THE SARCOPLASMIC RETICULUM: ITS DISCOVERY AND REDISCOVERY
Paolo Mazzarello (mazzarello@igm.cnr.it), Alberto Calligaro, Vanio Vannini & Umberto Muscatello Nature Reviews Molecular Cell Biology Vol 4 No 1, 69-74 (2003)
In 1902, Emilio Veratti made the most accurate description, by light microscopy, of a reticular structure in the sarcoplasm. However, this structure was almost lost to man's knowledge for more than 50 years and was rediscovered during the 1960s, following the introduction of electron microscopy. Since then, biochemistry, electron microscopy and electrophysiology have unravelled the crucial role of the sarcoplasmic reticulum in the control of muscle contraction.
(Рис.5.) | Bennett's graphic interpretation of the experiments of Andrew F. Huxley and Robert E. Taylor (1, 2 and 4, 5) on the basis of Veratti's 1902 drawings (3 and 6).
Перевод с итальянского заметок столетней давности Emilio Veratti — молодого ассистента Camillo Golgi из Institute of General Pathology and Histology at the University of Pavia (Box 1) проиллюстрировал с мельчайших деталях описанный элегантный "reticular apparatus of the sarcoplasm", который распределяется с геометрической регулярностью вдоль поперечной исчерченности мышц. К сожалению, более полувека эта прекрасная статья оcтавалась незамеченной цитолагами. Ее открытие и перевод на англ. совпал с открытием с помощью электронного микроскопа эквивалентной тубулярной системы в мышечном волокне с физиологическим и биохимическим описанием механизмов мышечнго сокращения и реляксации.
Электронно-микроскопические исследования показали, что саркомерная структура состоит из двух отдельных систем мембран: собственно sarcoplasmic reticulum, который располагается между миофибриллами; и T трубочек, которые являются продолжением сарколеммной мембраны. Фактически, работа Veratti's содержит более аккуратное и развернутое описание, полученное с помощью светового микроскопа, T системы — фундаментальной мышечной структуры, связанной с циклом сокращения и расслабления мышц.
The first observation
Первые наблюдения структуры — позднее идентифицированной как часть саркоплазматического ретикулёма — были сделанаы, по-видимому, в 1890 шведским гистологом Gustav Retzius и, в особенности, испанским нейробиологом Santiago Ramón y Cajal (Рис. 1). Cajal использовал метод 'black reaction' — реакцию хромата серебра — Golgi, в то время был неизвестен большинство европейских гистологов. Как рассказал Cajal's в своей автобиографии Recuerdos de mi vida, во время визита в лаб. психиатра Luis Simarro Lacabra в Мадриде в 1887, он был поражен м-дом Golgi's и стал сразу же его использовать "...with his own eyes the marvellous revelatory power of the silver chromate reaction". Помимо central nervous system (CNS), Cajal использовал эту реакцию и в др. тканях, в частности в мышцах конечностей и крыльев насекомых. Внутри мышечного волокна, Cajal наблюдал две очень тонкие сети (reticula) в каждом мышечном сегменте (саркомере), которые располагались поперечно в виде параллелей и были связаны продольными линиями и находились примерно на границе темных birefractive дисков (Рис. 2). Эти сетчатые (reticular) структуры, по-видимому, составляли одно целое с тонкими терминальными веточками системы трахей, обнаруэживаемой в тесной близи к мышечной ткани у насекомых
Изучение мышц с использованием реакции чернения проводилось и в Италии Romeo Fusari (Рис. 3), одним из Golgi's фаворитов в Institute of General Pathology в Pavia. В 1893 и 1894, Fusari представил три собщения в Academy of Medical and Natural Sciences of Ferrara, в которых кратко описывал предварительные результаты, полученные при изучении мышц многих видов животных, включая и насекомых, млекопитающих, птиц и амфибий. Тексты этих сообщений появились на французском и в Archives Italiennes de Biologie. Fusari открыл, что ретикулярные структуры, уже обнаруженные и Cajal,м. легко обнаруживаться в поперечно-исчерченных мышцах большинства видов животных. Он также установил, что они м.б. распределены или в промежуточном положении вдоль саркомера — подтверждая предыдущие наблюдения Cajal — или на уровне Z линий (или Z дисков), проявляясь в виде темной линии, которая рассекает I диск на саркомеры. Во время сокращения, два соседних ретикулярных компонента одного и того же саркомера, по-видимому, сливаются в один.
Fusari, сообщая эти результаты, привел и некоторые гистологические препараты для подтверждения своих выводов на анатомической секции eleventh International Congress of Medical Science в Риме в 1894, это привлекло внимание тысяч клиницистов и ученых всего мира. Сообщения его однако были подвергнуты строгой критике гистолога Pio Mingazzini, согласно которой Golgi's silver chromate реакция "...although useful for demonstrating many details of the nervous system, does not serve the same purpose for other tissues". Кроме того, Mingazzini утверждал, что "the alleged reticule", описанные Fusari, лишь артефакт "metallic precipitation in the sarcoplasm" среди фибрилл, и не отражают структурной специфичности организации мышечных волокон. Др. критик Giovanni Paladino из Неаполя Naples советовал Fusari пользоваться более гистологическими методами "...to obtain stronger results..." при изучении "...such complex elements as the striated muscle fibres...".
Эта критика, по-видимому, погасила энтузиазм Fusari's и очевидно по этой причине столь "enriched by illustrations" работа не была опубликована.
An undisputed reticulum
Изучение мышечной структуры, с использованием black reaction, было продолжено Veratti (Box 1), который был др. выдающимся учеником Golgi. После открытия Golgi, в 1897–1898 "fine and elegant reticulum hidden in the cell body" — позднее известного как аппарат Гольджи или Golgi комплекс — интерес к внутриклеточным ретикулярным структурам вырос. После испешного использования, сделавшего реакцию на аппарат Гольджи воспроизводимой, Veratti быстро стал поборником такого типа исследований. Его эксперименты убедили его, что silver chromate reaction является "precious cytological method", и Veratti обратилися к исследованиям, начатым Fusari. Veratti был еще больше воодушевлен удачными наблюдениями "...images [reticula] of singular fineness in newborn mouse neck muscles treated with the black reaction (for other purposes)". Он использовал Golgi's silver chromate метод для изучения мышечных волокон многих видов животных. Он сообщил о предварительных результатах своих исследований в Istituto Lombardo di Scienze e Lettere и затем опубликовал обширные записки (memoir), которые он прочитал в том же самом Institute 13 March 1902.
Детальные исследования Veratti's и великолепные иллюстрации выявили, вне всякого сомнения, существование "true reticular apparatus constituted of filaments", дифференцирующегося в саркоплазме вдоль контрактильных фибрил (Рис. 4a). Veratti покзал экстенсивное распределение этого ретикулема в разных группах животных, существенно расширив мало опубликованные наблюдения Fusari.
Кроме того, Veratti исследовал морфологические изменения во время развития этого ретикулярного аппарата и открыл, что полная организация ретикулёма достигается по прохождении ряда стадий. У взрослых животных этот аппарат "...may be considered to be formed of a series of transverse reticula united to each other by longitudinal filaments. The transverse reticula occupy fixed positions, relative to the sarcomeric component of the striation..." которые отличаются у разных видов характерным образом.
В мышцах насекомых Veratti не удалось обнаружить случаев, в которых фи ламенты из ретикулярного аппарата четко бы происходили из трахей, и пришел к выводу. что "...the reticular apparatus that stains with the black reaction in the limb muscles of insects cannot be interpreted as a system of tracheal capillaries".
Veratti сделал важное наблюдение относительно взаимоотношений между ретикулёмом и сарколеммой. На внутренней поверхности клеточной мембраны он обнаружил, что некоторые филаменты ретикулёма "...implant themselves by means of triangular enlargements" (Рис. 4b). Это морфологическое наблюдение, будучи подтверждено электронно-микроскопически, стало основой нашего понимания функции саркоплазматического ретикулёма.
Veratti не предложил какой-либо функциональной гипотезы для описанной им структуры. Отностительно его взаимосвязи с аппаратом Гольджи, он подчеркивал морфологическую аналогию "...between the reticular apparatus of muscles and the apparatuses described in many types of epithelial and connective tissue cells by Golgi and his students". Однако, он всегда добавлял, что эта аналогия "...is not such (...) as to permit us to affirm the identity of the two types of structures".
Almost a forgotten structure
Veratti's работы не оказывали какого-либо существенного влияния на исследования развития мышц более 50 лет. Некоторые исследовалели, пытавшиеся идентифицировать мышечный ретикулём — часто принимали 'the Cajal–Fusari network' — за аппарат Гольджи мышц. Напр., в 1929, Beams утверждал "...the general opinion among students of the Golgi apparatus, that the so-called Cajal–Fusari network of muscle tissue is homologous with the Golgi material of other tissues". Однако, т.к. само существование аппарата Гольджи дебатировалось десятилетиями, то и существование специфического мышечного ретикулярного компонента также оказывалось неопределенным. Тем не менее, после открытия Emerico Luna, в 1911, локализованных структур в мышечных волокнах сердца млекопитающих, которые рассматривались эквивалентами аппарата Гольджи
— но полностью отличными от ретикулёма, наблюдаемого Veratti — некоторые исследователи были убеждены в независимом существовании этого специфического ретикулёма в саркоплазме. Однако, со временем эти высоко организованные структуры стали "...a virtually forgotten component of muscle, or rather a component which was generally considered to be spurious".
Rediscovery of the reticulum
Clara Franzini Armstrong, в своем выдающемся обзоре о структурном вкладе в изучении активации мышц отметила, что публикация приложения к августовскому номеру 1961 Journal of Biophysical and Biochemical Cytology — английского перевода монографии Veratti's — заметно возрадила интерес к работам Veratti's и простимулировала к новым исследования саркоплазматического ретикулёма. Это стало точкой слияния или синтеза различных методологических подходов к изучению мышечного сокращения и расслабления.
The biochemical approach.
В начале 1950s, стало очевидным, что мышечное сокращение существенно базируется на взаимодействии между актомиозином — контрактильным белковым комплексом, образуемым актином и миозином — и АТФ. Это стартовала новая фаза исследований мышечной физиологии, которая характеризуется использованием очищенных белков или мышечных гомогенатов в качестве экспериментальной модели мышечного сокращения. B.B. Marsh сделал свое замечательное наблюдение, что супернатант из фрагментированных мышечных волокон содержит 'relaxing factor', который ингибирует миофибриллярную ATPase и АТФ-индуцированную суперпреципитацию изолированных миофибрил.
Relaxing активность оказалась связанной с несколькими transphosphorylase системами. Однако, Hildegard Portzehl показал, что высшие ферментативные системы не м.б. идентифицированы с помощью реляксирующего или 'Marsh фактора', и что relaxing активность 'Marsh supernatant фракции' связана с присутствием 'granules' во фракции, которая седиментирует при 35,000 g. Эта находка согласуется с наблюдением, что реляксация glycerol-экстаргированных мышечных пучков нуждается в добавлении 'granular' ATPase из скелетных мышц. однако, при определенных условиях, реляксирующая активность, по-видимому, ассоциирует с диффундирующим материалом скорее, чем с везикулярной фракцией. Эти результаты суммированы Dorothy Needham: "How exactly the Marsh factor came in and out of play is one of the most obscure problems at the present time".
Возможность, что реляксирующая активность фактора Marsh м.б. объяснена связыанием ионов металлов, впервые предположил Victor Perry. Косвенные доказательства получены с помолщью обнаружения, что chelator ионов металлов EDTA м. индуцировать реляксацию мышечных волокон в условиях, которые сходны с теми, что необходимы для активности Marsh-фактора. Однако, более существенный вклад внес Annemarie Weber, показавший, что реакция системы актомиозина с АТФ зависит от концентрации Ca2+ в растворе. В присутствии высоких концентрациий Ca2+ , ATФ обусловливает суперпреципитацию миофибрил, которая ассоциирует с макс. активностью ATPase.Напротив, в отсуствии Ca2+, не происходит не только суперпреципитации, но и актомиозин диссоциирует под действием АТФ.
Группа Setsuro Ebashi's связала реляксацию миофибрил с Ca2+-связывающей активностью определенной фракции мышечного гомогената. С этой точки зрения, реляксирующая активность м.б. приравнена удалению Ca2+, который необходим для контракции мышечных волкон. Jens C. Skou и J. Järnefelt показали, что мембранные системы, включая мышечные микросомы, гидролизуют АТФ, предоставляя энергию для транспорта ионов металла через мембранный двуслой. Это верно и в случае накачивающих Ca2+ sarcoplasmic-reticulum пузырьков, как установили в свойей классической работе Ebashi and Fritz Lipmann.
The ultrastructural approach.
В 1945, Keith Porter, Albert Claude и Ernest Fullam опубликовали первую электронную микрофотографию всей клетки. Это открыло мир ультраструктуры клетки. Однако, в то время существовали еще серьезные технические проблемы и с разрешающей способностью. В великолепной серии биохимических и ЭМ исследований Claude, George Palade, Philip Siekevitz and Porter идентифицировали микросомы — везикулярную фракцию, выдленную с помощью седиментации биохимиками — как производное фрагментации эндоплазматического ретикулёма. Это привело к новому оригинальному мышелению. Никогда прежде микроскопист и биохимик не были способны получить информацию, непосредственно связанную с проблемами клеточной физиологии.
Следующей ступенью стал поиск выполняемой функции саркоплазматическим ретикулемом. Hans H. Weber был первым, кто отметил, что микросомы, выделенные из гомогената мышц, и используемые в экспериментах по реляксации "...bore some resemblance to the sarcoplasmic reticulum". Однако, Umberto Muscatello с сотр. первые — выделив саркоплазматические фракции из мышечного гомогената и опредив их биохимическую активность — аргументированно показали, что микросомы, используемые в эксприментах по реляксации, являются фрагментами саркоплазматического ретикулёма. Ca2+ накачка с помощью саркоплазматического ретикулёма, как было установлено, является ключевым событием в реляксации мышц.
The electrophysiological approach.
Среди многочисленных аспектов мышечного сокращения, которое было все еще темным в то время, выявлена последовательность событий, которая связана с распределением потенциала действия по сарколемме и контракцией миофибрил — которая была известна как 'Hill's problem'. Новый свет на эту проблему пролит с помощью экспериментов по лакальной активации Andrew F. Huxley и Robert E. Taylor. Они нашли, что локальное приложение subliminal стимулирующего тока вызывает локальные сокращения, если оно действует на определенные дискретные локусы сарколеммы. Положение этих локусов по отношению к саркомерам варьирует в мышечных волоканх у разных видов животных. Напр., у лягушек в semitendinous мышечных волокнах чувствительные локусы были локализованы на уровне Z дисков, а стимулы, индуцирующие сокращение двух соседних полусаркомеров, распространялись во внутрь волокон. Напротив, в мышцах крабов и ящериц чувствительные локусы было раположены на уровне границ между A и I дисков. Эти наблюдения показали существование внутриклеточной проводящей системы со специфической организацией относительно саркомера. Stanley Bennett был первым, кто отметил, что эта система м.б. идентифицирована с саркоплазматическим ретикулёмом. Фактиыески, Bennett подчеркнул, что структура саркоплазматического ретикулёма характеризуется проявлением постоянного и повторяющегося саркомерного паттерна для любой из мышц и что этот паттерн в точности соответствует локусам чувствительности, обнаруживаемым в экспериментах по локальной активации Huxley и Taylor (Рис. 5).
And the circle was complete
Закончить историю саркоплазматического ретикулёма не так просто, как м. показаться. После публикации оригинальных работ, стало ясно, что саркоплазматический ретикулем является реальной системой, которая состоит из везикулярных и тубулярных элементов организованных в повторяющиеся единицы, которые известны как триады. Эти триады состоят из двух оппозитных и расширенных пцзырьков, которые разделены тонкой трубочкой, идущей поперек всей клетки — T система Ebba Andersson Cedergren. На основании рисунков, выполненных Veratti, а также локализации триад по отношению к саркомерам, выявленных ЭМ, Bennett предположил, что триады являются местами соединения (coupling) между возбуждением и контракцией. Из-за технических ограничений, связанными с электронными микрофотографиями, трудно определить точную роль различных частей триад. Хотя мембранная структура T трубочек, по-видимому, прерывиста, серия наблюдений саркоплазматического ретикулема быстро-действующих мышц указывает на то, что она м.б. вовлечена во внутриклеточное проведение электрических событий. Эта проблему удалось урегулировать Franzini-Armstrong и Porterи затем окончательно Hugh E. Huxley, который показал, что T система является непрерывной с сарколемой. Прямым следствием этих результатов было то, что T система является структурой, ответственной за внутриклеточное проведение электрических сигналов. Круг замкнулся — Hill's problem и эксперименты по локальному потенциалу действия Huxley и Taylor объясняются стуруктурными и биохимическими свойствами саркоплазматического ретикулёма.
Сравнительный анализ организации саркоплазматического ретикулёма в разных типах мышц, также как и у различных видов животных, привлек интерес и внимание электронных микроскопистов. Механизм поступления и высвобождения Ca2+ саркоплазматическим ретикулёмом во время цикла сокращения и расслабления волокон стал центральным для биохимиков и проанализирован в деталях, но это тема для др. разговора.
Наконец, вместе см. сказать, "...it is astonishing that a structure, once described so accurately and as beautifully as the reticulum by Veratti, should have so quickly become almost lost to man's knowledge".
)