Посещений:
Синаптические Пузырьки: Экзоцитоз

Контроль

Controversies in synaptic vesicle exocytosis
Robby M. Weimer и Erik M. Jorgensen (jorgensen@biology.utah.edu)
Journal of Cell Science 116, 3661-3666 (2003)

Reinhard Jahn & Dirk Fasshauer
Molecular machines governing exocytosis of synaptic vesicles
Nature 490, 201–207 (11 October 2012) doi:10.1038/nature11320

Зависимый от кальция экзоцитоз синаптических пузырьков обеспечивает высвобождение нейротрансмиттеров. Важные белки этого процесса были идентифицированы, такие как SNAREs, synaptotagmins, complexins, Munc18 и Munc13. Структурные и функциональные исследования предоставили богатую информацияю о физиологической роли этих белков. Однако неожиданно оказалось затруднительным получить унифицированную картину молекулярной последовательности событий от стыковки пузырьков до запускаемого кальцем слияния мембран. Использовав в основном биохимические и биофизические перспективы, авт. вкратце рассмотрели молекулярные механизмы в попытке функционально интегрировать ключевые белки в возникающую картину механизма нейронального слияния.


Рисунки к статье

Синаптическая передача базируется на цикле синаптических пузырьков - пути мембранного переноса, в котором маленькие, связанные с мембранами, пузырьки обеспечивют доставку нейротрансмиттера из пресинаптических окончаний. Цикл напоминает общераспространённый мембранный перенос и имеет три фазы: заполнение, опорожнение и рециклинг пузырьков. Во время заполнения нейротрансмиттер загружается в пузырёк посредством везикулярных транспортёров нейротрансмиттеров. Высвобождаются они с помощью экзоцитоза: пузырьки стыкуются с плазматической мембраной и проходят ступень созревания, названную priming; затем в результате притока кальция через voltage-gated каналы сенсоры кальцая позволяют слиться пузырьку с плазматической мембраной. Слияние с мембраной ведет к поглощению мембраны пузырька и везикулярных белков; затем эти компоненты м.б. переработаны (recycled), чтобы снова использоваться для доставки нейротрансмиттера.
Цикл синаптических пузырьков управляется членами семейства белков, необходимыми для общего мембранного переноса, включая SNAREs, UNC-18, Rab3 и vacuolar H+ ATPases (V-ATPases), и уникальными белками, такими как synaptotagmin, который регулирует аспекты экзоцитоза, уникальные для синапсов. Будут рассмотрены модели, объясняющие их функции в цикле синаптических пузырьков.

SNAREs


SNARE (soluble NSF attachment protein receptor) белки являются ~18-32 kDa ассоциированными с мембранами белками, коорые взаимодействуют, чтобы сформировать SNARE комплексы (Chen и Scheller, 2001). Комплексы SNARE в синапсах содержат по 4 α-спирали, из которых одна спираль вносится vesicle SNARE (v-SNARE, aka R-SNARE) synaptobrevin, а три вносятся target SNAREs (t-SNAREs, aka Q-SNAREs) SNAP-25 и syntaxin (Bennett и Scheller, 1993; Sollner et al., 1993b; Hanson et al., 1997; Sutton et al., 1998; Lonart и Sudhof, 2000). Ингибирование формирования комплекса SNARE блокирует высвобождение нейротрансмиттеров (Littleton et al., 1998; Chen et al., 2001), поэтому белки SNARE, как полагают, способствуют экзоцитозу синаптиеских пузырьков посредством образования комплексов SNARE.

Docking
Образование комплекса SNARE, как изначально полагали, пристыковывает синаптический пузырёк к плазматической мембране (Sollner et al., 1993b). SNAREs локализуются в отдельных субклеточных компартментах, представленных уникальными молекулярными метками (tags). Т.о., формирование комплексов между путь-специфическими SNAREs м. гарантировать, что пузырьки будут доставлены в правильный компартмент.Однако последующие биоохимические и генетические исследовения оказались неспособны подтвердить такую роль. У Drosophila SNAREs м.б. неразборчивыми, так несинаптический t-SNARE SNAP-24 м. взаимодействовать с syntaxin и synaptobrevin, чтобы формировать комплексы SNARE in vitro (Niemeyer и Schwarz, 2000) и замещает SNAP-25 in vivo (Vilinsky et al., 2002); следовательно, SNARE взаимодействия сами по себе неспособны обеспечивать специфичности в мембранном таргетинге. Далее, пертурбации SNAREs у кальмаров и Drosophila не способны блокировать пристыковку синаптических пузырьков (Hunt et al., 1994; Broadie et al., 1995).

Priming
Структурные данные показывают, что образование комплексов SNARE in trans м. приводить мембраны синаптических пузыртьков в тесную близость с плазматической мембраной (Baumert et al., 1989; Bennett et al., 1992; Hanson et al., 1997; Lin и Scheller, 1997; Sutton et al., 1998), это м.б. важным для их слияния. Согласуется с этим и величина готового к реализации пула (преимущественно primed пузырьков), скоррелированная с уровнем сборки комплексов SNARE in vivo (Lonart и Sudhof, 2000).

Fusion
Сегодня общепринято, что образование комплексов SNARE достаточно для ступени слияния. the fusion step. Так, сведение вместе (zippering) комплексов SNARE in trans обеспечивает энергией, необходимой для обеспечения силияния мембран. В соответствии с этой моделью очищенные мембраны, содержащие только похожие белки SNARE, сливаются (Weber et al., 1998; McNew et al., 1999; McNew et al., 2000). Однако наблюдаемые скорости низки (Weber et al., 1998), это указывает на то, что др. компоненты м.б. необходимы для поддержания in vivo высокой скорости слияния, наблюдаемой в синапсах.

UNC-18


UNC-18 является членом семейства Sec1p: цитоплазматических белков, которые соединяются с pathway-specific SNAREs (Jahn, 2000). C. elegans UNC-18 и его гомологи у Drosophila и млекопитающих ROP и Munc18-1, соединяются с t-SNARE syntaxin с nanomolar сродством (Hata et al., 1993; Pevsner et al., 1994b; Ogawa et al., 1996; Matos et al., 2000). Считается, что его функция определяется этим взаимодействием.

Docking
В отсутствие Munc18-1 пузырьки с плотной сердцевиной в хромаффинных клетках неспособны пристыковываться к плазматической мембране (Voets et al., 2001). UNC-18 физически взаимодействует с белком синаптических пузырьков Doc2 (Verhage et al., 1997) и у дрожжей комплексы, содержащие его гомолог Vps33p, взаимодействуют с Rab3 гомологом Ypt7p (Haas et al., 1995; Rieder и Emr, 1997; Ungermann et al., 1998; Eitzen et al., 2000; Price et al., 2000; Seals et al., 2000). Т.о., UNC-18 м. закреплять синаптический пузырёк на плазматической мембране путём соединения с Doc2 или Rab3 пузырька с syntaxin на плазматической мембране. Однако исследования пертурбаций не выявили роли синтаксина в пристыковке пузырьков. Возможно UNC-18 м. облегчать стыковку посредством взаимодействий с др. ассоциированными с мембраной белками, такими как Mint-Cask-Neurexin комплекс (Okamoto и Sudhof, 1997; Biederer и Sudhof, 2000).

Priming
Хотя syntaxin д. взаимодействовать с synaptobrevin, чтобы подготовить пузырёк для опорожнения, в растворе syntaxin приобретает закрытую конформацию; его N-конец складывается поверх и закупоривает SNARE-связывающий домен (Calakos et al., 1994; Dulubova et al., 1999). Т.о., syntaxin необходимо `открыть', чтобы произошло созревание (priming). UNC-18 связыватся спеифически с закрытой конфигурацией синтксина (Dulubova et al., 1999; Misura et al., 2000; Yang et al., 2000). И вообще UNC-18 способствует экзоцитозу путём открытия синтаксина. В согласии с этой моделью и экспрессия укороченной формы гомолога синтаксина у дрожжей, Tlg2p, частичными супрессорными мутациями в UNC-18 гомологе Vps45p (Bryant и James, 2001).

Fusion
UNC-18 м. также участвовать в слиянии. Сначала UNC-18 соединяется с syntaxin, предполагаемым медиатором слияния. У Munc18-1-нулевых мышей события слияния не выявляются в центральных синапсах (Verhage et al., 2000). Избыточная же экспрессия изменённого Munc18-1 белка в хромаффинных клетках изменяет динамику пор слияния при экзоцитозе одиночных гранул (Fisher et al., 2001); однако избыточная экспрессия дикого типа Munc18-1 не оказывает влияния на слияние. Как UNC-18 м. регулировать слияние, остаётся неизвестным.

SNARE recycling
Избыточная экспресиия UNC-18 у Drosophila ингибирует высвобождение нейротрансмиттеров синтаксин-зависимым способом (Schulze et al., 1994; Wu et al., 1998; Wu et al., 2001), это указывает на то, что взаимодействия UNC-18-syntaxin ингибируют скорее, чем способствуют экзоцитозу. Хотя первоначально предполагалось, что для регуляции ступени priming, возможной ролью UNC-18 является ингибирующая активность, чтобы сохранить syntaxin в плазматической мембране во время рециклинга везикулярных компонентов. После слияния, trans-SNARE комплексы превращаются в cis-SNARE комплексы, которые разбираются с помощью ATPase NSF (N-ethylmaleimide-sensitive factor) (Wilson et al., 1992>; Sollner et al., 1993a; Littleton et al., 1998). После разборки UNC-18 связывание с `закрытым' syntaxin м. ингибировать образование странствующих cis-SNARE комплексов прежде чем synaptobrevin будет удален из плазматической мембраны. В согласии с этой гипотезой находится и то, что UNC-18 способен ингибировать образоавние комплексов SNARE in vitro (Pevsner et al., 1994a), а уровни синтаксина снижены у Munc18-1-нулевых мышей (Voets et al., 2001), это м.б. обусловлено деградацией аберрантных cis-SNARE комплексов.

Rab3


Rabs являются малыми GTPases, которые ассоциируют с переносимыми (trafficking) мембранами (Zerial и McBride, 2001), и существенны для всех мембран, переносимых у дрожжей ( Lazar et al., 1997). Пресинаптическая Rab, Rab3, ассоциирована с синаптическими пузырьками (Fischer von Mollard et al., 1990; Nonet et al., 1997), а мутации Rab3 изменяют высвобождение нейротрансмиттеров (Geppert et al., 1994a; Nonet et al., 1997; Leenders et al., 2001).

Docking
Синаптические пузырьки неспособны формировать кластеры вблизи мест высвобождения (release) у C. elegans, а мутации Rab3 у мышей (Nonet et al., 1997; Leenders et al., 2001) и избыточная экспрессия Rab3 в клетках PC12 увеличивают количества пристыковавшихся гранул (Martelli et al., 2000). Дрожжевой Rab3 гомолог Ypt7p взаимодействует с комплексом, содержащим UNC-18 гомолог Vps33p, и др. дрожжевой Rab3 гомолог, Ypt1p, взаимодействует генетически с UNC-18 гомологом Sly1p (некоторые Sly1 мутации обходят потерю Ypt1p) (Ossig et al., 1991). Т.о., Rab3 м. действовать посредством UNC-18, чтобы обеспечить стыковку.

Priming
Rab3 взаимодействует с несколими синаптическими белками, включая белок активной зоны Rim (Rab3-interacting molecule) (Wang et al., 1997), который в свою очередь взаимодействует с UNC-13 (Betz et al., 2001) - syntaxin-связывающим белком (Betz et al., 1997). И Rim и UNC-13 необходимы для созревания (priming ) синаптических пузырьков перед экзоцитозом у мышей (Brose et al., 2000; Schoch et al., 2002; Varoqueaux et al., 2002), Drosophila (Aravamudan et al., 1999) и C. elegans (Koushika et al., 2001; Richmond et al., 1999). Более того, UNC-13 и Rim, по-видимому. функционируют на ступени priming, чтобы обеспечить или стабилизировать открытое состояние syntaxin (Koushika et al., 2001; Richmond et al., 2001). Rab3 м. играть роль на этом пути priming с помощью передачи сигналов, поставляющих пристыкованные синаптические пузырьки к Rim-UNC-13 priming комплексу.

Fusion
Rab3A-нулевые мыши обнаруживают высокие уровни высвобождения трансмиттеров во время нервного воозбуждения, даже если размер готового к реализации пула и кальций зависимое высвобождение не изменены (Geppert et al., 1994a). Rab3A м. также действовать как ингибитор слияния, вообще-то кординируя высвобождение. В соответствии с такой ролью избыточная экспрессия Rab3A в клетках PC12 вызывает постоянное слияние секреторных пузырьков (Schluter et al., 2002). Однако молекулярный механизм, с помощью которого Rab3 м. регулировать слияние неясен. Генетические данные по дрожжам указывают на то, что Rab3 действует посредстом UNC-18. Такое взаимодействия м.б. связано с передачей сигнелов Rab3 к кухне (machinery) слияния, в частности к syntaxin.

Nothing at all
Неприятным фактом, противоречащим разрабатываемой модели фугкции Rab3, является то, что элиминация Rab3 обнаруживает чрезвычайно слабый фенотип кау у мышей, так и червей (Geppert et al., 1994a; Nonet et al., 1997). Необходимо иметь в виду возможность, что важные функции, поддерживаемые белками Rab в др. событиях слияний, м.б. присвоены др. белками в слинии синаптических пузырьков. Rab3 м.б. остаточным компонентом в цикле синаптических пузырьков.

V-ATPase


V-ATPase это большая макромолекула, которая использует гидролиз АТФ для накачки протонов в синаптические пузырьки, чтобы закислить (acidify) этот компартмент. V-ATPase состоит из цитоплазматического V1 комплекса, который прикреплен к трансмембранному V0 комплексу (Nishi и Forgac, 2002).

Loading
Нейротрансмиттеры концентрируются в синаптических пузырьках с помощью транспортёров, которые используют электрохимический градиент между просветом пузырька и цитоплазмой, чтобы управлять загрузкой нейротрансмиттеров (Schuldiner et al., 1995). Ингибирование активности V-ATPase in vitro блокирует транспорт нейротрансмиттеров в пузырьки (Anderson et al., 1982; Hell et al., 1990; Moriyama et al., 1990). Т.о., активность V-ATPase скорее всего необходима in vivo для генерации движущей силы по загрузке пузырьков.

Docking/priming
Высвобождение нейротрансмиттеров является квантировнаным: количество нейротрансмиттера, высвобождаемого при каждом слиянии является константным. Т.о., д. существовать механизм для предупреждения слияния частично заполненных пузырьков. У дрожжей активность V-ATPase необходима для образования trans-SNARE комплексов и тем самым для слияния мембран (Ungermann et al., 1999). Сходная потребность в синапсах м. обеспечиваться КПП (checkpoint) для гарантии, что только полностью загруженные нейротрансмиттером пузырьки будут стыковаться или созревать (primed). Однако блокирование V-ATPase с помощью bafilomycin не блокирует опорожнения синаптических пузырьков, это говорит о том, что такого КПП (checkpoint) м. и не существовать (Zhou et al., 2000).

Fusion
Недавние данные подтверждают, что acidification пузырьков м. б. важной для функции не только V-ATPase в экзоцитозе синаптических пузырьков. В частности, trans-V0 комплексы собираются SNARE-зависимым образом между дрожжевыми вакуолярными мембранами, предназначенными для слияния, это указывает на позднюю роль комплекса V0 в слиянии мембран (Peters et al., 2001). Такой комплекс д. катлизировать смешивание липидов во время слияния или действовать как водная пора для высвобождения нейротрансмиттера без полного смешивания везикулярной и плазматической мембран.

Synaptotagmin


Synaptotagmin является ассоциированым с пузырьками белком, который содержит два C2 кальций-связывающих домена (Chapman, 2002). Мутации synaptotagmin блокируют высвобождение нейротрансмиттера (Littleton et al., 1993; Geppert et al., 1994b). Однако synaptotagmins не обнаруживаются у всех эукариот, это указывает на то, что synaptotagmin не является компонентом основной кухни (machinery) переноса мембран, а является скорее акцессорным белком, который м. регулировать высвобождение нейротрансмиттеров.

Docking
Синапсы у Drosophila, лишенные synaptotagmin, содержат меньше морфологически пристыкованных синаптических пузырьков на сайт высвобождения (Reist et al., 1998), это указывает на то, что synaptotagmin способствует пристыковке пузырьков. Synaptotagmin связывается с syntaxin (Chapman et al., 1995), SNAP-25 (Schiavo et al., 1997), кальциевыми каналами (Kim и Catterall, 1997; Sheng et al., 1997) и липидами (Brose et al., 1992; Davletov и Sudhof, 1993; Zhang et al., 1998); и вообще эти взаимодействия связывают пузырьки с плазматической мембраной посредстом стыковки (docking). Альтернативно, уменьшенные количества пристыкованных пузырьков у Drosophila synaptotagmin мутантов м.б. вторичным фенотипом, обусловленным потребностью в synaptotagmin для рециклинга пузырьков.

Calcium sensing
Synaptotagmin соединяется с кальцем посредством своих C2 доменов со сродством, которое соответствует порогу кальция для экзоцитоза синаптических пузырьков (Brose et al., 1992; Heidelberger et al., 1994; Davis et al., 1999. Synaptotagmin м. , следовательно, функционировать как сенсор кальция. В соответствии с этой гипотезой synaptotagimin-I-нокаутные мыши лишены быстрой фазы высвобождения нейротрансмиттеров, даже если уровень пристыкованных к мембране пузырьков находится на нормальном уровне (Geppert et al., 1994b). Соедениение кальция с synaptotagmin м. влиять на комплекс SNARE или позитивно или негативно, т.к. synaptotagmin связывает комплексы SNARE вблизи трансмембранных доменов syntaxin и synaptobrevin (Brose et al., 1992; Ernst и Brunger, 2003; Kee и Scheller, 1996; Pevsner et al., 1994a; Schiavo et al., 1997; Wu et al., 1999). Напротив, недавние данные показывают, что synaptotagmin функционирует как сенсор кальция независимо от взаимодействий с комплексом SNARE (Shin et al., 2003). Т.к. synaptotagmin соединяется с липидами кальций-зависимым способом (Brose et al., 1992; Davletov и Sudhof, 1993; Zhang et al., 1998), то он м. непосредственно способстовать слияюнию пузырьков с мембраной.

Recycling
Synaptotagmin необходим, по-видимому, также и для рециклинга компонентов синаптических пузырьков. Ультраструктурный анализ synaptotagmin-нулевых мутантов Drosophila и C. elegans покзал, что их синаптическая varicosities устраняется синаптическими пузырьками (Jorgensen et al., 1995; Reist et al., 1998; Littleton et al., 2001) - фентипическая характеристика дефекта эндоцитоза. Кроме того, synaptotagmin, как известно, связывает белки, участвующие в клатрин-обусловленном эндоцитозе, особенно α и µ субъединиц клатринового адапторного комплекса AP-2 (Zhang et al., 1994; Haucke и De Camilli, 1999; Haucke et al., 2000). Т.о., synaptotagmin м. играть двойную роль, способствуя экзоцитозу и эндоцитозу синаптических пузырьков.

Future directions


Биохимические и генетические подходы выявили обширнцй каталог белков и белковых взаимодействий главных для membrane trafficking. Пока нет моделей того, как эти взаимодействия м. объяснить физиологию синапсов. In the future, convincing tests for these models must be designed и executed. The design of these experiments is likely to arise from the excellent data emerging from structural analyses of synaptic proteins. For example, NMR studies revealed that the t-SNARE syntaxin adopts two conformations - closed и open (Dulubova et al., 1999) - thus leading to the hypothesis that a presynaptic protein opens syntaxin to permit vesicle exocytosis. Such a factor would be expected to bind to syntaxin, и defects caused by the loss of this protein should be bypassed by the open form of syntaxin. These predictions were confirmed for the synaptic protein UNC-13. UNC-13 binds to syntaxin (Betz et al., 2001) и a constitutively open form of syntaxin bypasses the requirement for UNC-13 (Richmond et al., 2001). Elsewhere, researchers are taking advantage of structural data to engineer variants to test the relevance of the interactions between synaptotagmin и SNAREs, calcium и lipids during exocytosis (Fernandez-Chacon et al., 2001; Mackler et al., 2002; Robinson et al., 2002; Yoshihara и Littleton, 2002; Shin et al., 2003). Testing the importance of each of the proposed molecular interactions in this pathway will be critical if we are to develop a comprehensive model describing the molecular mechanism underlying synaptic vesicle exocytosis.
Сайт создан в системе uCoz