную репрессию или активацию генов-мишеней для Notch. Этот относительно прямой способ передачи сигнала с поверхности в ядро базируется на протеолизе, высвобождающем внутриклеточный сигнальный фрагмент Notch, который транслоцируется в ядро, чтобы там взаимодействовать с промоторами генов-мишеней CSL белков
Этот сигнальный механизм связан с последовательной серией соседствующих событий протеолитических процессингов, которые картируются на ~70-аминокислотном сегменте ~300-kDa Notch рецептора (Рис. 2). Первые две ступени расщепления асооцированы с созреванием Notch-рецепторов в trans-Golgi и индуцированным лигандом удалением внеклеточного доемена рецептора. Кульминацией этих событий является последующее внутримембранное расщеплнеие прикерепленного к мембране внутриклеточного деомена Notch. Это третье расщпеление зависит от и скорее всего осуществляется с помощью большого, еще плохо изученного, проеолитического комплекса. названного 'γ-secretase'.
Суммированы доказательства участия γ-secretase в ступени внутримембранного расщепления процессинга Notch, т .к. последние данные разрешили вопрос, могут ли идентичные или различные γ-secretase'-родственные активности расщеплять Notch и др. субстраты в несколько иных трансмембранных сайтах. Концепция, что этот протеолитический механизм м.б. генеральной стратегией в передаче сигналов вот клточной поверхности у ядро, подтверждается, т.к. установлено участие γ-secretase в высвобождении внутриклеточных фрагментов из amyloid precursor protein (), , по крайней мере, из одной рейепторной тирозин киназы (ErbB4), мультифункционального низкой плотности lipoprotein-receptor-related protein (), и молекулы клеточной адгезии и cadherin.
Unmasking the γ-secretase complex
Открытие γ-secretase комплекса очень важно, благодаря тому факту, что он обеспечивает аналогичные протеолитические события в двух на первый взгляд неродственных биологических феноменах — в патогенезе и в передаче онтогенетических сигналов с помощью Notch-рецепторов. Прогрессивное накопление амилоидных бляшек, содержащих небольшие, в 40–42-аминокислот пептидные производные APP в определенных областях головного мозга, считалось ключевым признаком б-ни Алцгеймера. APP является типа I интегральным мембранным белком, а некоторые небольшие пептиды, включая neurotoxic amyloid peptides, образуются в результате альтернативных расщеплений в и соседней области, котороая соответсвует трансмембранному домену (Рис. 3). Одно из таких расщеплений происходит в необычном месте, внутри самого APP трансмембранного домена, и называется 'γ-secretase' расщеплением, хотя энзим не установлен, но постулируется, что именно он осуществляет этот разрез и тем самым генерирует секретируемые амилоидные фрагменты, которые оканчиваются на этом С-терминальном γ положении. Благодаря гетерогенности мест расщепления γ-secretase действительно продуцирует амилоидные пептиды слегка отличающихся размеров, 42-аминокислотными пептидами (Aβ42), обнаруживающими более высокую нейротоксичность, чем меньшие в 40-аминокислот пептиды (Aβ40).
Исследования пациентов с аутосомно-доминанной, рано начинающейся б-нью Алцгеймера продемонтсрировало молекулярную идентичность γ-secretase. В то время как небольшая пропорция таких случаев обусловлена мутациями в самом APP, большинство из них связано с мутациями или двух генов presenilin человека и . Было установлено, что эти мутации PS1 и PS2изменяют соотношение Aβ42 и Aβ40 за счет использования γ>-сайта, ускоряющего продукцию более нейротоксичного Aβ42. Исследования у Caenorhabditis elegans также выявии родственные белки, которые кодируются spe-4 и генами, которые необходимы для морфогенеза спермиев и передачи синелов Notch/Lin-12, соотв. В то время как белок SPE-4, по-видимому, наиболее удален по отношению к семейству, белок SEL-12 наиболее сходен с presenilin-1
и -2 млекопитающих, это указывает на то, что presenilins участвуют как в APP метаболизме, так и передаче сигналов Notch.
The γ-secretase complex
Presenilin.
Молекулярное клонирование генов presenilin показало, что они являются белками несколько раз пронизывающими мембрану — наиболее распространенной топологической моделью является 8 раз пересекающий мембрану белок с N- и С-терминальными цитозольными доменами и большой гидрофильной цитозольной петлей между сегментами 6 и 7 (Рис. 1b). Presenilin локализуется преимущественно в endoplasmic reticulum (ER) и компартментах Golgi, хотя небольшие количества, по-видимому, присутствуют в плазматической мембране, где он м.б. доступен для вовлечения в события клеточной поверхности, такие как активация рецепторов. Белок синтезируется в качестве интактного (с относительной мол. массой ~50,000 (50 kDa)), который сам расщепляется с помощью неизвестной активности на N- и С-терминальные фрагменты ~30 kDa и ~20 kDa, соотв. Функциональное значение пресенилина остается невыясненным. Большинство считает, что presenilin неактивен в качестве holoprotein и нуждается в эндопротеолизе, чтобы стать биохимически активным. Однако имеются некоторые указания на то, что эндопротеолиз presenilin и функция γ-secretase м.б. не связаны. Во всяком случае, ясно, что большинство вновь синтезированного пресенилина не подвергается эндопотеолизу или включению в большие комплексы, а вместо этого быстро деградирует. Самый маленький пул пресенилина расщепляется и его фракции обнаруживаются в комплексах высокого мол. веса по некоторым подсчетам ~250 kDa по др. в пределах 1,000–2,000-kDa.
Other components.
Недавно идентифицирован один из компонентов таких больших комплексов, названный nicastrin, это типа I интегральный мембранный белок, который ассоциирует с пресенилиновыми белками и С-терминальными фрагментами APP и Notch и генетически необходим для передачи сигналов Notch/Lin-12 у мух и червей. Снова выявляется связь между процессингом APP и активностью Notch. В противоположность presenilin, который в основном пронизывает мембрану и является цитозольным по топологии, nicastrin имеет большой внеклеточный домен с законсервированным, функционально важным мотивом DYIGS и относительно небольшим внутриклеточным доменом с незначительным сходством последовательностей у разных видов (Рис. 1b). Выявлены еще два дополнительных компонента γ-secretase комплекса у мух и червей. Ген aph-1 кодирует новый белок, который имеет 7 трансмембранных доменов, тогда как ген pen-2 кодирует очень небольшой новый белок (всего в 101аминокислоту). Биохимические функции этих предполагаемых компонентов γ-secretase комплексов пока не выяснены.
The catalytic core of γ-secretase.
Хотя ни один из этих белков не обладает очевидной гомологией с белками с известной функцией, некоторые структурные свойства пресенилинов ведут к предположению, что они м.б. каталитической сердцевиной давно разыскиваемой γ-secretase. Пресенилины, даже те, что найдены у растений, имеют два законсервированных остатка aspartate в трансмембранных доменах 6 и 7 — в местах, где, как полагают, они совпдают с местами расщепления с помощью γ-secretase APP. Это наблюдение вместе с фактом, что все aspartyl proteases обладают двумя каталитическими aspartates и что γ-secretase активность блокируется блокируется с помощью аналогов пептидов, каталитических промежуточных продуктов aspartyl protease, открывает возможность того, что пресенилины м. представлять собой новый класс внутримембранных aspartyl proteases.
Устранение активности presenilin-1 у нокаутных мышей вызывает редукцию γ-сайта расщепления APP и, как было отмечено выше, с б-нью Alzheimer's ассоциированные PS1 и PS2 мутации нарушают соотношение Aβ42 и Aβ40 использования γ-сайтов. Мутагенез любого из двух законсервированных aspartates в presenilin-1 влияет на расщепление APP, хотя интерпретация этого результата осложненна сообщениями о том, что эти мутации нарушают также эндопротеолитическое созревание пресенилинов и нарушают инкорпорацию жндогенных дикого ипа пресенилинов в высокго мол. веса 'активные' комплексы. Биохимические исследования показали, что presenilin-1 и γ-secretase активность очищаются вместе из мембран клеток HeLa и что переходного состояния аналоги ингибиторов γ-secretase метят и presenilin-1 и -2. Наконец, законсервированный мотив в presenilin обладает сходством с предполагаемым каталитическим сайтом — необычным классом aspartyl proteases. Все это указывает на то, что пресенилины служат в качестве каталитического стержня в нового типа политопических aspartyl протеазах, которые функционируют как часть больших, связанных с мембраннами, комплексов и осуществяют необычное внутримембранное расщепление APP и др. субстратных белков.
The γ-secretase complex and Notch
activation
APP and Notch cleavage is mediated by γ-secretase.
Учитывая доказательства протеолитической роли пресенилинов в γ-secretase расщеплении APP, было высказано предположение, что они обеспечивают также и внутримембранное расщепление Notch рецепторов. Генетические исследования показали, что мутации потери функции пресенилинов имеют фенотипы, которые указывают на распространенное отсутствие передачи сигналов Notch в процессе развития у мух и мышей,
как это происходит у мутантных по nicastrin мух и червей. Ряд исследований подтвердили, что пресенилины и ассоциированные факторы специфически необходимы для внутримембранного γ-secretase-подобного расщепления Notch. В клетках млекопитающих и Drosophila melanogaster удаление активности пресенилина или nicastrin ведет к потере предполагаемых продуктов γ-secretase-подобного расщепления Notch, это напоминает биохимические эффекты хорошо охарактеризованных γ-secretase ингибиторов. В согласии с этими результатами, почтоянно активные закрепленные на мембранах формы Notch нуждаются в активности presenilin, nicastrin, Aph-1 и Pen-2 для передачи сигналов, в то время как растворимые ядерные формы активированных Notch, у которых отсутствует трансмембранный домен, не нуждаются в этих белках.
Complications from recent studies.
И когда вроде бы стало ясно, что и Notch и APP — два типа I трансмембрнных белка с большими внеклеточными доменами — являются субстратами для аналогичных внутримембранных расщеплений, осуществляемых одним и тем же большим протеолитическим комплексом, новые исследования поставили это все под вопрос. Напр., мутации предполагаемого остатка Asp257 каталитического сайта в PS1 оказалось полностью блокируют Notch γ-secretase расщепление без тяжелых нарушений продукции Aβ.
Эти данные отличаются от раннее обнаруженных, что Asp257 мутации влияют на продукцию Aβ. Предполагается, что это расхождение м.б. обусловлено различиями в относительной степени избыточной экспресиии Asp257-мутаций, это согласуется с данными, что только часть от общего пула дикого типа и мутантных пресенилинов подвергается энтопротеолизу и включается в высокого мол. веса активные комплексы и что Asp257 мутации м. эффективно предотвращать вступление эндогенных дикого типа пресенилиновых белков в эти комплексы. Итак, если мутантные Asp257 экспрессируются на значительно более высоких уровнях, чем эндогенные пресенилины, что имеет место в большинстве исследований клеточных культур, то следует ожидасть, что лишь очень небольшие количества эндогенных функциональных пресенилинов будут находить дорогу к активным комплексам. Сзодные эффекты 'замещения' м.б. ответственны и за некоторые др. примеры, при которых избыточная экспрессия мутантных пресенилинов будет строго ингибировать протеолиз Notch и тем самым увеличивать Aβ42 секрецию. В таких случаях, снижение количества функциональных γ-secretase комплексов м. приводить к соотвественной редукции протеолиза Notch, однако, оставшихся комплексов будет достаточно для обеспечения внутримембранного расщеплния APP, хотя почему при этом отдается предпочтение Aβ42 сайту над Aβ40 остается неясным.
Дополнительные противоречия возникли потому, что происходит нормальное γ-secretase расщепление APP в фибробластах мышей, у которых отсутствует и presenilin-1 и -2, хотя ранее четко было показана потеря APP γ-сайта расщепления в клетках, дефицитных по presenilin-1/presenilin-2, а в др. исследовании установлена независимая от пресенилина сигнальная активность Notch, которая, тем не менее, чувствительна к γ-secretase ингибиторам. Эти расхождения м.б. обусловлены наличием различных субклеточных пулов Aβ, которые генерируются разными γ-secretase активностями. Эта идея подтверждается недавними исследованиями, показавшими, что мышиные клетки, лишенные и presenilin-1 и -2 имеют заметно пониженные уровни секретируемых Aβ40 и Aβ42, но имеют нормальные уровни продукции Aβ42 в ER/промежуточном компартменте. Вопрос осложнился еще больше, когда фракционирование клеточных экстрактов показало, что активности presenilin и γ-secretase в отношении Notch биохимически разделимы, хотя сама активность γ-secretase зависит от функции пресенилина. Эти результаты м. говорить о том, что presenilin необходим, чтобы активировать разные протеазы, которые расщепляют Notch внутри трансмембранного домена. Однако, это исследование касается расщепленяи очень коротких Notch-based fluorogenic пептидов, которые состоят лишь из 6 аминоислот, это м. и не отражать в точности все аспекты нормального γ-secretase расщепления Notch. Более того, возможно, что редкий пул модифицированных пресенилинов м. стать ограниченным специфическим комплексом или мембранной фракцией, который является отдельным от большинства пресенилиновых белков. Этот модифицированный пул м.б. в основном ответственным за расщепление Notch, но м.б. неспособным ко-фракционировать вместе с основной массой растворяемой в детергенте немодифицированных пресенилинов, это м.б. объяснить находку потеазной активности, которая, по-видимому, физически отделена от обнаруживаемого пула пресенилинов.
Subtly different mechanisms for APP and Notch cleavage?
Хотя большинство согласно, что передача сигналов Notch нуждается в presenilin и в γ-secretase комплексе и что сходство между внутримембранным расщеплением APP и Notch вряд ли м. игнорировать, определенные детали этих двух расщеплений ведут к идее несколько отличающихся механизмов. Хотя и имеется значительная гетерогенность в точном позиционировании сайта внутримембранного протеолиза APP, учитывая увеличение Aβ40, Aβ42 и родственных малых пептидов, расщепление, которое генерирует сигнальные фрагменты Notch1 у млекопитающих, происходит по законсервированному валиновому остатку (Val1744) внутри трансмембранногог домена (Рис. 4). Мутагенез Val1744 заметно снижает γ-secretase-подобное расщепление Notch1, в то время как аналогичное расщепление APP толерантно к аминокислотным заменам вблизи сайта расщепления. Необходимо отметить, однако, что анализ engineered presenilin субстратов, включая и те, что содержат Notch трансмембранные домены, в которых законсервированный валин мутировал, выявил гетерогенность позиций расщепления и и относительно незначительную зависимость от аминокислотных последовательностей, это напоминает протеолиз APP по γ-сайту. До некоторой степени, противоречивые результаты, полученные с мутагенезом валина в трансмембранном домене Notch, м.б. обусловлены различиями в подходах. И на самом деле,
скромные количественные эффекты по эффеективному расщепления наблюдались для валиновых мутантов при изучении engineered-substrate, и едва различные фенотипические различия между валиновыми мутанами у knock-in мышей и нулевых-Notch1 мышей, это согласуется с идеей, что мутагенез закончсервированного трансмембранного валина не м. полностью элиминировать событие расщепления.
Интересно, что выявлен новый сайт расщепления в APP трансмембранном домене, располагается вблизи С-терминальной границы трансмембранного домена (Рис. 4). Этот сайт очень сильно напоминает место валинового расщепления в трансмембранном домене Notch — и по последовательностям и С-терминальному внутримембранному положенияю — и его использование чувствительно к γ-secretase ингибиторам. Как этот сайт участвует в метаболизме APP и какой из сайтов в APP и Notch соответствует 'реальному' месту γ-secretase расщепления, пока неизвестно. Очень возможно, что γ-secretase сама действительно расщепляет и средину трансмембранного домена и также законсервированный валин, одновременно или почти одновременно, это м.б. облегчить высвобождение белковых фрагментов и удаление гидрофобных закрепленных на мембране пептидов из липидного бислоя. Итак, разное предпочтение мест расщепления, которое обычно обнаруживается для APP и Notch, м. просто отражать тот факт, что амилоид является секретируемым пептидом, тогда как сигнальный домен Notch является внутриклеточным белком, так что эти два разных продукта расщепления заканчиваются на позиции, сдивнутой более наружу клетки и сдивнутой более внутрь клетки в трансмембранном домене, соотв. APP и Notch каждый м. подвергаться обоим типам внутримембранного расщепления, но биологически необходимый продукт от каждого субстрата обнаруживает заметно отличающуюся зависимость от одного или др. сайта расщепления. Ассоциированная с б-нью Alzheimer's мутация Leu166Pro в presenilin-1 вызывает резкий подъем продукции Aβ42 из APP, она также нарушает продукцию и Notch и APP С-терминальных внутриклеточных фрагментов, которые образуются благодаря расщеплению по valine-сайту эквивалентным способом.
Напротив, использование оптимального γ-secretase субстрата. соотв. фрагментам дикого типа и мутантным, закрепленным на мембране APP — выявило альтернативное N-терминальное внутримембранное расщепление, помимо обычного положения Aβ40/42-типа расщепления. Это важное наблюдение, т.к. когда Notch трансмембранный домен был заменен на APP белковый кусок, то Notch valine расщепления не происходило. Вместо этого, химерная молекула расщеплялась в более центральном сайте внутримембранного домена, который соответствовал обычному γ-secretase положению расщепления (Рис. 4), как если бы все белковое содержание служило ключевым детерминантом использования одного из типов внутримембранного расщепления внутри данного трансмембранного субстрата. Очевидно, что важность различий, существующих между двумя субстратами, м. влиять на их γ-secretase-обусловленный процессинг. В самом деле, предложен новый класс isocoumarin лекарств, который не прямо ингибирует γ-secretase, он м.б. потенциально использован для терапептического снижения продукции Aβ40/42, которое не влияет на расщепление Notch.
Regulation of intramembrane Notch cleavage
γ-Secretase-подобное расщепление Notch зависит от двух более ранних протеолитических событий во время связывания лиганда и активации рецептора (Рис. 2). Одно событие этого расщепления происходит в ~70 внеклеточных аминокислотах, соседствующих с трансмембранным доменом Notch и оно обеспечивается в trans-Golgi
компартменте. В результате клеточного процессинга Notch расщепляется на два сегмента, один представлен самым внеклеточным доменом; а др. состоит из короткой внеклеточной ножки, трансмембранного домена и внутриклеточного домена (Рис. 2). Эти два сегмента связаны др. с др. нековалентными связями, чтобы реконструировать гетеродимерные Notch рецепторы на клеточной поверхности
После связывания лиганда, происходит второе событие расщепления непосредственно вне трансмембранного домена (Рис. 2), в результате удаляется Notch внеклеточный домен, в результате процесса, аналогичного с утечкой (shedding) эктодомена tumour necrosis factor-α (), и некоторых др. белков клеточной поверхности. Установлено, что это индуцируемое лигандом расщепление Notch осуществляется с помощью члена семейства ADAM/TACE (a disintegrin and metalloprotease/TNF-α-converting enzyme) metalloproteinase. Эта ступень, по-видимому, зависит от эндоцитоза Notch, т.к. лигандом стимулированная передача сигналов осуществляется от Notch полной длины, а не укороченными производными, которые напоминают TACE-расщепленные формы, она замедляется взаимодействием с эндоцитозом. Эти наблюдения ведут к предположению, что присоединение лиганда и ассоциированные инвагинации мембран во время эндоцитоза обусловливают конформационные изменения Notch гетеродимеров, которые подставляют свои внеклеточные сайты для TACE расщепления и подвергаются необратимому отщеплению эктодомена.
После удаления внеклеточного домена, оставшаяся С-терминальная часть Notch — которая состоит в основном из закрепленного на мембране внутриклеточного домена — подвергается эффективному протеолизу presenilin-зависимым способом (Рис. 2). Основной фактор, который влияет на расщепление, это , по-видимому, длина короткой внеклеточной ножки скорее, чем специфические аминокислотные последовательности или субстрат распознающие домены. Искусственные субстраты с экстраклеточным сегментом, превышающим ~300 аминокислот, расщепляются плохо, по мере укорочения сегмента протеолиз становится все более эффективным и внеклеточные ножки длиной менее 50 аминокислот являются оптимальными субстратами для пресенилин-зависимого протеолиза. Обнаружение, что соседний альтернативный сайт TACE расщепления у Drosophila Notch продуцирует два сходных, закрепленных на мембране Notch С-теримнальных фрагмента, только один из которых является подходящим субстратом для γ-secretase-подобного протеолиза. Удаление эктодомена APP с помощью α- или β-сайта расщепления (Рис. 3) генерирует закрепленные на мембране С-терминальные производные, которые, как м. ожидать, м. служить оптимальными γ-secretase субстратами, которые снова подчеркивают сходство между внутримембранными расщеплениями Notch и APP.
The roles of transport and complex assembly
Transport.
Итак, furin-like-обусловленное расщепление и повторная сборка Notch иллюстрирует, пост-трансляционную модификацию Notch во время его транспорта к клеточной поверхности, это является важным для механизма передачи сигналов. В самом деле, большие количества Notch иммунореактивности определяются вне клетки, а не на клеточной поверхности и выявляется лишь минорный пул Notch, который не подвергаются процессингу с помощью furin-like convertases, он не передает сигналы через CSL транскрипционные факторы и , следовательно, не м.б. использован для механизма внутримембранного расщепления. Хотя лишь небольшое количество этих видов Notch обнаруживается на клеточной поверхности и они имеют короткий период полу-жизни, исследования на Drosophila подтверждают идею, что furin-like расщепление Notch рецепторов м. не быть облигаторным свойством передачи сигналов Notch.
Хотя фракция пресенелина также присутствует на клеточной поверхности, большая же их часть обнаруживается в ER/Golgiкомпартментах, это ведет к т. наз.
'пространственному парадоксу' γ-secretase поле: почему столь много пресенилина обнаруживается в секреторном аппарате, если он действительно необходим в плазматической мембране для протеолиза своего субстрата? Единственное решение этого парадокса то, что транспорт Notch и др. γ-secretase субстратов на клеточную поверхность интимно связан со сборкой 'активного' γ-secretase комплекса. Presenilin-дефицитные мыши имеют дефекты транспорта некоторых мембранных белков и сходные эффекты описаны для C. elegans Lin-12, но не для Drosophila Notch. Некоторые генетические исследования на мухах и червях с др. предполагаемыми γ-secretase компоентами, включая nicastrin и Aph-1, выявили специфические транспортные фенотипы у соотв. мутантов. Итак, базируясь на потере зависимого от поверхности пула пресенилина у nicastrin мутантов, было предположено, что nicastrin м.б. специфически необходимым для транспорта γ-secretase комплекса в плазматическую мембрану. Напротив, Aph-1 и presenilin существенны для собственно локализации на клеточной поверхности nicastrin у C. elegans и в клетках мышей.
Proteolytic complex assembly.
Хотя возможно, что эти белки являются частью функциональной сети независимых транспортных факторов, однако альтернативный сценарий - это, что транспорт γ-secretase комплекса на клеточную поверхность нуждается в его предварительной сборке и/или активации. Было также показано, что nicastrin и др. предполагаемые γ-secretase компоненты, включая Aph-1 и Pen-2, необходимы для эндопротеолитического созревания пресенилина. Сходным образом, nicastrin подвергается сложному N-гликозилированию во время своего созревания внутри ER и Golgi компартментов в процессе, который зависит от взаимодействия с функциональным presenilin-1 комплексом. Только часть вновь синтезированного пресенилина подвергается эндопротеолизу , стабилизируется и включается в активные высокого мол. веса комплексы.
Согласно этой 'stabilization/maturation' модели, лимитирующие клеточные факторы регулируют количество пресенилина, которое вступает на путь созревания, тогда как большая часть пресенилинового holoprotein деградирует с помощью . Дестабилизация presenilin, обнаруживаемая у nicastrin, aph-1 и pen-2 мутантов указывает на то, что потеря предполагаемых компонентов γ-secretase комплекса м.б. результатом неправильной или неполной сборки комплекса, с последующим нарушением эндопротеолиза пресенилина и транспорта на клеточную поверхность. Nicastrin соединяется не только с presenilin, но также с С-терминальными фрагментами Notch и APP, открывается интересная возможнрость. что неактивный пресенилиновый holoprotein м. б. лишь стабилизирован и конвертирован в активную протеазу в результате ассоциации с nicastrin и соотв. субстратом. Nicastrin v/ действовать как 'substrate loading' фактор, который, по крайней мере частично, контролирует количество пресенилина, вступающего на путь стабилизации/созревания, который ведет к образованию активного γ-secretase-комплекса.
γ>-Secretase - a widespread signalling
strategy?
Nuclear signalling by APP.
Взаимосвязь между ассоциированным с б-нью Алцгеймера γ-secretase комплексом и передачей сигналов Notch находится в полном соответствии с находкой, что APP , по-видимому, также высвобождает внутриклеточный С-терминальный фрагмент с потенциальной сигнальной функцией (Box 1 Рис. часть a). Как и на пути Notch этот γ-secretase-производимый продукт APP образуется при расщеплении по valine cleavage сайту, который находится вблизи к внутреннему листку плазматичекой мембраны, транслоцируется в ядро и стабилизируется благодаря ассоциации с др. белками. Хотя цитоплазматический хвост APP всего из 47 остатков, т.е. значительно меньше, чем ~1,000-кислотный Notch внутриклетоный домен, тем не менее этот APP фрагмент м.обеспечивать сборку транскрипционно активного комплекса, который содержит ядерный адапторный белок Fe65 и гистоновую deacetyltransferase .
Внутриклеточный домен APP, по-видимому, регулирует phosphoinositide-обеспечиваемую передачу сигналов кальция, которые поддерживают уровень кальция в ER и м. репрессировать экспрессию чувствительных к ретиноидам генов. Этот фрагмент APPсоединяется также с цитоплазматическим Notch регулятором и ингибирует передачу сигналов аналогично Notch внутриклеточному фрагменту, следовательно, γ-secretase м. и спосоствовать и ослаблять передачу сигналов Notch в определенных контекстах.
Эти параллели с механизмом передачи сигналов Notch строго указывают на то, что помимо хорошо документированной роли в патогенезе продукции Aβ, APP действует и как рецептор клеточной поверхности в нормальных физиологичких условиях (альтернативное мнение в Box 1). Хотя и идентифицированы некоторые кандидаты на роль связывающих белков для APP, несовсем ясно какие существуют предполагаемые внеклеточные лиганды для APP или как и где регулируется сигнальная активность АРР. Показано, что APP скорее всего выполняет важные нейрональные функции, вообще-то в , , или некоторых др. синаптических процессах. Важной задачей будет определение какое из этих событий м.б. связано с γ-secretase-обусловленным высвобождением внутриклеточного домена APPи как передача сигналов APP запускается в каждом случае.
Nuclear signalling by ErbB4.
Очевидно, что внутримембранный протеолиз рецепторов с помощьюγ-secretase комплекса м.б. генеральной стратегией передачи сигналов от клеточной поверхности в ядро (Box 2). Помимо Notch и APP рецепторная тирозин киназа ErbB4 также расщепляется подобным образом, высвобождая внутриклеточный домен, который транслоцируется в ядро. ErbB4 участвует в различных онтогенетических и патогенетических процессах. Стимуляция ErbB4 — с помощью его лиганда, heregulin, или с помощью (PKC)-activator 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA) — ведет к отщеплению эктодомена, которое осуществляется с помощью TACE metalloproteinase. Это расщепление подобно родственному ADAM/TACE внеклеточному расщеплению Notch и TACE обеспечиваемому γ-secretase расщеплению APP, дает закрепленный на мембране ErbB4 внутриклеточный домен, который высвобождается в результате последующего γ-secretase протеолиза. Вид этого фрагмента и ингибирование роста клеток карциномы груди с помощью heregulin блокируется γ-secretase ингибиторами или с помощью избыточной экспрессии доминантно-негативных пресенилинов. Трансмембранный домен ErbB4 содержит валиновый остаток в С-терминальной области, там, где законсервированы валины у APP и Notch (Рис. 4). Итак, очевидно, что γ-secretase
расщепление ErbB4 происходит в этой же позиции, хотя прямые биохимические доказательства еще не получены. Взаимосвязь этого γ-secretase-зависимого механизма передачи сигналов ErbB4 с его канонической тирозин-киназной активностью пока неясна. Кроеме того, необходимо определить ядерную функцию высвобождаемого фрагмента ErbB4, хотя уже выявлена слабая транскрипционная активность гетерологичного репортерного гена. Иммунореактивность ErbB4 и др. членов семейства Erb, включая цитоплазматический домен EGF receptor (EGFR), обнаружена в линиях опухолевых клеток. Внутриклеточный протеолиз этих рецепторных тирозин киназ м. , следовательно, играть роль в клеточной пролиферации и м.б. общим признаком этого семейства рецепторов, хотя γ-secretase ингибиторы не обнаруживают своего эффекта в отношении EGF-стимулировнаного клеточного роста.
Yet more substrates for γ-secretase?
Далее в качестве субстрата γ-secretase на сценц выступает CD44молекула клеточной адгезии и белок клеточной поверхности LRP. CD44 является типа I интегральным мембранным белком с одиночным трансмембранным доменом он участвует в различных физиологических процессах,включая homing лимфоцитов, миграцию клеток, рост и инвазию опухолей. CD44 также непосредственно участвует в трансдукции внутриклеточных сигналов, которые модулируют адгезию клеток. Критической ступенью в этой передаче сигналов является внутримембранный протеолиз CD44, который высвобождает внутриклеточный домен. Как и в случае Notch, APP и ErbB4, этот фрагмент транслоцируется в ядро и действует как транскрипционный регулятор — в этом случае, через ассоциацию с CREB-binding protein/ транскрипционным ко-активатором. Неожиданно, хотя CD44 трансмембраннный домен и содержит валиновый остаток в положении сходном с законсервированными валинами у др.γ-secretase субстратов, внутримембранный протеолиз, по-видимому, происходит немного в С-терминальную сторону от валина (Рис. 4).
LRP член семейства рецепторов низкой плотности липопротеинов он соединяется с рядом лигандов, включая и , plasminogen activators, lipases и APP. Идентифицированы некоторые белки в качестве связывающих факторов для внутриклеточного домена LRP, включая ядерный адптор Fe65, тот самый белок, который комплексуется с внутриклеточным γ-secretase-высвобожденным фрагментом APP. Как и у др. γ-secretase субстратов внутриклеточный фрагмент LRP высвобождается с помощью γ-secretase-подобной активности и м. модулировать активность гена-репортера в ядре. В отличие от CD44, процессинг LRP трансмембраннгого сайта напоминает связанное с валином γ-secretase расщепление Notch, APP и ErbB4.
Внутримембранное расщепление CD44 и LRP сильно нарушается γ-secretaseингибиторами, нооеще не тестировано в presenilin-дефицитных клетках. Тем не менее четкие параллели между этим расщеплением и расщеплением известных γ-secretase субстратов не оставляет места lzk сомнения, что и CD44 и LRP подвергаются протеолизу этим комплексом. Важно, что внутримембранному расщеплению CD44 и LRP предшествует и возможно зависит от удаления эктодомена с помощью металлопротеиназы — аналогично удалению с помощью TACE металлопротеиназ у Notch, APP и ErbB4. Более того, расщепление CD44 и LRP индуцируется с помощью PKC активации,
наряду с др. стимулами, а высвобождаемый CD44 фрагмент способствует транскрипции посредством TPA-responsive cis-действующего элемента. Это указывает на скоординированную регуляцию или родственный нижестоящий механизм для данного способа передачи сигналов CD44 и LRP, который м.б. сходен с ErbB4 протеолиз зависимой передачей сигналов. Как и у ErbB4 отщепление эктодомена CD44 и, возможно, последующее &gamma>-secretase-подобное расщепление активруются во многих опухолях человека. Такое расщепление CD44 м. иметь важную регуляторную роль в росте и метастазировании опухолей — ген CD44 сам посебе активируется TPA-responsive способом, указывая тем самым. что ядерная передача сигналов CD44 м. способстовать повышенной экспрессии CD44, а значит быстрому обмену белков, необходимому для эффективной миграции клеток.
Future directions
В противоположность многим др. типам сигнальных каскадов, протеолиз интактных Notch рецепторов в ответ на стимуляцию лигандом ведет к высвобождению внутриклеточного фрагмента в ядро и его непосредственному участию в транскрипционной регуляции нижестоящих генов. Этот сигнальный механизм использует новый тип внутримембранного протеолиза, при котором большой белковый комплекс ассоциирует с субстратом в секреторном аппарате и, по-видимому, расщепляет его внутри каталитически суровых условиях липидного бислоя. Хотя остаются противоречия относительно субюклеточной локализации и функции γ-secretase, а также относительно взаимоотношений между транспортом ее субстратов через компартменты ER/Golgi и их действительным протеолизом.
Значительный прогресс в понимании как этот внутримембранный протеолиз вносит вклад в активацию и передачу сигналов, но многие вопросы не решены. В случае большого γ-secretase комплекса, полная идентификация всех компонентов, а также выяснение их стоихометрических и биохимическийх функций является приорететом в дальнейших исследованиях. Важно также выяснить, являются ли канонические γ-secretase сайты расщепления и болеее N-терминально сдвинутые ассоциированные с валином сайты отражением активностей одиночного γ-secretase комплекса или разных протеолитических энзимов. Если верно последнее, то необходимо идентифицировать проеазы, которые отвечают за каждый тип внутримембранного расщепления, их знание м. оказать выраженное влияние на выявление лекарств и предупреждения накопления патологических Aβ, а также устранение токсических и онкогенных осложнений, обусловленных взаимодействием с Notch-путем. Одним из неожданных аспектов γ>-secretase является то, что лищь фракция presenilin инкорпорируется в активный комплекс. Быстрая деградация большей части вновь синтезированного пресенилина отражает тонко контролируемое ограничение сборки γ-secretase комплекса с помощью окраничивающих ко-факторов или доступности субстрата или существенной коротко-живучести. Далее необходимо понять, как протеазы м. опрерировать внутри либидного бислоя, т.к. и водные локальные условия и расправление α-спирализованного субстрата существенны для гидролиза пептидных связей. . Вообще-то presenilin/γ-secretase формируют поро-образные структуры в мембране, что облегчает поступление воды к каталитическому сайту. Тот факт, что пресенилин обладает столь незначительным сходством с цитоплазматическими протеазами указывает на то, что они используются независимо, т.к. мембранные белки, позднее приобретают немного ключевых каталитических остатков, которые отвечают за протеолитическую активность.
Все указывает на то, что γ-secretase м. выполнять аналогичную рольв нескольких путях передачи сигналов. Она отвечает за высвобождение внутриклеточных фрагментов с потенциалом сигнальной функции из APP, ErbB4, CD44 и LRP белков, это указывает на то, что γ-secretase-обусловленное расщепление рецепторов клеточной поверхности является широко используемой стратегией передачи сигналов. Для всех этих потенциальных субстратов необходимо подтвердить участие пресенилина и выяснить физиологическое значение внутримембранного расщепления, используя генетические реагенты. В самом деле, вовлечение γ-secretase в процессинг ErbB4 рецепторной тирозин киназы укащзывает на то. что некоторые довольно хорошо охарактеризованные пути м. иметь неканонические способы передачи сигналов, которые нуждаются в γ-secretase или сходных протеазах. Как много др. рецепторов м. расщепляться с помощью γ-secretase и как много существует др. типjd внутримембранных протеаз пока неизвестно. Открытие Rhomboid внутриклеточной сериновой протеазы иллюстрирует, что возможно будут нацдены дополнительные внутримембранные протеазы (Box 3). Наконец, становится очевидным, что γ-secretase-подобные комплексы имеют и др. клеточные функции, такие как удаление неправильно сложенных мембранных белков, а также малых связанных с мембраной пептидов, которые образуются в ходе нормальных метаболических процессов (Box 2).
