ARE | CRE | dIgA | sIgA | SC | pIgR

MUCOSAE респираторного, желудочно-кишечного и урогентального тракта покрыта эпителиальными клетками. Эпителиальные клетки образуют слои, они имеют TIGHT JUNCTIONS, которые эффективно подразделяют клеточнуюд поверхность на два отдельных домена — апикальную и базолатеральную поверхность. Функционально эпителиальные клетки регулируют ток ионов и растворов, обнаруживают и реагируют на стимулы внешней среды и формируют защитный барьер, отделяющий апикальный аспект слизистой от подлежащей ткани. Эти функции витальны и для развития и для поддержания функции органов. Нормальная функция и архитектура поверхности слизистой постоянно испытывается присутствующими заглатываемыми и вдыхаемыми токсинами, паразитами, бактериями и вирусами, которые после инвазии или разрушения эпителия вызывают инфекцию и болезни. Для защиты существуют специфичпеские и неспецифические механизмы нейтрализации патогенов.

Неспецифические механизмы включают действие слизистого секрета, содержащего mucus, кислоту, lactoferrin и лизосомы, каждый из компоентов, как известно. ингибирует патогенную активность. Более того, богатый углеводами glycocalyx, который покрывает апикальную поверхность, вместе с плотными соединениями между соседними клетками действует как барьер против патогенной инвазии. Специфическая защитная реакция включает и клеточный T LYMPHOCYTES) и immunoglobulin (Ig)-опосредованные ответы. IgG, IgA и IgM (Box 1) секретируются и системной лимфоидной тканью и тканью лимфоидных тел, которые распределены непосредственно под эпителием (Box 2). Они затем транспортируются через эпителий с помощью TRANSCYTOSIS и секретируются в просвет, где они предупреждают патогенную инвазию. Кроме того, у людей IgG, который присутствует в материнской крови, транспортируется с помощью трансцитоза через плаценту в плод, а у крыс IgG молока транспортируется через кишечный эпителий новорожденных, где они поступают в систему кровообращения потомства.

Трансцитоз считается принципиальным механизмом высвобождения белков на апикальной поверхности и что с его помощью поддерживается полярность эпителиальных клеток. Все эпителиальные клетки обнаруживают трансцитоз, а в некоторых клетоках он является главным маршрутом к апикальной поверхности.

Transport of polymeric IgA and IgM

Dimeric IgA (dIgA) является принципиальным классом иммуноглобулинов, обнаруживаемым в слизистой и в секретах экзокринных желез. dIgA продуцируется локально активированными B LYMPHOCYTES (plasma cells), которые находятся в слизистой LAMINA PROPRIA. IgA-секретирующие B клетки м.б. активированы с помощью T-cell-зависимых и T-cell-независимых мехенизмов (Box 2). Последний важен для продукции антител, которые защищают против бактерий-симбионтов, которые заселяют кишечник, и возможно представляет примитивную форму специфической иммунной защиты. Независимая от Т клеток активация скорее всего участвует в презентации ANTIGEN с помощью дендритных клеток, которые, как было показано, непосредственно берут пробы кишечной микрофлоры. Из-за обширности поверностной области кишечного тракта и его постоянного контакта с эндогенной флорой и внушими микробами наивысшие уровни dIgA секретируются этим органом. dIgA обнаруживается также в слюне, COLOSTRUM, молоке желез и слезах. dIgA состоит из двух мономерных IgA субъединиц и полипептидной J цепи (Box 1), хотя тримеры и тетрамеры также обнаружены. IgM также присутствует в слизистом секрете, где он представлен в виде пентамеров из IgM мономеров, которые собираются в ансамбли, ассоциированные с J цепью (Box 1).

После секреции dIgA или пентамерный IgM соединяются с полимерным иммуноглобулиновым рецептором (polymeric immunoglobulin receptor (pIgR), которые локализуются на базолатеральной поверхности эпителиальных клеток, которые формируют слизистую. Для простоты основное внимание будет уделено транспорту dIgA, хотя сходные механизмы используются и для транспорта IgM. pIgR является трансмембранным белком с внеклеточной лиганд-связывающей областью — состоящей из пяти внеклеточных доменов в 100–110 аминокислот каждый, которые обнаруживают сходство в вариабельными областями иммуноглобулинов — мембранной области из 23 аминокислот и цитоплазматического хвоста в 103 аминокислоты (Рис. 1). После синтеза в endoplasmic reticulum и выхода в Golgi, pIgR высвобождаются непосредственно из trans-Golgi network в базолатеральную поверхность, где они соединяются с dIgA. Комплекс pIgR–dIgA подвергается эндоцитозу (Рис. 2a, step 1) и транспортируется через серию эндосомных компартментов (Рис. 2a, step 2) через клетку к апикальной поверхности. En route или на апикальной поверхности, pIgR протеолитически расщепляется и внеклеточный связывающий домен рецептора, который соединен с dIgA, высвобождается в виде секреций слизистой (Рис. 2a, step 3). Этот отщепленный внеклеточный домен рецептора известен как secretory component (SC). Секретируемый dIgA в ассоциации с SC известен как secretory IgA (sIgA; Box 2). Нокаутные мыши, у которых отсутствует pIgR, имеют существенный дефект в секреции dIgA, хотя небольшие, но достоверные количества dIgA все еще обнаруживаются в желчи, фекалиях и содержимом кишечника, это указывает на то, что существуют и др. пути секреции dIgA. Неожиданно, Streptococcus pneumoniae специфически связывается с pIgR на апикальной поверхности клеток, это делает возможным эффективную адгезию и инвазию бактерий (Box 3).

Sites of dIgA/sIgA action

dIgA/sIgA функционируют, по крайнекй мере, в трех разных местах: в просвете gastrointestinal/respiratory/urogenital тракта, в эпителии и в lamina propria.

Luminal prevention of pathogen attachment.

После transcytosis и секреции в просвет слизистой (Рис. 2a), sIgA м. связывать антигены, такие как бактерии, вирусы и токсины. sIgA предупреждает присоединение и инвазию этих внешних патогенов в поверхность слизистой, влияя на их подвижность — путем ингибирования функции жгутиков (flagella) или вызывания агрегации микробов — и путем конкуренции с патогенами за адгезивные сайты на апикальной поверхности эпителиальных клеток. Последнее является функцией углеводной половинки SC. Более того, при связываниии с поверхностью патогенов sIgA стерически препятствует их присоединению к клеточным рецепторам. Напр., связывание sIgA вирусного оболочечного гликопротеина human immunodeficiency virus (HIV), препятствует его прикреплению, интернализации и последующей репликации в клетке. Наконец, luminal sIgA м. нейтрализовать токсическую активность патогенных продуктов, таких как бактериальные токсины.

Intracellular neutralization of viruses.

Помимо предупреждения присоединения и инвазии патогенов в клетку подтверждена потенциальная роль dIgA во внутриклеточной нейтрализации вирусов (Рис. 2b). В культивируемых Madin–Darby canine kidney (MDCK) клетках, модельной линии эпителиальных клеток, базолатерально интернализованные dIgA, которые являются специфичными для покровных вирусных белков (ступень 1), встречаются с апикально интернализованными вирусами в endocytic-подобных структурах (ступень 2). За счет или ингибирования сборки/разборки вирусов или их высвобождения из клетки (напр., направляя связанные вирусы в лизосомы,ступень 3), это взаимодействие снижает уровни вирусов, определяемые в клеточных лизатах и апикальных жидкостях после вирусной инфекции. Следовательно, dIgA-обусловленная внутриэпителиальня нейтрализация вирусов м. служить дополнительным механизмом предупреждения инфекции.

Antigen secretion.

Третьей линией dIgA-обусловленной иммунной защиты является lamina propria. Патогенные антигены, как известно, проникают в эпителий, где они достигают lamina propria и даже проникают в сисему кровообращения. Следовательно, dIgA антитела, которые постоянно секретируются B лимфоцитами, м. встречать и связывать антигены в lamina propria (Рис. 2c). После соединения комплексы dIgA–антиген секретируются посредством pIgR-опосредованного трансцитотического пути в просвет слизистой, где они постепенно элиминируются.

Transport and function of IgG and FcRn

IgG, главный иммуноглобулин, который обнаруживается в сыворотке, он продуцируется B лимфоцитами в периферических лимфатических узлах и селезенке. Перенос IgG от матери потомству является механизмом, с помощью которого потомство приобретает иммунную защиту против врожденной инфекции и вредных антигенов во время первых недель независимой жизни. У людей (до рождения), большая часть IgG передается плоду из амниотической жидкости через сосудистую систему плаценты. Хотя и существует некоторый пренатальный перенос IgG через YOLK SAC, мыши и крысы в основном приобретают свой IgG из молозиво и молока через тонкий кишечник по время лактации. Во всяком случае, IgG м.б. интернализован из апикального полюса эпителиальных клеток и затем транспортироваться и высвобождаться из базолатеральной поврехности клеток.

Рецептор, который необходим для этого транспорта, это FcRn, белок, родственный белкам класса I большого комплекса гистосовместимостиa, который обеспечивает двунаправленный IgG трансцитоз в широкм круге тканей. Подобно pIgR, FcRn принадлежит Fc семейству рецепторов, который участвуют во многих клеточных функциях, включая регуляцию пролиферации и дифференцировки лимфоцитов, факгоцитоз IgG-покрытых частиц и высвобождение воспалительных агентов (Box 1). FcRn является гетеродимером, состоящим из 50-kDa трансмембранной α-цепочечной субъединицы, которая нековалентно соединена с 15-kDa β₂-microglobulin субъединицей (Рис.1). FcRn имеет 50-аминокислотный цитозольный домен, который содержит сортинг-сигнал, который направляет внутриклеточный перенос рецептора. Кристаллическая структура FcRn установлена при 2.2-Å разрешении. Субъединица β₂-microglobulin необходима для функции FcRn function, т.к. β2-microglobulin нокаутыные мыши имеют дефекты в тарнспорте IgG.

Физиологическая активность и метаболизм IgG, подобно dIgA и его рецепторц pIgR, зависимт от внутриклеточного переноса FcRn. IgG соединяется с FcRn с высоким сродством при слегка кислом pH (ниже 6.5), но с нижким сродством при нейтральном pH. В кишечнике, плаценте и желточном мешке FcRn транспортирует IgG из апикальной на базолатеральную поверхноть. В кислых условиях в тонком кишечнике крыс связывание IgG с FcRn происходит на апикальной плазматической мембране ENTEROCYTES (Рис. 3a, ступень 1). В желточном мешке и плаценте, где pH нейтральный, IgG подвергается эндоцитозу черз эндоцитоз в жидкой фазе и связывание IgG с FcRn происходит в кислых условиях апикальных эндосом (Рис. 3a, ступень 2). Независимо от механизма интернализации лиганда комплекс FcRn–IgG высвобождается с помощью трансцитоза в базолатеральную поверхность клетки, где нейтральный pH способствует диссоциации IgG от своего рецептора (<Рис. 3a, ступень 3).

Role of FcRn in regulating IgG catabolism.

Помимо обеспечения перенова материнского IgG, FcRn является также важным для регуляции количества IgG в сыворотке. Известно, что скорость IgG обмена увеличивается, как только количество IgG в сыворотке возрастает. Оборот осуществляется в эндотелиальных клетках и использует насыщаемый процесс, который, по-видимому, опопсредуется рецепторами. FcRn является наиболее вероятным кандидатом, т.к. локализуется в эндотелиальных клетках малых артериол и капиляров в мышцах и печени, а период полу-жизни IgG в сыворотке у β₂-microglobulin-дефицитных мышей аномально низок по сравнению с контролем. Предполагаемые механизмы FcRn-обеспечиваемого гомеостаза IgG показаны на Рис. 3b. В эндотелиальных клетках IgG захватывается с помощью fluid-phase эндоцитоза и высвобождается эндосомами (Рис. 3b, ступень 1). Судьба, подвергшихся эндоцитозу Ig, варьирует в засисимости от концентрации интернализованного IgG — которая прямо пропорциональна концентрации в сыворотке. При умеренных уровнях IgG большинство лигандов соединяется с FcRn и затем или возвращается (recycled) (ступень 2) или высвобождается с помощью трансцитоза на базолатеральную поверхность, где нейтральный pH способствует диссоциации и высвобождению в интерстициальное пространство (Рис. 3b, ступень 3). Когда уровни IgG высоки, то судьба интеранлизованных Ig иная. Как только FcRn связывание насыщается, то несвязанные с рецепторами IgG высвобождаются вместе с др. fluid-phase грузами в лизосомы, где они деградируют (Рис. 3b, ступень 4). Следовательно, уровни IgG в сыворотке управляются с помощью насыщаемого внутриклеточного FcRn–IgG взаимодействия.

FcRn in immune activation and tolerance.

FcRn экспрессируется как в эпителиальных клетках кишечника взрослых людей, так и в культивируемом монослое кишечных T84 клеток, причем они подвергается трансцитозу в обоих направлениях и это ведет к предположению о существовании новой функции у FcRn. Этот механизм показан на Рис. 3c. Он влечет за собой fluid-phase интернализацию и транспорт IgG из интерстициального пространства в просвет кишечника, где он высвобождается в виде секрета (Рис. 3c, ступени 1 и 2). После связывания со своим родственным антигеном в просвете комплексы IgG–антиген подвергаются трансцитозу в противоположном направлении, поставляя иммунные комплексы в lamina propria для последующей индукции иммунной активации или толерантности (Рис. 3c, ступени 3 и 4). Модель подтвержена на примере luminal-to-serosal транспорта химерного белка, содержащего гормон erythropoietin — который стимулирует образование эритроцитов — прикрепленных к Fc фрагменту IgG₁. Химера erythropoietin–Fc транспортируется через кишечный барьер новорожденных мышей или респираторный эпителий взрослых мышей в FcRn-зависимой реакции, которая стимулирует продукцию предшественников эритроцитов. FcRn-обусловленный иммунный надзор IgG–антигенов м.б. особенно важным в нижних респираторных и женском гентальном трактах людей, где концентрация IgG выше, чем IgA. Однако, относительный вклад sIgA или IgG в иммунорегуляцию в этих и др. тканях остается невыясненным.

Transcytotic pathways in polarized epithelial cells

Intracellular trafficking of pIgR–dIgA.

Внутриклеточный путь трансцитоза pIgR–dIgA комплексов изучен в поляризованных MDCK клетках (трансфицированных pIgR кДНК), печеночных гепатоцитах крыс и линиях клеток. производных от гепатоцитов. Инициальная ступень этого процесса - интернализация посредством одетых в клатин ямок из pIgR–dIgA на basolateral/sinusoidal поверхности клеток (Рис. 4, ступень 1). Для этого необходимы два цитоплазматических тирозиновых остатка в положении 668 и 734 у pIgR. Быстрый эндоцитоз нуждается также в серине 726, принципиальном сайте для фосфорилирования pIgR. Интернализованный pIgR–dIgA высвобождается в периферически расположенные базолатеральные ранние эндосомы (Рис. 4, ступень 1). Малая GTPase Rab5 и ее эффекторный белок, early endosome antigen 1 (EEA1) ассоциированы с этим компартментом. Комплексы pIgR–dIgA, будучи отделенными от fluid-phase маркеров (Рис. 4, ступень 2a), концентрируются в мембран-богатых тубулярных расширениях этого компартмента вместе с рецепторами, которые должны быть в конечном счете рециклированы и возвращены на базолатеральную/синусоидальную поверхность (Рис. 4, ступень 2b и 3a).

Большинство pIgR–dIgA комплексов и значительная фракция базолатеральных recycling белков, таких как TRANSFERRIN (Tf) и его рецептор постепенно высвобождаются с помощью actin- и microtubule-зависимого способа в околоядерный компартмент, который расширяется до апикальной цитоплазмы в клетках MDCK (Рис. 4, ступень 2c). Этот компартмент описывается по-разному как recycling эндосомы, общие эндосомы или common recycling endosome (CRE). CRE имеют трубчатую морфологию, получают мембран-ассоциированный груз, который интернализуется как на апикальном, так и базолатеральном полюсах клетки (Рис. 4, ступень 2c и 7a) и скорее всего является первичной станцией для апикально предназначенных и сегрегируемых pIgR–dIgA от рецепторов, подобно Tf рецепторам, которые должны возвращаться (recycle) назад в базолатеральный полюс клетки (Рис.4, ступень 3a). Эквивалентный paracentriolar компатртмент наблюдается в печеночных гепатоцитах крыс и в линии клеток WIF-B, произошедшей от гепатоцитов. Rab17, специфичная для эпителия Rab GTPase, локализуется в сходном компартменте в Eph4 эпителиальных клетках молочных желез и регулирует базолатеральный рециклинг Tf и его рецептора. В MDCK клетках Rab17 локализуется в субапикальном тубулярно-везикулярном компартменте, который содержит трансцитозируемые pIgR–dIgA, а избыточная экспрессия Rab17 ингибирует трансцитоз pIgR–dIgA. Ассоциирует ли Rab17 также и с CRE в MDCK клетках или с джр. компартментами неизвестно.

Финальные ступени трансцитоза pIgR–dIgA противоречивы и являются предметом интенсивных исследований (Box 4). Согласно одной гипотезе после выхода из CRE, pIgR–dIgA транспортируется в определенный компартмент, известный как apical recycling endosome (ARE) в MDCK клетках или как subapical compartment (SAC) в гепатоцитах (Рис. 4, ступень 3c). Предполагается, что ARE/SAC функционирует как финальный компартмент, который регулирует высвобождение внутриклеточных компонентов в апикальную плазматическую мембрану. В этой связи малая GTPases Rab11 и Rab25 ассоциированы с этим компартментом и регулируют трансцитоз и апикальный рециклинг. Посе выхода из ARE (Рис.4, ступень 4), pIgR высвобождается на апикальной поверхности клетки. Или по ходу (en route) в или в апикальной плазматической мембране pIgR протеолитически расщепляется с помощью thiol-зависимой протеиназы, высвобождая рецептор и связанные компоненты в secretions (Рис. 4, ступень 5). Однако, в MDCK клетках большая фракция pIgR–dIgA избегает расщепления и интернализуется из апикального полюса клетки, освобождаясь в апикальные ранние эндосомы (Рис. 4, ступень 6). Затем она постепенно высвобождается в CRE или Rab11-позитивные элементы ARE (Рис. 4, ступень 7a), из которых подвергается рециклингу. Высвобождение в ARE являетчся зависимым от микротрубочек процессом. Менее, чем 10% апикально интернализованных pIgR–dIgA подвергается трансцитозу и высвобождается базолатерально. Эффективный апикальный рециклинг гарантирует, что большинство pIgR–dIgA комплексов действительно будут расщепляться и высвобождаться в секрете.

Intracellular trafficking of FcRn–IgG.

В отличие от pIgR, FcRn, как известно, подвергаются трансцитозу в обоих направлениях. Кроме того, фракция комплексов рецептор-лиганд м. подвергаться рециклингу на клеточной поверхности или транспортироваться в лизосомы для деградации. Пути apical-to-basolateral трансцитоза FcRn–IgG используются культивируемыми эпителиальными клетками, плодным желточным мешком крыс, плацентой человека и фетальными энтероцитами. В последних FcRn концентрируется у основания апикальных микроворсинок в покрытых ямках и, как описано выше, соединение лиганда с рецептором происходит при кислом pH в просвете кишечника. Далее, комплекс рецептор-лиганд интернализуется с помощью процесса, который зависит от определенного di-leucine и уникального триптофанового internalization мотива и высвобождается в плейоморфный тубуло-везикулярный компартмент, который находится под апикальной плазматической мембраной (Рис. 5, стцпень 1). Локализация, морфология и присутствие как мембранных, так и fluid-phase маркеров указывают на то, что этот компартмент является апикальными ранними эндосомами. В absorptive энтодерме плодного желточного мешка FcRn не обнаруживается на поверхности, а, вместо этого, локализуется в subapical tubulovesicular apical early endosomes. В этой ткани IgG интернализуются с помощью fluid-phase эндоцитоза, затем они соединяются с FcRn в кислом просвете этого апикального endocytic компартмента (Рис. 5, стцпень 2). Сходным образом, в MDCK клетках. которые экспрессируют функциональный FcRn, апикально интернализованный IgG высвобождается в апикальные ранне эндосомы, где он соединяется с FcRn.

FcRn–IgG затем отделяется от не связанных с рецепторами fluid-phase маркеров, которые высвобождаются в поздние эндосомы и лизосомы (Рис. 5, ступень 3a) и или подвергаются рециклингу(ступень 3b) или высвобождается из AEE (Рис. 5, ступень 3c) в дальнейший набор тубуло-везикулярных эндосом. Это локализованные в околоядерной области, а также на соседней латеральной поверхности клетки (Рис. 5, ступень 3c) элементы, богатых Tf, CRE. В энтероцитах, покрытые пузырьки (100-nm диаметра) обнаруживаютя и, по-видимому, служат как экзоцитотические носители на базолатеральную клеточную поверхность (Рис. 5, ступень 4). Интересно, что 60-nm диаметра покрытые пузырьки также наблюдаются в MDCK клетках, которые в основании CRE и вовлекаются в рециклинг Tf–рецептор комплексов в базолатеральный полюс клетки. Эти пузырьки м. служить для сходных причин высвобождения FcRn–IgG на базолатеральную поверхность MDCK клеток. Возможно, что basolateral-to-apical трансцитоз FcRn–IgG будет следовать пути, сходному с тем, что описан для pIgR, но это необходимо доказать (Рис. 5, ступени 5–8). Т.к. функциональный FcRn экспрессируется в MDCK клетках, то необходимо более внимательное сравнение компартментов, участвующих в переносе FcRn по сравнению с переносом pIgR.

Regulation of transcytosis

Regulators of pIgR–dIgA transcytosis.

Трансцитоз pIgR–dIgA регулируется и модулируется с помощью цитоскелета, Rho family GTPases, Rab GTPases (включая Rab3b, Rab11, Rab17 и Rab25), гетеротримерного G-protein Gs_α, TAP/p115, calmodulin, phosphatidylinositol-3-kinasese, SNAREs (including syntaxin 3, SNAP-25 и cellubrevin), protein kinase C, p62^yes, phospholipase Cγ, cyclic AMP, внутриклеточного кальция, агентов, которые меняют pH органелл, ассоциации с липидными микродоменами, brefeldin A, фосфорилированиия рецептора по серину 664, димеризации рецептора и связывания лиганда.

Ligand-dependent stimulation of pIgR traffic.

Анализ трафика pIgR–dIgA пролил свет на сортировку рецептора и внутриклеточные компартменты, который вовлекаются в этот процесс. Кроме того pIgR предоставил важную информацию о том, как рецептор, перадавая сигналы м. модулировать степень и скорость эндоцитотического переноса. Хотя пустой pIgR — т.е. pIgR не связанный с лигандом — подвергается постоянному трансцитозу, связывание dIgA стимулирует трансцитоз рецептора in vitro и in vivo, хотя это м.б. и неверным для pIgR человека. Тем не менее, у некоторых видов, это является важным механизмом, который позволяет эпителию приспосабливать скорость образования sIgA к количеству доступного dIgA.

Лигандом стимулированный трансцитоз купируется с с нуждается в продукции вторичных мессенджеров, включая inositol 1,4,5-triphosphate (Ins(1,4,5)P₃) и свободный внутриклеточный кальций Ca²⁺. Установлено, что генерация этих сигналтных молекул зависит от Src семейства protein tyrosine kinase p62^yes (Рис. 6). p62^yes ко-иммунопреципитируется с pIgR в эндосомной фракции, которая обогащена transcytosing pIgR. Трансцитоз dIgA в желчь существенно нарушается у нокаутных животных, у которых отсутствует экспрессия p62^yes, это указывает на то. что эта киназа необходима для эффективного трансцитоза. Взаимодействие pIgR и p62^yes происходит посредством С-конца pIgR (аминокислотные остатки 727–736), хотя взаимодействие скорее всего непрямое. Вероятной миешенью для p62^yes является phospholipase Cγ, которая фосфорилируется после связывания dIgA и необходима для стимулированной лигандом продукиции Ins(1,4,5)P₃ и продукции diacylglycerol (DAG). Ins(1,4,5)P₃, в свою очередь, стимулирует высвобождение кальция из атипически локализованных внутриклеточных хранилищ, аи стимулированный лигандом трансцитоз м.б. блокирован с помощью антагониста Ins(1,4,5)P₃ рецептора, xestospongin C. Потребность в этом вышестоящем сигнальном событии м.б. обойдена при воздействии на клетки ionomycin, Ca²⁺ ionophore. Увеличение внутриклеточного Ca²⁺, сочетается с продукцией DAG, способствует активации и ассоциации протеин киназы C epsilon (PKCε) c pIgR–dIgA эндосомами. PKCε стимулирует трансцитоз pIgR–dIgA, хотя механизм этого неизвестен.

Две дальнейшие находки оказались ничего нестоящими. Во-первых, p62^yes сигнальный каскад — который м.б. инициирован в базолатеральной плазматической месбране или базолатеральных ранних эндосомах — быстро активируется вследствие связывания dIgA с рецептором и передается через клетку, где он стимулирует dIgA трансцитоз на поздней стадии трансцитотического пути (CRE или ARE). Во-вторых, воздействие ionomycin не оказывает влияния на pIgR трансцитоз, несмотря на то, что рецептор первым связывается с dIgA лигандом на базолатеральном полюсе клетки и димеризуется. Это д. указывать на то, что дальнейшая ступень 'sensitization' необходима для лигандом-стимулированного трансцитоза. Эта последняя ступень использует аргинин в положении 657 цитоплазматического домена рецептора, а сенсибилизация блокируется, когда этот остаток мутирует в нефосфорилируемый аланин (Ala) (R657A).

Эта ступень сенсибилизации охарактеризована и скорее всего использует Rab3b GTPase. Подсемейство Rab3 (Rab3a–d) регулирует Ca²⁺-стимулируемый экзоцитоз в разных типах клеток, включая нейроны и эндокринные клетки. Rab3b экспрессиируется также в эпителиальных клетках. Rab3b взаимодействует непосредственно с пустым pIgR,но слабо с лиганд-связанным рецептором. Rab3b соединяется с остатками 655–668 в цитоплазматическом домене pIgR, a лигандом-индуцированная диссоциация Rab3b блокируется у R657A мутантов. Более того, лигандом-индуцированная диссоциация не обнаруживается, если dIgA связан с pIgR на апикальном полюсе клетки и предупреждается также воздействием ингибиторов тирозин киназ или calcium chelators, или экспрессией доминантно-активного Rab3b мутанта (Rab3bQ81L), который закрыт в активном GTP-связанном состоянии. Как прдесказывалось, экспрессия Rab3bQ81L ингибирует лигандом-стимулированный трансцитоз pIgR, преимущественно из-за того, что GTPase неспособна подвергаться гидролизу и отделяться от рецептора. В нейронах Rab3негативно регулирует экзоцитотический трафик. Эти результаты указывают на то, что рецепторы. такие как pIgR, м. непосредственно взаимодействовать с Rab GTPases, причем действуя как эффекторы, чтобы регулировать свой собственный перенос. Эндоцитотические компартменты, в которых Rab3b ассоциирует и диссоциирут, и может ли лигандом связанный pIgR действовать как Rab3b фактор обмена или GTPase, активирующая белок в этой реакции, предстоит определить.

Role of the cytoskeleton in pIgR traffic.

Трансцитоз pIgR управляется также цитоскелетом. Микротрубочки необходимы для эффективного переноса pIgR–dIgA из базолатеральных ранних эндосом в более апикальные эндоцитотические компартменты (CRE и ARE). Молекулярный мотор, который управляет этим процессом неизвестен, но скорее всего м.б. динеин или неконвенциональный кинезин, которые м. перемещать пузырьки вдоль микротрубочек, которые выстилают латеральные поверхности клеток, ориентируясь своими минус концами в направлении апикального полюса клетки. Помимо микротрубочек, актин также важен для переноса pIgR. Трансцитоз pIgR–dIgA существенно ослабляется в cytochalasin-D обработанных MDCK клетках. Cytochalasin D ингибирует ранние события в трансцитозе pIgR–dIgA, которые предшествуют зависимой от микротрубочек ступени, и нарушает транзит между базолатеральными эндосомами и более апикальными эндосомными компартментами. Интересно, что cytochalasin D затрагивает только трансцитоз рецепторов, оккупированных лигандами, тогда как трансцитоз пустых рецепторов не затрагивается cytochalasin D. Фактически филаментозный актин ассоциирован с pIgR–dIgA-меченными эндосомами в основании поляризованных MDCK клеток. Связывание лиганда м. облегчать трансцитоз, способствуя продвижению эндоцитотических пузырьков и как результат образование ACTIN COMET или за счет стимулирования движения с помощью миозиновых моторов или за счет усиления оборота актина.

Regulation of pIgR–dIgA transcytosis by Rho family GTPases.

Помимо семейства Rab GTPases, семейство Rho GTPases RhoA, Rac1 и Cdc42 также управляет basolateral-to-apical трансцитозом pIgR–dIgA. Rho семейство GTPases связано с передачей внеклеточных сигналов для изсенения актинового цитоскелета. Кроме того, как теперьт известно, они регулируют некоторые клеточные функции, включая endocytic и biosynthetic traffic. Экспрессия доминантно-активного мутанта RhoA mutant (RhoAV14) стимулирует и базолатеральную и апикальную интернализацию pIgR–dIgA комплексов, тогода как экспрессия доминантно-негативного мутанта RhoAN19 оказывает противоположный эффект. Экспрессия RhoAV14 также заметно ослабляет трансцитоз pIgR–dIgA путем направления pIgR–dIgA в базолатеральные ранние эндосомы и уменьшает их выходи из этого компартмента. Экспрессия RhoAV14 оказывает слабый эффект на апикальный рециклинг комплекса лиганд-рецептор. Rac1 также регулирует базолатеральную и апикальную интернализацию pIgR–dIgA, но противоположным способом по сравнению с RhoA. Экспрессия доминантно-актинвного Rac1V12 снижает эндоцитоз pIgR–dIgA, тогда как экспрессия доминантно-негативного Rac1 стимулирует интернализацию. Экспрессия Rac1V12 блокирует трансцитоз за счет отлавливания pIgR–dIgA в центральных агрегатах, состоящих из элементов CRE и ARE. Апикальный рециклинг сходным образом участвует за счет экспрессии Rac1V12. Наконец, Cdc42 также регулирует pIgR–dIgA интернализацию и трансцитоз. Экспрессия или доминантно-активного Cdc42V12 или доминантно-негативного Cdc42N17 ослабляет pIgR–dIgA интернализацию и basolateral-to-apical трансцитоз. Эти результаты указывают на то, что Rho семейство GTPases м. регулировать некоторые ступени трансцитоза pIgR–dIgA . Нижестоящие эффекторы этих GTPases еще не установлены, хотя модуляция актинового цитоскелета д. регулировать трансцитоз и pIgR–dIgA и FcRn–IgG.

Regulation of FcRn–IgG transcytosis

В отличие от pIgR–dIgA очень мало известно о регуляции трансцитоза FcRn–IgG. Фосфорилирование FcRn регулирует трансцитоз этого рецептора. Serine (Ser) 313 и Ser319, в цитоплазматических доменах FcRn, являются главными местами рецептора для фосфорилирования. Если Ser313 мутирует в Ala (S313A), то apical-to-basolateral трансцитоз, но не basolateral-to-apical, существенно ослабляется и нарушается. Мутация S319A замедляет трансцитоз, но в меньшей степени, чем мутация S313A. Мутация Ser313 на остаток aspartic acid — которая воспроизводит негативный заряд фосфатной группы — оказывает предсказуемый эффект - стимулирует apical-to-basolateral трансцитоз. Наблюдается усиленный апикальный рециклинг S313A рецепторов, это указывает на то, что фосфорилирование м. регулировать вступление на путь трансцитоза. В противоположность pIgR, где фосфорилирование Ser664, как полагают, инактивирует базолатеральный сортинг-сигнал, способствуя тем самым апикальному высвобождению, фосфорилирование S313 в FcRn м. создавать базолатеральный сортинг-сигнал, саособствуя базолатеральному высвобождению этого рецептора.

Установлено, что FcRn–IgG трансцитоз модулируется также агентами, которые или нарушают цитоскелет, меняя pH внутриклеточных компартментов или нарушая внутриклеточные сигнальные каскады. Агент, разрушающий актинt, cytochalasin D, замедляет basolateral-to-apical трансцитоз FcRn–IgG в клетках BeWo choriocarcinoma, но не оказывает влияния на apical-to-basolateral трансцитоз рецептора. Эффект агента, деполимеризирующего микротрубочки, nocodazole зависит от типа клеток,или не оказывая эффекта, блокируя только basolateral-to-apical трансцитоз или блокируя трансцитоз в обоих направлениях. Monensin, который повышает pH внутрикелеточных органел, блокирует FcRn трансцитоз в обоих направлениях. Др. агенты, которыепt нарушают FcRn–IgG трансцитоз, это phosphatidylinositol-3-kinase антогонисты wortmannin и LY294002 и calmodulin антогонист W-7, который избирательно затрагивает basolateral-to-apical трансцитоз FcγRII–FcRn химер.

Summary and conclusions

Igs are important in preventing bacterial and viral infections by specifically interacting with and neutralizing pathogens. Igs such as IgA, IgG and IgM cannot simply diffuse across the epithelial barriers that are present in the mucosa and placenta, but instead are actively transported by the two receptors, pIgR and FcRn. The pIgR binds dIgA and pentameric IgM at the basolateral surface of the epithelial cell and transports these Igs in the basolateral-to-apical direction. This transport is highly regulated and involves the cytoskeleton, several Rab GTPases and some signalling cascades, including those that are dependent on ligand binding. The compartments that are involved in pIgR–dIgA transcytosis and the regulation of the transcytotic pathway remain active areas of research. At the apical plasma membrane, the pIgR is proteolytically cleaved, releasing bound dIgA/IgM into secretions. Although there can be some apical recycling, the pIgR effectively undergoes one round of traffic before it is used. Further areas of active research include the use of sIgA for immunotherapy, the use of pIgR as a means of targeted gene delivery to epithelial cells and the role of pIgR–dIgA in virus neutralization and antigen secretion.

Transportation of IgG is mediated by FcRn, and, like pIgR–dIgA transport, involves transcellular transport. However, there are some differences. First, IgG binding to the FcRn can either occur at the surface or in endosomes, and this reflects, in part, the low-pH-dependent binding of IgG to FcRn. Second, transport can occur in both the apical-to-basolateral and basolateral-to-apical direction. Third, release of IgG from FcRn is primarily dependent on pH-dependent changes in receptor–ligand affinity, and not proteolytic cleavage. Fourth, FcRn can probably undergo several cycles of transcytosis before it is turned over. Similar to pIgR–dIgA transport, FcRn–IgG transcytosis is also likely to be highly regulated. Because cell-culture models for FcRn transport were only developed in the past few years, our understanding of those compartments that are involved and of the mechanisms of regulation, considerably lags behind that of pIgR–dIgA transport. However, current data indicate the involvement of the cytoskeleton and signal transduction cascades. FcRn also has an important function in regulating IgG catabolism. Finally, FcRn–IgG, like pIgR–dIgA, has been proposed to be important in intracellular neutralization and recent data indicate that it could be important in immune activation and tolerance. These are areas of research that are sure to be further explored in the near future.

IMMUNOGLOBULIN TRANSPORT ACROSS POLARIZED EPITHELIAL CELLS
Raul Rojas, Gerard Apodaca (gla6@pitt.edu)
Nature Reviews Molecular Cell Biology 3, No 12, P. 944-956 (2002)

Boxes

Links

IMMUNOGLOBULIN TRANSPORT ACROSS POLARIZED EPITHELIAL CELLS Raul Rojas, Gerard Apodaca (gla6@pitt.edu) Nature Reviews Molecular Cell Biology 3, No 12, P. 944-956 (2002)

Boxes

Links

IMMUNOGLOBULIN TRANSPORT ACROSS POLARIZED EPITHELIAL CELLS
Raul Rojas, Gerard Apodaca (gla6@pitt.edu)
Nature Reviews Molecular Cell Biology 3, No 12, P. 944-956 (2002)