Sleep Regulation
Сон: Регуляция

A role for cryptochromes in sleep regulation
Jonathan P Wisor, Bruce F O'Hara, Akira Terao, Chris P Selby, Thomas S Kilduff, Aziz Sancar, Dale M Edgar and Paul Franke
BMC Neuroscience 2002 Volume 3:20

http://www.biomedcentral.com/1471-2202/3/20

The cryptochrome 1 and 2 genes (cry1 and cry2) are necessary for the generation of circadian rhythms, as mice lacking both of these genes (cry1,2-/-) lack circadian rhythms. We studied sleep in cry1,2-/- mice under baseline conditions as well as under conditions of constant darkness and enforced wakefulness to determine whether cryptochromes influence sleep regulatory processes.
Under all three conditions, cry1,2-/- mice exhibit the hallmarks of high non-REM sleep (NREMS) drive (i.e., increases in NREMS time, NREMS consolidation, and EEG delta power during NREMS). This unexpected phenotype was associated with elevated brain mRNA levels of period 1 and 2 (per1,2), and albumin d-binding protein (dbp), which are known to be transcriptionally inhibited by CRY1,2. To further examine the relationship between circadian genes and sleep homeostasis, we examined wild type mice and rats following sleep deprivation and found increased levels of per1,2 mRNA and decreased levels of dbp mRNA specifically in the cerebral cortex; these changes subsided with recovery sleep. The expression of per3, cry1,2, clock, npas2, bmal1, and casein-kinase-1ε did not change with sleep deprivation.
These results indicate that mice lacking cryptochromes are not simply a genetic model of circadian arrhythmicity in rodents and functionally implicate cryptochromes in the homeostatic regulation of sleep.


(Рис.1.)  |  Time course of sleep (upper panels) and NREMS EEG delta power (lower panel)


(Рис.2.)  |  EEG power in the 1–20 Hz range for NREMS, REM sleep (REMS) and wake during baseline.


(Рис.3.)  |  Time course of sleep and NREMS EEG delta power during constant dark conditions (DD)


(Рис.4.)  |  Whole-brain mRNA levels for dbp, per1, and per2 in cry1,2-/- and wild type mice


(Рис.5.)  |  Sleep deprivation alters mRNA levels of per1, per2, and dbp


(Табл. 1 .)  |  Sleep in 12-h light and dark periods under baseline conditions in cry1,2+/+ and cry1,2-/- mice.


(Табл. 2 .)  |  Effect of 6 h SD on sleep time and delta power in cry1,2+/+ and cry1,2-/- mice.

Сон регулируется с помощью циркадных и гомеостатических механизмов. Вследствие сигналов от циркадных часов, расположенных в suprachiasmatic nuclei (SCN) передней части гипоталямуса у млекопитающих, сон наиболее вероятно наступает в определенное время 24 ч. цикла ежедневно. Сон регулируется гомеостатически в том смысле, что потребность (drive) в сне накапливается в отсутствии сна и снижается во время сна. Изменения в потребности сна (sleep drive) т.о., управляется с помощью истории сна-бодрствования (sleep-wake). Гомеостатический и циркадный механизмы взаимодействуют, чтобы определить продолжительность и качество сна и выспанность (wakefulness). Гомеостатическая регуляция сна все еще обнаруживается у животных с отсутствием циркадного ритма после повреждения SCN.
Гомеостатическая регуляция сна м.б. количественно оценена объективно после периода вынужденной бессоницы (т.e., лишения сна), хотя сходные взаимоотношения между параметрами сна и спонтаной выспанностью (wakefulness) м.б. количественно оценены и при baseline условиях. Компенсаторные реакции во время изнуряющей бессоницы, sleep consolidation (т.e., сон в один присест), и/или интенсивность сна, наблюдаемые после продолжительного периода бодрствования, все они принимаются как доказательство, что потребность во сне увеличивается во время бодрстования и что сон регулируется гомеостатически. Интенсивность Non-REM sleep (NREMS) оценивается количественно по силе EEG в ранге delta частот (1–4 Hz), а NREMS consolidation по количественному и предсказуемому взаимоотношению с историей сна: обе переменные увеличиваются с продолжительностью предшествующего бодрствования и постепенно снижаются во время NREMS. Эти переменные являются т.о. количественными маркерами гомеостаза NREMS и, как полагают, отражают лежащую в основе физиологическую потребност во сне.
Временные константы, описывающие динамику увеличения потребности в NREMS во время бодрствования и снижения потребности в NREMS во время NREMS, сравнимы с ролью изменений в экспрессии генов и их регуляцией. Хотя и показано, что продолжительный период бодрствования вызывает изменения в экспрессии генов, однако не выявлено причинно-следственных взаимоотношений между изменениями в экспрессии генов и гомеостазом сна. Исследования на Drosophila melanogaster выявили транскрипционную регуляцию циркадного гена cycle, гомолога гена bmal1 у млекопитающих, в гомеостатиыеской регуляции отдыха. Т.к. отдых у мух обладает некоторым сходством со сном млекопитающих, то остается выяснить, играет ли сходную роль BMAL1 или родственные транскрипционные регуляторы в гомеостатической регуляции сна.
И у мух и у млекопитающих циркадные ритмы генерируются с помощью транскрипционных/трансляционных петель обратной связи, представленных сетью транскрипционных регуляторов. Суть этих само-поддерживающихся молекулярных осцилляций состоит из позитивных и негативных элементов. У млекопитающих, позитивные элементы представлены двумя basic helix-loop-helix (bHLH) PAS-домен-содержащими транскрипционными факторами, CLOCK и BMAL1, которые формируют гетеродимеры, которые м. управлять транскрипцией трех генов period (per) per1–3 и двух cryptochromes (cry1,2). PER1,2 и CRY1,2 белки супрессируют CLOCK:BMAL1-обусловленную транскрипцию, формируя при этом негативные элементы петли обратной связи. В соответствии с их центральной ролью в генерации циркадного ритма, генетическая активация обоих генов cryptochromes (cry1,2-/-) вызывает циркадную аритмичность у мышей. Учитывая широко распространенную экспрессию элементов молекулярных часов в головном мозге (и помимо него) и большое количество генов, регулируемых с помощью bHLH-PAS транскрипционных факторов, роль cryptochromes м. не ограничиваться только функцией циркадных часов. Чтобы определить, осуществляется ли транскрипционная регуляция с помощью CRY1,2 на гомеостатическую регуляцию сна, изучали сон у cry1,2-/- мышей в сnандарных условиях, условиях постоянной темноты и после лишения sleep deprivation (SD). Экспрессию циркадных генов, которые регулируются с помощью cryptochromes, оценивали в головном мозге cry1,2-/- мышей и при лишении сна мышей и крыс дикого типа.

Sleep regulation in cry1,2-/- mice


В стандартных условиях мыши докого типа обнаруживают распределение сон-бодрствование, типичное для таких видов с ночным образом жизни с высокими значениями сна в светлый период и низкими значениями в темный период (Рис. 1, Табл. 1). Распределение сна-бодрстования у cry1,2-/- мышей отличается от контроля (Рис. 1) тем, что переменные сна не отличаются между 12-ч светлим (L) и темным (D) периодами (Табл. 1). Несмотря на это, как и в контроле, переход от светлого к темному периоду сопровождается выраженным снижением времени сна у cry1,2-/- мышей (Рис. 1).
При стандартных условиях, общее ежедневное время NREMS достоверно выше у cry1,2-/- мышей. чем у мышей дикого типа (683 ± 25 vs. 576 ± 12 min, P < 0.002, unpaired t-test), тогда как ежедневное время проведенное в REM сне не отличается (118 ± 7 vs. 113 ± 10 min). Различия между генотипами по времени NREMS обнаруживаются только в темный период, но не в светлый (Табл. 1; Рис. 1). Средняя продолжительность bout (непрерывного) NREMS, измеренная по NREMS consolidation, которая полжительно скоррелирована с высоким давлением гомеостатического сна, была выше на 34% у cry1,2-/- мышей по сравнению с контрольными мышами во время светлого периода и на 41% во время темного периода (Табл. 1). В согласии с этим увеличением sleep consolidation, и сила NREMS delta была занчительно выше у cry1,2-/- , чем у cry1,2+/+мышей (Рис.1). Это различие в силе EEG delta специфично для NREMS и не распространяется на др. EEG частоты (Рис. 2A), оно указывает на то, что оно не связано с различиями в EEG amplification. Это различие особено наглядно при wake-to-NREMS переходе. cry1,2-/- обладают более высокими показателями силы delta, чем cry1,2+/+ непосредственно после начала NREMS (Рис. 2B).
Те же самые генотипические различия наблюдались и в условиях постоянной темноты (DD) (Рис. 3). Мыши без cry1,2 проводят больше времени в NREMS (719 ± 29 vs. 629 ± 29 min, P = 0.053, unpaired t-test), NREMS bouts у них дольше(3.8 ± 0.3 vs. 2.6 ± 0.1 min, P < 0.001, unpaired t-test), а EEG delta power при NREMS вышк у cry1,2-/- по сравнению с контролем (594 ± 21 vs. 448 ± 52 μV2/0.1 Hz, P < 0.04, unpaired t-test; Рис. 3). Снижение времени сна перед началом темноты (Рис. 1) все еще наблюдается при DD у cry1,2+/+ mice; снижение времени сна, наблюдаемое перед началом темного периода у cry1,2-/- мышей при LDне происходит в условиях DD (Рис. 3). В условиях DD меньше REMS у cry1,2-/- мышей, чем у cry1,2+/+ мышей (119 ± 7 vs. 149 ± 9 min, P < 0.03, unpaired t-test) что обусловлено увеличением REMS у cry1,2+/+ мышей при DD (149 ± 9 min) по сравнению с LD (113 ± 10 min, P < 0.03, paired t-test)...
После помещения в условия постоянной темноты cry1,2-/- мыши немедленно становятся аритмичными по уровню поведеления, по уровню SCN электрофизиологии и на клеточно/молекулярном уровне. Из пригодных мышиных моделей циркадной дисфункции только per1,2 двойные мутантные мыши, bmal1 нокаутные мыши и мыши с удаленными SCN обнаруживают сходный драматический фенотип. Т.о., cry1,2-/- мыши являются пригодной моделью для изучения регуляции сна в отсутствие интактных циркадных часов.
В условиях light/dark (LD)запускается рычаг паттернов активности и распределение сна у cry1,2-/- мышей еще подвержено изменчивости в зависимости от темного/светлого периода. LD циклы м. влиять на выраженность сна за счет действия циркадного ритмоводителя, который управляет суточным ритмом сна и/или непосредственно влияет на выраженность сна, при этом 'маскируется' влияние pacemaker на сон. Маскировка является, по-видимому, тем механизмом, с помощью которого свет управляет этим ритмом в условиях LD conditions у cry1,2-/- мышей, т.к. ежедневные модуляции NREMS, которые происходят у cry1,2-/- мышей в условиях цикла сет/темнота немедленно исчезают при помещении в условия постоянной темноты, (Рим. 3). На молекулярном уровне экспрессия per2 (но не per1) является ритмичной в SCN cry1,2-/- мышей в условиях LD. В условиях постоянной темноты per2 ритмичность исчезает одновременно с непоредственной потрей поведенческой ритмичности, это указывает на роль экспрессии 'light-driven' per2 в генерации поведенческих ритмов.
Неожиданной находкой данного исследования оказалось то, что в стандартных условиях cry1,2-/- мыши имеют все признаки высокого давления NREMS, включая более consolidated NREMS, увеличение времени NREMS и высокий уровень EEG delta power по сравнению с мышами дикого типа, которые появляются немедленно с наступлением NREMS. Неспособность cry1,2-/- мышей достичь сильного увеличения любого из этих показателей после 6 ч SD согласуется с интерпретацией, что эти мыши уже находтся под высоким NREMS давлением при стандартных условиях. Определение временных констант, которые наиболее аккуратно описывают динамику NREMS delta power, показало, что во время просыпания склонность к высокой NREMS delta силе увеличивается во время просыпания cry1,2-/- мышей быстрее, чем у мышей дикого типа. Это м. помочь объяснить, почему NREMS delta power постоянно высокая у cry1,2-/- мышей. Совпадение высокого времени NREMS и постоянно высокой delta силы у cry1,2-/- мышей является все еще более выраженным, если учесть, что во время NREMS потребность в NREMS должна dissipate и давать в результате низкую delta силу.
Эти находки у cry1,2-/- мышей противоречат находкам при изучении сна у животных, которые характеризуются аритмией из-за повреждений SCN. У ночных грызунов, повреждения SCN вызывают более фрагментированный сон с низкой EEG delta силой, но суммарное время суточного сна остается неизменным. Повреждения SCN у дневных приматов, squirrel обезьян, проявляются в увеличении времени NREMS, но сон более фрагментирован, с высокой пропорцией 'light' NREMS; т.e., с низким общим уровнем EEG delta силы. Более того, гомеостатическая реакция на лишение сна, по-видимому. не изменена у SCN-поврежденных грызунов. Т.о., характеристики сна у cry1,2-/- мышей не подтверждают концепцию cry1,2-/- м sitq как простой генетической модели для устранения циркадных часов в SCN. Полученные результаты сравнимы с ролью cryptochromes в гомеостатической регуляции сна в дополнение к их роли в генерации циркадного ритма.
Предполагается существование сложных взамиоотношений между гомеостатическими и циркадными влияниями на сон на молекулярном уровне. Делеция гена cycle у Drosophila дает мух, которые имеют преувеличенную гомеостатическую реакцию в ответ лишение отдыха в дополнение к отсутствию у них циркадной ритмичности. Мухи с мутацией в гене cryptochrome обнаруживают также увеличенное время отдыха, также как и снижение компенсаторной реакции на лишение отдыха. Мутация clock у мышей, у которых обнаруживается выраженный эффект на циркадную ритмичность, снижает время и consolidation NREMS в стандартных условиях. Фенотип сна clock обратен характеристикам сна у cry1,2-/- мышей и это согласуется с прдположением, что CLOCK и CRY1,2 являются позитивным и негативными транскрипционными регуляторами, соотв. Albumin D-binding protein (Dbp) является транскрипционным фактором, чья экспрессия находится под прямым контролем CLOCK:BMAL1. Делеция гена dbp вызывает укорочение циркадного пеиода и снижает sleep consolidation и NREMS delta силу.
Предполагается, что эффекты на сон, наблюдаемые у cry1,2-/- мышей являются результатом cryptochrome-зависиого ингибирования транскрипционной активации, осуществляемой bHLH-PAS гетеродимерами CLOCK:BMAL1 и NPAS2:BMAL1, хотя cryptochromes играют также роль в стабилизации и ядерном секвестрировании белков PER, и в фоторецепции. Отсутствие cryptochromes вызывает повышение уровней мРНК CLOCK/NPAS2:BMAL1 генов-мишеней, включая циркадные гены per1 и per2. Экспрессия этих двух генов рассматривается как изменчивое состояние молекулярных циркадных часов или маркер для CLOCK/NPAS2:BMAL1-индуцированной транскрипции, хотя, по крайней мере транскрипция per1 . м. также (быстро) индуцироваться светом, через CREB-зависимый сигнальный путь. Наблюдение высоких уровней транскриптов per1,2 в головном мозге при стандартных условиях уcry1,2-/- мышей открывает возможность, что эти или др. CLOCK/NPAS2:BMAL1 гены-мишени вовлечены в гомеостатическую регуляцию сна. Наблюдение повышенной экспрессии гена per в коре у у крыс и мвшей, лишенных сна (Рис. 5) подтверждает эту гипотезу.
Увеличение экспрессии per после лишения сна специфично для коры мозга, хотя нельзя исключить, что экспрессия циркадного гена меняется в зависимости отsleep-wake истории специфических ядер внутри др. двух изученных областей; т.e., гипоталямуса и основания переднего мозга. Неожиданно небольшое количество (~0.5%) из ~10,000 генов, скринированных с помощью mRNA differential display и cDNA microarrays в коре, изменяют свою экспрессию в ответ на лишение сна. Однако, гены, меняющие свою экспрессию в ответ на лишение сна (per1, per2, dbp), не были идентифицированы при использоваии этих подходов. Экспрессия cry1,2 на уровне мРНК не меняется на лишение сна у диких мышей. Это наблюдение не обязательно ставит под сомнение пряму роль белков CRY в обеспечении реакции на лишение сна. CRY белки м. играть роль на постоянных стабильных уровнях или они м.б. пост-трансляционными изменениями в функционировании CRY белков в связи с подавлением сна, такими как состояни фосфорилирования, убиквитилирования или внутриклеточной локализации белка, все это регулируется динамически, во всяком случае, in vitro. В печени, оссцилляции белков CRY не обязательны для циркадных осцилляций транскриптов-мишеней, т.к. CRY белки присутствуют в избытке PER, а осцилляции последнего продуцируют ритмичность. Сходная ситуация м. существовать в коре.
Высокие уровни per у cry1,2-/- мышей и низкие уровни per у мутантных мышей clock коррлируют с их контрастирующими фенотипами сна. В этом контексте аномалии сна у dbp-/- мышей м.б. связаны с редукцией экспрессии per т.к., по крайней мереin vitro, DBP м. амплифицировать CLOCK:BMAL1-индуцированную транскрипцию per , но неизвестно, изменен ли уровень транскриптов per у dbp-/- мышей. Есть и др. подтверждения, что кортикальные уровни экспрессии per у животных дикого типа высоки тогда, когда высокая потребность во сне, независимо от фазы, в какой достигается пик циркадной экспрессииper в SCN. Т.о., и у ночных и дневных животных экспрессия per в коре максимальна в связи с основным waking episode. В условиях, когда фаза (methamphetamine, ограничение питания) или распределение (circadian splitting) локомоторной активности нарушена,то экспрессия per в коре обнаруживает параллелизм с ритмом бодрствования, тогда как циркадные осцилляции экспрессии гена per в SCN остаются неизменными. Т.о., в противоположность своей роли в SCN, белок PER в коре головного мозга не является компонентом само-поддерживающегося циркадного осциллятора. Вместо этого экспрессия per в коре, по-видимому, следует sleep-wake истории, в соответствии с гипотезой, что он имеет отношение к гомеостатиче кой регуляции сна. Однако, Экспрессия per генов изучена на сегодня на уровне мРНК. Уровень белка PER м. затрагиваться дифференциально по сравнению с уровнями мРНК per , а уровень белка PER снижен у cry1,2-/- мышей в результате снижения сабильности PER белков в отсутствие партнеров по гетеродимеризации CRY.

Conclusions

Итак, мРНК per1,2 являются транскрипционными мишенями для cry1,2 . В их контроле помимо CRY белков участвуют CLOCK/NPAS2:BMAL1. По крайней мере 90 генов регулируются сходным образом с помощью NPAS2:BMAL1, но идентичность генов-мишеней, критических для NREMS фенотипа у cry1,2-/- мышей еще необходимо установить. В отсутствие cry1,2, стабильность и общий уровень PER белков, особенно в ядрах клеток, снижен. Поэтому важно наблюдать за сном у per1,2 одиночных и двойных мутантных мышей. Нокаутные per1 мыши и мыши, экспрессирующие нефункциональный PER2 белок, обнаруживают незначительные отличия от контроля при гомеостатическом восстановлении после SD, это согласуется с гипотезой, что эти гены коррелируют гомеостазис сна. Измерение эффектов подавления сна на экспрессию cry1,2 и per1,2 генов на уровне белков предоставит дополнительную важную информацию. Наконец, интересно, что транскрипционная активность CLOCK/NPAS2:BMAL1 чувствительна к состоянию окислительно-восстановительного потенциала. Их транскрипционная активность м. обеспечивать связь между нейрональной активностью и функцией регуляции энергии для NREMS.


Сайт создан в системе uCoz