RNA polymerase II and forkhead transcription factors
Транскрипционная Элонгация
The promoter function of the yeast forkhead transcription factors and is well established. But now, in Science, Jane Mellor and colleagues report a new role for Fkh1 and Fkh2 — coordinating early transcription elongation and pre-messenger RNA processing.
Morillon, A. et al. Regulation of elongating RNA polymerase II by forkhead transcription factors in yeast. Science300, 492-495 (2003) | | |
WEB SITE
Авт. использовали chromatin immunoprecipitation (ChIP) для изучения связывания Fkh1 и Fkh2 с CLB2, который является частью кластера генов, которые экспрессируются в раннем митозе. Они нашли, что Fkh1 и Fkh2 не только соединяются с вышесточщими активирующими последовальностями, но также с кодирующей областью, это указывает на то, что они участвуют в транскрипционной элонгации. Затем, Mellor и коллеги обратили внимание на распределение RNA polymerase II (RNAPII) на CLB2. В линиях джрожжей дикого типа RNAPII накапливается в начале кодирующей области — это верно и для линий, лишенных Fkh2 (fkh2Δ), следовательно, нет ожидаемого заметного снижения количества количества связываемой RNAPII. Однако, в линиях, лишенныъх Fkh1 (fkh1Δ), RNAPII накапливается в направлении конца гена, указывая тем самым на существование блока элонгации, обусловленного Fkh1.
Затем авт. использовали 6-azauracil (6AU), чтобы посмотреть вызывают ли Fkh1 и Fkh2 оппозитные эффекты. 6AU истощает пул GTP и эффективно предупреждает RNAPII от элонгации, но линии дикого типа выживают благодаря др. белку, , пополняющего GTP пул. Чувствительность fkh2Δ's к 6AU, преодолевается гуанином, указывает на позитивную роль в элонгации Fkh2. Напротив, fkh1Δ резистентен к 6AU и м. супрессироывать чувствительность fkh2Δ. Это указывает на то, что факторы Fkh выполняют противоположные функции. Northern blot анализ показал, что IMD2 является мишенью Fkh регуляции, а ассоциация Fkh с кодирующей областью, которая параллельна той, что наблюдается в отношении CLB2, обнаруживается, когда IMD2 транскрипция индуцируется с помощью 6AU. Распределение RNAPII в этих локусах также Fkh-зависимо.
Во время элонгации, serine (Ser) 5 и Ser2 из heptad повтора (Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser)27 из C-terminal repeat domain (CTD) of RNAPII дифференциально фосфорилируются — фосфорилирование Ser5 усиливается, а Ser2 снижается между 5' и 3' концами генов — а RNAPII затем рекрутирует активности для процессинга транскриптов. В fkh2Δ фосфорилирование Ser5 и Ser2 более постоянно в гене, это указывает на то, что высвобождение RNAPII в фазу элонгации дефектно и что нормальный временной контроль фосфорилирования Ser м.б. нарушен. В fkh1Δ, Ser5 фосфорилирование снижено в промоторной области и низко по всей кодирующей области, а фосфорилирование Ser2 почти необнаружимо.
Mellor и др. затем решили посмотреть образование пре-мРНК 3'- конца у fkh1Δ линий, т.к. повышенное фосфорилирование Ser2 в линиях дикого типа ассоциирует с процессингом 3'-конца пре-мРНК. И в самом деле, они обнаружили, что образование 3'-конца дефектно у fkh1Δ. Затем, используя transcription run-on assay, они показали, что RNAPII в fkh1Δ дефектна при образовании пре-мРНК 3'-конца и предположили, что "...much of the RNAPII at the 3' end is not actively engaged in transcription, a likely consequence of the lack of Ser5 and Ser2 phosphorylation."
Итак, авт. предполагают, что оппозитное действие Fkh1 и Fkh2 в начале генов м.б. частью checkpoint механизма ранней элонгации, который как полагают координирует транскрипцию и процессирнг пре-мРНК благодаря фосфорилированию CTD of RNAPII. А эволюцитонная консервация Fkh факторов указывает на то, что это "...may reflect a general feature of gene regulation in eukaryotes."