WMZ: Z191701361450 WMR: R209318204033 |
The small RNA world | |||
Среди животных, endogenous-small-interfering (endo-si) RNA пути до сих пор были ограничены Caenorhabditis elegans. В 7 работах сообщается сегодня об открытии endo-siRNA путей в ооцитах Drosophila melanogaster и мышей. Во время RNA interference (RNAi), члены семейства белков Dicer расщепляют двунитчатую РНК (ds)RNA из эндогенного или экзогенного источника в 21-24 нуклеотида siRNAs. Расщепление dsRNA связано с загрузкой этих siRNAs на RNA-induced silencing complex (RISC). siRNA направляет RISC комплекс к соответствующей мРНК мишени, которая деградирует посредством расщепления сс помощью Argonaute (AGO) белков. в
Группы Greg Hannon и Hiroyuki Sasaki обнаружили большие количества как Piwi-interacting RNAs (piRNAs) , так и endo-siRNAs, которые соответствовали мРНК или ретротранспозонам в растущих ооцитах. Endo-siRNAs были картированы исключительно в ретротранспозонах или др. геномных регионах, которые продуцируют транскрипты, способные формировать структуры dsRNA. Геномные источники dsRNAs, которые генерируют endo-siRNAs, включают структуры инвертированных повторов, места двунаправленной транскрипции и антисмысловые транскрипты с различных локусов, включая ретротранспозоны и псевдогены. Потеря Dicer или AGO2 приводит к снижению уровней endo-siRNAs и увеличивают уровни ретротранспозонов и белок кодирующих транскриптов, которые комплементарны endo-siRNAs. Эти находки выявляют роль endo-siRNAs у млекопитающих и показывают, что RNAi путь регулирует как белок-кодирующие транскрипты, так и ретротранспозоны в ооцитах мышей.
Endo-siRNAs были также описаны в гонадных и соматических клетках D. melanogaster группами Greg Hannon, Eric Lai, Haruhiko and Mikiko Siom и Phil Zamore. Большинство endo-siRNAs соответствуют транспозонам, гетерохроматиновым последовательностям и cis-natural антисмысловым транскриптам и могут находить как белок-кодирующие гены, так и мобильные элементы. Endo-siRNAs возникают также из длинных шпилечных РНК генов и находят избранные мРНК в транс-положении. Интересно. что продукция endo-siRNA у мух нуждается не только в канонических RNAi факторах (Dicer-2 and AGO2),но и также в каноническом факторе биогенеза microRNA Loquacious. Напротив, piRNAs , как полагают, генерируется из однонитчатых РНК предшественников и их продукция у мух и позвоночных не нуждается в Dicer. Потеря endo-siRNAs коррелирует с потерей молчания транспозонов, это указывает на то, что endo-siRNAs заставлют молчать транспозоны в соме мух точно также, как piRNAs заставляют молчать транспозоны в зародышевой линии. в
Всё это указывает на эволюционную консервацию dsRNAs в качестве регуляторных молекул, ранее описанной только для microRNAs, возникают новые регуляторные возможности для путей эндогенных малых РНК.
|
Малые РНК появились на сцене как повсеместные, разносторонние репрессоры генной экспрессии у растений, животных и многих грибов. repressors of gene expression in plants, animals и many fungi. Эти небольшие РНК (~21-26 nt), которые вызвают молчанеи благодаря взаимодействию с гомологичными, проявляются во множестве личин: short interfering (si) РНК (Elbashir et al., 2001>), small temporal (st) РНК (Pasquinelli et al., 2000), гетерохроматиновые siРНК (Reinhart и Bartel, 2002), малые некодирующие РНК (Ambros et al., 2003a) и microРНК (miРНК) (Lee и Ambros, 2001; Lau et al., 2001; Lagos-Quintana et al., 2001). Они м. контролировать стабильность или трансляцию мРНК или направлять эпигенетические модификации в специфические области генома. Малые РНК и эволюционно законсервированные пути РНК-обусловленного молчания составляют новый образец (paradigm) для понимания регуляции генов у эукариот и выявляют новую защиту от вирусов и транспозонов.
Небольшие регуляторные РНК генерируются посредством процессинга более длинных double-stranded RNA (dsRNA) предшественников с помощью RNaseIII-подобного энзима, называемого Dicer (Bernstein et al., 2001). Несмотря на всеобщую консервацию механизмов РНК-обусловленного молчания, этот ключевой энзим разноообразен структурно и численно в разных таксонах (Schauer et al., 2002). Так, имеется единственный Dicer белок у млекопитающих, Caenorhabditis elegans и делящихся дрожжей, а Drosophila melanogaster имеет 2, a у Arabidopsis thaliana имеется 4 dicer-like (DCL) белка (Schauer et al., 2002). 2 Arabidopsis DCL белка (DCL1 и DCL4) содержат один или более предполагаемый nuclear localization signals (NLS), указывая тем самым и на ядерный и цитоплазматический путь процессинга dsRNA у растений. И в самом деле имеются доказательства того, что DCL1 является ядерным белком (Papp et al., 2003). Ядерный процессинг dsRNA м. также происходить и у др. организмов: один из двух Dicers у Drosophila содержит предполагаемый NLS также как и единственный Dicer у млекопитающих (Schauer et al., 2002). Хотя Dicer млекопитающих, как было установлено, локализуется в цитоплазме (Billy et al., 2001), недавние исследования подтвердили, что он м. вызывать процессингне-полиаденилированной dsRNA в ядре (Shinagawa и Ishii, 2003). Описываемая здесь и ядерная (N) и цитоплазматическа (C) активность Dicer м. присутствовать не во всех организмах. Dicer действует в комплексе с др. белками, включая членов семейства Argonaute (Carmell et al., 2002) и возможно HEN1 (Park et al., 2002; Boutet et al., 2003), чтобы продуцировать малые РНК.
siРНК ассоциированы с молчанием, запускаемым с помощью трансгенов, микроинъецированных РНК, вирусов и транспозонов, и , следовательно, м. рассматриваться как промежуточная на путях защиты хозяина от чужеродных нуклеиновых кислот. siРНК впервые выявлена у растений (Hamilton и Baulcombe, 1999). В целом, siРНК м.б. получена из всех регионов бузупречной дуплексной РНК и, по крайней мере у растений, она накапливается как на смысловых, так и бессмысленных polarities. Совершенная дуплексная РНК м.б. получена с помощью транскрипции с `hairpin' (hp) трансгена, которая продуцирует соотв. hpRNA (см. ядерный зеленый путь). У Arabidopsis, активность DCL, которая продуцирует siРНК, еще не идентифицирована; однако DCL1 , по-видимому, не участвует в этом (Finnegan et al., 2003; Papp et al., 2003). Хотя здесь не показано, но растения имеют два функционально отличающихся по размерам класса малых РНК. Более короткий класс, 21-22 nt, участвует в деградации мРНК, большего размера класс, 24-26 nt, в управлении метилированием ДНК и в системном молчании (Hamilton et al., 2002). Отдельные DCL активности м.б. необходимы для для продукции этих двух size классов малых РНК (Tang et al., 2003; Papp et al., 2003).
miРНК это малые РНК, которые подавляют эндогенные гены, важные для осуществления онтогенетических программ у животных и растений (Carrington и Ambros, 2003; Bartel и Bartel, 2003; Hunter и Poethig, 2003). Классические miРНК, lin-4 и let-7 [первоначально названные stРНК (Pasquinelli et al., 2000)], были открыты благодаря их heterochronic мутантным фенотипам у C. elegans (Lee et al., 1993; Reinhart et al., 2000). Попытки клонировать избранного размера РНК выявили многочисленные miРНК у C. elegans, Arabidopsis и мышей (Lagos-Quintana et al., 2001; Lee и Ambros, 2001; Lau et al., 2001; Llave et al., 2002a; Reinhart et al., 2002; Lagos-Quintana et al., 2002; Park et al., 2002; Ambros et al., 2003a). miРНК получаются посредстом Dicer расщепления несовершенной дуплексной РНК, ~70-200 nt в длину (Hutvagner et al., 2001; Grishok et al., 2001; Ambros et al., 2003b), которые кодируются в межгенных областях геномов растений и животных. miРНК накапливаются в одной ориентации и часто только из одной области предшественников dsRNA. У Arabidopsis, DCL1 , как было показано, обеспечивает процессинг предшественников miRNA (Rhoades et al., 2002; Park et al., 2002). Имеются косвенные доказательства того, что это м. происходить в ядре, что согласуется с очевидной ядерной локализацией DCL1 (Papp et al., 2003) (светло голубой путь). Др. предшественники miRNA м. подвергаться процессингу с помощью Dicer активностей в цитоплазме (Lee et al., 2002) (см. пурпурный путь). Экспрессия большинства miRNA генов регулируется онтогенетически у Arabidopsis, C. elegans, мышей и Drosophila (Reinhart et al., 2002; Park et al., 2002; Llave et al., 2002a; Pasquinelli и Ruvkun, 2002; Lagos-Quintana et al., 2002; Ambros et al., 2003a; Brennecke et al., 2003). Это м. б. обусловлено присутствием временных регуляторных элементов в промоторах генов miRNA, как это было показано для let-7 miRNA у C. elegans (Johnson et al., 2003).
miРНК и siРНК молчание на пост-транскрипционном уровне осуществляется с помощью действительно комплементраности их последовательностей по отношению к мРНК-мишеням. siРНК ассоциирует с комплексом, содержащим endonuclease, RISC (RNA induced silencing complex) (Hammond et al., 2000), и вызывает деградацию родственных mРНК и у растений и вирусной РНК (см. оранжевый путь). Этот процесс назван RNAi у животных, post-transcriptional gene silencing (PTGS) у растений и quelling у филаментозного гриба Neurospora crassa (Zamore, 2002; Waterhouse и Helliwell, 2003; Denli и Hannon, 2003; Pickford и Cogoni, 2003). miРНК, которая также, по-видимому, ассоциирует с RISC-подобным комплексом (Denli и Hannon, 2003), м. или спаривать свои основания с 3' UTR мРНК и блокировать трансляцию (Olsen и Ambros, 1999) или действовать подобно siРНК и и приводить к деградации мРНК (Llave et al., 2002b; Kasschau et al., 2003; Boutet et al., 2003) (см. пурпурный путь). Выбор между этими двумя путями, по-видимому, предопределяется с помощью степени комплементарности между данной miRNA и её мРНК-мишенью (Carrington и Ambros, 2003). Т.к. большинство miРНК животных спаривают основания несовершенно со своими мишенями, то предпочтительным способо молчания у таких организмов является репрессии трансляции. Напротив, растительная miРНК часто обнаруживает совершенную комплементарность со воими мишенями и, следовательно, запускает деградацию мРНК (Llave et al., 2002b; Tang et al., 2003; Kasschau et al., 2003). Однако комплементарность растительных miРНК с 3' UTRs м., по-видимому, приводить к репрессии трансляции (Chen, 2003). Ни суть реакций РНК-обусловленного молчания известна только в общем у растений и живторных (Tang et al., 2003; Voinnet, 2003), ни точные компоненты RISC у разных организмов и то, как этот комплекс функционирует, чтобы обеспечивать два довольно отличающихся способа молчания, всё ещё до конца неизвестнsы (Denli и Hannon, 2003). Белки, которые м. предопределять, будет использована или siРНК или miРНК в качестве субстрата для RISC, являются разнообразными членами семейства Argonaute (Ago) (Denli и Hannon, 2003). Argonaute белки были изолированы из комплекса RISC Drosophila и они необходимы для RNAi и родственных феноменов у разных организмов (Carmell et al., 2002).
Компьтерные подсчеты общего количества генов miRNA у человека дают цифру в 200-255 и у C. elegans свыше 123 (Lim et al., 2003a; Lim et al., 2003b). Идентификация мишеней этих miРНК имеет большое значение. У C. elegans, lin-4 репрессирует LIN-14 и LIN-28, которые регулируют ранние онтогенетические переходы (Carrington и Ambros, 2003), а let-7 репрессирует LIN-41, который участвует в контроле поздних переходов (Banerjee и Slack, 2002). Недавно открыта мишень для miRNA у C. elegans ген hunchback-like hbl1-1, который контролирует время онтогенетических процессов (Abrahante et al., 2003; Lin et al., 2003). miRNA bantam у Drosophila нацелена на ген Hid1, участвующий в апоптозе (Brennecke et al., 2003). Hes1, basic helix-loop-helix репрессор транскрипции, регулируется с помощью miRNA-23 в нейрональных клетках человека (Kawasaki и Taira, 2003). Хотя компьютерные подходы не были ещё использованы для подсчёта количества miРНК у растений, но клонирование малых РНК открыло 19 уникальных miРНК, кодируемых с помощью 41 miRNA генов (Bartel и Bartel, 2003), которые являются скорее всего лишь частью от общего количества. Многие из Arabidopsis miРНК комплементарны мРНК транскрипционных факторов, которые контролируют решения судьбы в меристеме побегов (Rhoades et al., 2002; Llave et al., 2002b). Др. регулируют РНК метаболизм (Bartel и Bartel, 2003), включая miRNA, которые регулируют уровни DCL1 мРНК (Xie et al., 2003).
Недавно идентифицирована связь между RNAi и эпигенетическими альтерациями генома, такими как метилирование ДНК и модификации гистонов. РНК-управляемое метилирование ДНК (RdDM), впервые открыто у растений (Wassenegger et al., 1994), нуждается в dsRNA, котораяы подвергается переработке до 21-24 nt малой РНК. У Arabidopsis идентифицированы связи между локус-специфическими малыми РНК, ДНК methyltransferases, и модификациями гистонов, включая деацетилирование, (Aufsatz et al., 2002) и метилирование гистона H3 lysine 9 (H3K9) (Jackson et al., 2002; Zilberman et al., 2003) (см. красный путь). Некоторые малые РНК, идентифицированные у Arabidopsis, м. находить нативные промоторы эндогенных генов (Park et al., 2002) (см. пунктирный голубой путь).
Связь между RNAi и модификациями хроматина подкреплена результатами, полученными на делящихся дрожжах, показавших, что малые РНК, комплементарные центромерным повторам и белкам пути RNAi [Dicer, RNA-dependent RNA polymerase (Rdp) и Ago], необходимы для метилирования гистона H3K9 и функционирования центромер (Volpe et al., 2002; Volpe et al., 2003; Hall et al., 2003). Сходным образом, копии центромерных повторов в локусе типов спаривания у S. pombe также являются мишенью для RNAi-обусловленного образования гетерохроматина (Hall et al., 2002). Центромерная siРНК названна 'heterochromatic siРНК', чтобы подчеркнуть ее участие в эпигенетических модификациях, она происходит из перекрывающихся транскриптов центромерных наружных повторов (Reinhart и Bartel, 2002) (см. чёрный путь). RNAi-зависимые модификации хроматина также м.б. нацелены на длинные терминальные повторы ретротранспозонов в S. pombe, тем самым они репрессируют соседние мейотически индуцируемые гены в вегетативных клетках (Schramke и Allshire, 2003). RNAi-индуцированное образование гетерохроматина, т.о. кажется общим способом регуляции экспрессии генов у S. pombe. Степень, с которой это поддерживается у высших организмов, пока неизвестна. У Drosophila Ago белок, Piwi, необходим для замалчивания транскрипции гена, обеспечиваемого белками группы polycomb (Pal Bhadra et al., 2002). Малая РНК категории 'малых некодирующих РНК', выявленая у C. elegans, также м. б. нацелана на модифицирование хроматина (Ambros et al., 2003b). Участие малой РНК в ведении элиминации последовательностей ДНК во время ядерного развития у Tetrahymena (Mochizuki et al., 2002; Yao et al., 2003) ещё больше расширяет область РНК-обусловленных геномных изменений.
Gemn HYR-обусловленного молчания борются с 'чужеродными' нуклеиновыми кислотами? как это показано с помощью silencing-дефицитрных мутантов, некоторые из которых высвобождают транспозоны (Plasterk, 2002) или, у растений, обеспечивают повышенную чувствительность к вирусной инфекции (Vance и Vaucheret, 2001; Voinnet, 2002). Большинство растительных вирусов имеют РНК геном и синтезируют dsRNA во время своего репликационного цикла, который м. потенциально запускать продукцию siRNA и в конечном счёте деградацию вирусного генома (см. зеленый и оранжевый пути). Сущетвенную роль в РНК-обусловленном молчании, направленном на защиту от вирусов, играет то, что многие растительные вирусы кодируют белки, которые м. супрессировать молчание в разных точках пути (Hamilton et al., 2002; Mallory et al., 2002) и потенциально влиять на развитие растений, блокируя miRNA-управляемое расщепление мРНК (Kasschau et al., 2003). Хотя антивирусная роль RNAi предполагается и у Drosophila (Li et al., 2002), однако мы ещё не знаем, выполняет ли RNAi сходную функциюв клетках млекопитающих (Gitlin и Andino, 2003).
Наконец, systemic silencing, которое было обнаружено у растений (Palauqui et al., 1997; Voinnet et al., 1998) и C. elegans (Timmons и Fire, 1998; Winston et al., 2002), но не обнаружено у Drosophila (Roignant et al., 2003). Silencing сигнал, по-видимому, siRNA (Himber et al., 2003), способен перемещаться от клетки к клетке и, у растений, проникает в сосудистую систему, индуцируя сиквенс-специфическое молчание в отдалённых сайтах (Mlotshwa et al., 2002) (см. пунктирный зеленый путь).
Изумительное разнообразие регуляторных путей, управляемых малыми РНК было выявлено благодаря комбинации генетических и биохимическиъх подходов. Это разнообразие было достигнуто благодаря ассоциации этих РНК с различными белками-партнёрами в комплексах, которые деградируют сходную вирусную или мРНК, блокируя трансляцию или модифицируя структуру хроматина. Многие компоненты этих комплексов - напр., endonuclease компонент комплекса RISC - ещё предстоит идентифицировать. Эти рибонуклеопротеиновые комплексы управляют своими мишенями посредством комплементарных последовательностей у мишени и малой РНК. Остаётся идентифицировать мишени для большинства предполагаемых miРНК и определить как малые РНК отправляются по разным путям за счёт ассоцииации с соответствующими белками-партнёрами. Note added in proof Клонирование небольшой РНК из Drosophila выявило 62 non-redundant microРНК и 178 repeat-associated small interfering РНК (rasiРНК), которые происходят из довольно известного типа транспозонов генома Drosophila. Эти rasiРНК потенциально м. регулировать мобильность транспозонов и сборку гетерохроматина в богатых транспозонами регионах, таких как теломеры и центромеры (Aravin et al., 2003).
Белок Drosophila R2D2, который является гомологом C. elegans RNAi белка RDE-4, ассоциирует с Dicer, чтобы облегчить связывание siRNA и сиквенс-специфическую деградацию мРНК с помощью RNA-silencing induced complex (RISC) (Liu et al., 2003).
Хотя первоначальные сообщения указывали на то, что только miРНК с совершенными комплементраными последовательностями со своими мишенями вызывают расщеплние мРНК-мишени, но недавние исследования показывают, что это не всегда так. Arabidopsis miR-JAW регулирует 5 членов семейства TCP транскрипионных факторов с помощью расщеления мРНК, даже при их не полностью комплементарных последовательностях у всех пяти TCP транскриптов (Palatinik et al., 2003).
The C. elegans белок SID-1 существенен для поступления dsRNA в клетки и необходим для системной RNAi. Экспрессия SID-1 у Drosophila, у которой отсутствует системная RNAi, обеспечивает способность поставлять dsRNA в клетки Drosophila(Feinberg и Hunter, 2003)
|