Посещений:
Hepatic Stem Cells
Стволовые Клетки: Гепатоциты и Холангиоциты

Role for growth factors and extracellular matrix in controlling differentiation of prospectively isolated hepatic stem cells
Atsushi Suzuki, Atsushi Iwama, Hitoshi Miyashita, Hiromitsu Nakauchi and Hideki Taniguchi
Development 130, 2513-2524 © 2003

In liver development, a number of growth factors (GFs) and components of the extracellular matrix (ECMs) lead to differentiation of liver parenchymal cells. As the liver contains many cell types, specifically investigating their functional effects on hepatic stem cell populations is difficult. Prospective isolation and clonal assays for hepatic stem cells enable the examination of direct effects of GFs and ECMs on this rare cell fraction. Using previously purified cells that fulfill the criteria for hepatic stem cells, we examined how GFs and ECMs regulate differentiation in the developing liver. We show here that hepatocyte growth factor (HGF) induced early transition of albumin (ALB)-negative stem cells to ALB-positive hepatic precursors resembling hepatoblasts and then oncostatin M (OSM) promoted their differentiation to tryptophan-2, 3- dioxygenase (TO)-positive mature hepatocytes. During this transition, ECMs were necessary for the differentiation of stem cells and precursors, but their effects were only supportive. In the first step of stem cell differentiation induced by HGF, the expression of CCαAT/enhancer binding protein (C/EBP), a basic leucine zipper transcription factor, changed dramatically. When C/EBP function was inhibited in stem cells, they stopped differentiating to hepatocyte-lineage cells and proliferated actively. These are the first findings to illustrate the mechanism of hepatic stem cell differentiation in liver development.


(Рис.7.)  | Summarized possible mechanism for hepatic stem cell differentiation. Because early- generated ALB+ cells can proliferate exclusively and differentiate into cholangiocyte-lineage cells, we speculate that transitory hepatic precursors expressing ALB exist in the developing liver and they are equivalent to bi-potent hepatoblasts.

В эмбриогенезе мыши, зачаток печени первоначально развивается из вентральной энтодермы передней кишки на embryonic day (E) 8 (Wilson et al., 1963; Zaret, 2000). Сигналы от соседней кардиальной мезодермы и поперечной перегородки (septum transversum), которые в основном обеспечиваются fibroblast growth factors (FGFs) и bone morphogenetic proteins (BMPs), индуцируют клетки к экспрессии альбумина и α-fetoprotein (AFP), и тем самым инициируют образование почки печени (Jung et al., 1999; Rossi et al., 2001). После спецификации печени гематопоэтические клетки движутся в этот орган и продуцируют oncostatin M (OSM), который индуцирует созревание гепатоцитов (Kamiya et al., 1999; Kinoshita et al., 1999). На постнатальных стадиях, hepatocyte growth factor (HGF), продуцируемый непаренхимными печеночными клетками (sinusoidal, stellate и эндотелиальными клетками), участвует в созреваниии печени (Hu et al., 1993; Kamiya et al., 2001). Эти находки демонстрируют, что некоторые сигналы обеспечиваются с помощью клеток, производных мезодермы, заставляющих сделать выбор клеточной судьбы в напаравлении гепатического клона и индуцировать дифференцировку в функциональные гепатоциты. Не известно, однако, м. ли эти сигналы действовать прямо или опосредованно, лияя на рост и диффренецировку печеночных стволовых клеток. Т.о., важно проверить эффекты таких growth factors (GFs) в исследованиях одиночных клеток, используя очищенные популяции стволовых клеток.
Раннее авт. успешно идентифицировали печеночные стволовые клетки по мультиклональному потенциалу дифференцировки и способности самообновляться (Suzuki et al., 2002). Эти клетки экспрессируют рецептор фактора роста гепатоцитов Met и слабо позитивны по CD49f (α6 субъединице интегрина), но не экспрессируют Kit (рецептор фактора стволовых клеток), CD45 (leukocyte common antigen) и TER119 (молекуле, напоминающей glycophorin, эксклюзивно экспрессируемой в незрелых эритроидных клетках). Отсортированные стволовые клетки были клонально размножены в культуре в течение 6 мес., при этом они постоянно продуцировали гепатоциты и cholangiocytes в качестве производных, и в то же время поддерживали примитивные стволовые клетки, которые не экспрессировали ни альбумин, ни cytokeratin 19 во время большей части своего размножения. Изучение популяций, высоко обогащенных активностью стволовых клеток, показало, что HGF является критическим для пролиферации (Suzuki et al., 2000; Suzuki et al., 2002). Оставалось неизвестным, однако, играет ли роль взаимодействие Met/HGF в дифференцировке стволовых клеток. Spagnoli et al., (1998) выявили линию бипотенциальных гепатических клеток-предшественников из трансгенных животных, которые постоянно экспрессировали активированную форму Met. Следовательно, взаимодействие Met/HGF является критическим и ответственым за созревание дифференцирующихся гепатоцитов в постнатальной печени (Hu et al., 1993; Kamiya et al., 2001) и деления зрелых гепатоцитов при регенерации печени (Michalopoulos et al., 1984; Ishiki et al., 1992), оно также участвует через отдельный механизм в росте и дифференцировке стволовых клеток. В данной работе изучали прямые эффекты GFs и компонентов extracellular matrix (ECMs) на пролиферацию и би-потенциальную дифференцировку выделенных и клонально культивируемых печеночных стволовых клеток. Чтобы анализировать примитивные стволовые клетки и производные стволовых клеток, дифференцирующиеся гепатоциты, соотв., тип клеток определяли по экспрессии ALB enhancer/promoter-EGFP. Было показано, что HGF, но не FGFs, индуцирует ранний переход от ALB-негативных (ALB– ) стволовых клеток к ALB-позитивным (ALB+ ) предшественникам гепатоцитов путем передачи сигналов посредством CCαAT/enhancer-binding protein (C/EBP), basic leucine zipper транскрипционного фактора. Затем HGF оказался эффективным митогеном для дифференцирующихся клеток, тогда как OSM ингибировал их пролиферацию и индуцировал их созревание, что сопровождалось экспрессией glucose-6-phosphatase (G6P) и tryptophan-2, 3-dioxygenase (TO). Напротив, эти факторы супрессировали дифференцировку в клетки cholangiocyte-клона. Инактивация C/EBPs, даже в присутствие и HGF, и OSM, строго ингибировала дифференцировку стволовых клеток в клетки hepatocyte-клона и позволяла клеткам эффективно самообновляться. Хотя некоторые ECMs также м. индуцировать дифференцировку стволовых клеток с помощью регуляции C/EBPs, их эффекты намного слабее и м. скорее работать как поддержка дифференцировки стволовых клеток. Полученные данные показали, что градированные эффекты от HGF и OSM, обеспечиваемые транскрипционным фактором C/EBP, ведут стволовые клетки к дифференцировке в гепатоциты скорее, чем в cholangiocytes, благодаря эффективной экспансии дифференцирующихся клеток и пермиссивных сигналов, индуцирующих созревание гепатоцитов.

DISCUSSION


Анализировали сатус дифференцировки популяции очищенных стволовых клеток после исключения рада дифференцированных клеток и клеток др. клонов печени. Авт. уже освоеили технику выделения первичных клеток с активностью стволовых клеток из печени плодов мыши, используя FACS, и культивируя их из одиночных клеток (Suzuki et al., 2002). Исходя из полученных данных авт. предлагают возможный путь дифференцировки стволовых клеток в разивающейся печени (Рис. 7). Анализ изолированных стволовых клеток показал, что инициация ранней дифференцировки клеток hepatocyte-клона из стволовых клеток непосредственно обеспечивается HGF. Это указывает на новую функцию HGF в развитии печени. В постнатальной печни HGF функционирует в качестве индуктора созревания гепатоцитов (Hu et al., 1993; Kamiya et al., 2001), a в регенерирующей печни он стимулирует пролиферацию взрослых гепатоцитов (Michalopoulos et al., 1984; Ishiki et al., 1992).
HGF ,по-видимому, выполняет роль физиологической активации орган-специфических стволовых клеток благодаря своей способности обеспечивать репарацию и регенерацию многих взрослых органов (Kawaida et al., 1994; Michalopoulos and DeFrances, 1997; Matsuda et al., 1997; Matsumoto et al., 1997; Stolz et al., 1999; Menke et al., 1999; Fausto, 2000; Xian et al., 2000; Sakamaki et al., 2002). В самом деле, он стимулирует дифференцировку и пролиферацию человеческих CD34-позитивных гематопоэтических предшественников и эмбриональных стволовых клеток человека (Galimi et al., 1994; Schuldiner et al., 2000). Т.о. , прямая регуляция с помощью HGF м.б. общим механизмом для стволовых клеток во многих органах и критической для их дифференциации и пролиферации. Авт. обнаружили, что во время перехода к ALB+ клеткам от ALB– стволовых клеток, HGF способствует продукции клеток ALB+ и позволяет им эффективно пролиферировать. Продуцируемые ALB+ клетки все еще обладают способностью дифференцироваться в cholangiocytes, экспрессирующие CK19 и GGT в клональных культурах. Следовательно, дифференцирующиеся и пролиферирующие ALB+ клетки, недавно возникшие из ALB– стволовых клеток, м.б. эквивалентны би-потентным гепатобластам, которые экспрессируют некоторые клональные маркеры и в основном обнаруживаются в развивающейся печени. Ранее было установлено, что изолированные гепатические стволовые клетки находятся в развивающейся печени, не экспрессируя клональных маркеров ни гепатоцитов, ни cholangiocyte (Suzuki et al., 2000; Suzuki etal., 2002). Более того, таких клеток значительно меньше в числе, чем это предполагалось ранее, и оно уменьшается по мере развития. Это подтверждает гипотезу, представленную выше.
После инициации дифференцировки гепатических стволовых клеток с помощью HGF, OSM, который продуцируется гематопоэтическим клоном клеток, дает пермиссивный сигнал на дифференцировку гепатических предшественников в зрелые гепатоциты, экспрессирующие G6P и TO. И HGF и OSM строго стимулируют дифференцировку ALB+ гепатических предшественников в клетки гепатоцитарного клона, а также предупреждают их от возврата к ALB– фенотипу и дифференцировке в клетки холангиоцитарного клона. Некоторые ECMs, такие как laminin, type IV collagen и type I collagen, также индуцируют дифференцировку стволовых клеток. Хотя ECMs необходимы для пролиферации и дифференцировки стволовых клеток, однако их эффекты, скорее всего, связаны лишь с поддержанием дифференцировки гепатоцитов и холангиоцитов, т.к. они обладают слабым потенциалом дифференцировки стволовыхв клеток. Факторы, регулирующие дифференцировку cholangiocyte из стволовых клеток или гепатических предшественников не были идентифицированы в данной работе, предполагается, что дифференцировка стволовых клеток в cholangiocyte м.б. предпочтительным путем дифференцировки стволовых клеток, который не нуждается в специфических сигналах.
В ALB– клетках, генерированных из ALB+ предшественников в клональных культурах, были идентифицированы как CK19+ клетки cholangiocyte-клона, так и ALB– CK19 SUP>– клетки, которые обладают фенотипом стволовых клеток. Это указывает на то, что ранняя экспрессия ALB во время дифференцировки стволовых клеток является изменчивой (flexible) и клетки м. перетекать туда-сюда между состоянием стволовых клеток и ALB+ гепатических предшествнников пока они не получат градированные (gradual) сигналы к дифференцировке сначала от HGF и затем от OSM. В гепатогенезе из энтодермального слоя, стартующего на ст. E8, FGFs, продуцируемые кардиальной мезодермой, играют ключевую роль в генерации ALB+ клеток (Jung et al., 1999). Полученные авт. данные, однако, показывают, что FGFs оказывают значительно меньшие эффекты на переход от ALB– стволовых клеток к ALB+ клеткам. Печень плодов мыши на ст. E13.5, которую авт. использовали для выделения стволовых клеток, находилась уже далеко от кардиальной мезодермы, указывая тем самым, что FGFs д.б. уэже закончить свою роль в раннем развитии печени на этой стадии. Немногие клетки, получающие сигналы от кардиальной мезодермы или др. клеток выстилающей мезенхимы во время раннего гепатогенеза, м. сохраняться в недифференцированном состоянии до средины плодного развития. ст. E13.5. FGFs м. непосредственно индуцировать дифференцировку гепатоцитов и/или ALB+ hepatic предшественников из энтодермы передней кишки, а HGF стимулирует дифференцировку дремлющих стволовых клеток, сохраняемых в развиваюдщейся печени. Ряд факторов скорее всего работает как индукторы или репрессоры печеночного органогенеза, базируясь на едва различимом хронометрировании.
C/EBP белки регулируют печень специфическую экспрессию генов и пролиферацию клеток (Costa et al., 1989; Maire et al., 1989; Rana et al., 1994; Trautwein et al., 1996; Soriano et al., 1998; Greenbaum et al., 1998). В частности, C/EBPα экспрессируется на высоком уровне в покоящихся гепатоцитах и позитивно регулирует гепатоцит-специфическую экспрессию генов, таких как ALB and αAT (Costa et al., 1989; Maire et al., 1989; Rana et al., 1994; Runge et al., 1997; Soriano et al., 1998). В развивающейся печени C/EBPα нокаутных мышей, обнаруживатеся ряд псевдогландулярных структур, которы ко-экспрессируют антигены, специфические гепатоцитам и холангиоцитам, в печеночной паренхиме, но при этом образование желчных протоков не нарушается (Tomizawa et al., 1998). Эти данные демонстрируют, что C/EBPα является важным регулятором дифференцировки гепатоцитов, но не холангиоцитов как во время развития, так и регенерации печени. Экспрессия C/EBPα индуцируется на высоком уровне во время хода дифференцировки гепатоцитов из ALB– стволовых клеток в ALB+ гепатические предшественники с помощью HGF. Предполагается, что HGF непосредственно регулирует экспрессию C/EBPa, которая играет критическую роль в переходе стволовых клеток в ALB+ hepatic предшественники. C/EBPβ является также печеночным транскрипционным фактором (Descombes et al., 1990), который, подобно C/EBPα, участвует в регуляции печень-специфических генов, таких как ALB (Trautwein et al., 1996). При переходе от пролиферации к дифференцированным гепатоцитам соотношение C/EBPα:C/EBPβ увеличивается (Runge et al., 1997). Во время индукции дифференцировки гепатоцитов с помощью HGF, соотношение C/EBPα:C/EBPβ также сильно увеличивается. Это указывает на то, что относительные пропорции C/EBPα и C/EBPβ м.б. важными для дифференцировки гепатоцитов из стволовых клеток в развивающейся печени. С помощью нокаутных мышей идентифицированы некоторые функции C/EBPs в развитии печени (Wang et al., 1995; Soriano et al., 1998; Tomizawa et al., 1998). Однако, из-за перекрывания действия членов семейства C/EBP их внутренне присущие роли в развитии печени остаются невыясненными. Напр., печеночные клетки у C/EBPα нокаутных мышей м. дифференцироваться в гепатоциты, если они культивируются на Matrigel (Soriano et al., 1998), указывая тем самым, что существует частичная избыточность (redundancy) с др. C/EBP белками.
Чтобы устранить эти противоречивые интерпретации, авт. использовали доминантно-негативный A-C/EBP для устранения эндогенного связывания ДНК со всеми членами семейства C/EBP. Экспрессия A-C/EBP в ALB– стволовых клетках давала в результате ингибирование наполовину генерации клеток hepatocyte-клона, даже в культурах, содержащих и HGF и OSM. Кроме того, экспрессия A-C/EBP в ALB+ клетких способствовала переходу в ALB– клетки. Все это показывает, что семейство C/EBP, особенно C/EBPα и b, которые непосредственно регулируются с помощью HGF, необходимы для ранних ступеней гепатической дифференци ровки стволовых клеток. Помимо ингибирования дифференцировки отсутствие всех C/EBP функций в стволовых клетках увеличивает их шансы к делениям само-обновления в культуре. В развивающейся печени, однако, количество стволовых клеток очень низкое и их пролиферация ограничена даже при низкой экспрессии C/EBP белков. Следовательно, м существовать др. механизмы для поддержания их покоящегося статуса во время развития печени. Ряд молекулярных событий в дифференировке стволовых клеток, таких как взаимодействие C/EBPs и др. элементов, необходим для детерминации клона гепатоцитов или холангиоцитов. C/EBPα-обусловленный арест роста, как известно, нуждается во взаимодействии с p21, cyclin-dependent kinase (CDK) ингибитором и CDK2 (Timchenko et al., 1997; Harris et al., 2001). Этот механизм м.б. вовлечен в OSM-обеспечиваемый арест роста печеночных предшественников с тем, чтобы затем индуцировать дифференцировку в зрелые гепатоциты. Из-за такого ингибирования роста, назависимого от транскрипционной активности C/EBPα (Harris et al., 2001), д. существовать др. механизм для контроля транскрипии генов, важных для печеночного развития. Действительно, с регионами, контролирующими транскрипцию в ALB и αAT, активно экспрессирующиеся в печени транскрипционные факторы, такие как HNF1 (Baumhueter et al., 1990), HNF3 и HNF4 (Costa et al., 1989), и широко распространненые белки, такие как activator protein 1 (AP1) (Hu et al., 1994), соединяются, чтобы регулировать эти гены вместе с C/EBP белками. Предполагаемый каскад последовательного транскрипционного контроля дифференцировки гепатических стволовых клеток, однако, все еще ненадежен.
Полученные результаты показывают, что HNF6 экспрессируется на более высоком уровне в ALB+ клетках, чем в ALB– клетках во время ранней дифференцировки стволовых клеток, и экспрессия HNF6 супрессируется также, когда дифференцировка стволовых клеток ингибируется с помощью dominant-negative C/EBP белков. HNF6-связывающие последовательности, фактически,присутствуют в промоторных регионах нескольких гепатоцит-enriched генов, таких как αAT, AFP, cytochrome P450, GLUT2 и TO (Samadani et al., 1996; Tan et al., 2002). Т.о., HNF6 м.б. одним из возможных кандидатов, участвующих в раннем переходе стволовых клеток к гепатическим предшественникам и его экспрессиия м. регулироваться с помощью C/EBPs. У Hnf6 –/– мышей, обнаруживаются аномалии внутрипеченочных и внепеченочных желчных протоков и желчного пузыря (Clotman et al., 2002). Эти данные указывают на то, что HNF6 существенен для дифференцировки и созревания клеток желчного (biliary) клона скорее, чем гепатоцитов. Однако, в E13.5 развивающейся печени этих мышей выявляется количество cytokeratin-позитивных клеток желчного клона, сравнимое с таковым в норме, это указывает на то, что HNF6 регулирует не только мофрогенез желчного тракта, но и является повротным пунктом дифференцировки примитивных гепатических стволовых клеток.
A precise description of stem cell differentiation would allow the control of hepatocyte differentiation and the induction of liver regeneration by manipulating the endogenous stem cell compartment. Our clonal culture assay with hepatic stem cells should reveal the mechanism that regulates their self-renewal potential and the signals that restrict their proliferation and differentiation in the developing liver. Exploring diverse gene programs activated in stem cells or differentiating cells should provide a molecular framework for future research into liver development. Key elements of stem cells, such as quiescent status and pluripotency, would be elucidated by comparing hepatic stem cells with other tissue-derived stem cells. The prospective isolation and characterization of stem cells is required for better understanding what exactly a stem cell is and what it does.
Сайт создан в системе uCoz