Посещений:
Z-ДНК: Функция

Z-ДНК: the long road to biological function
Alexander Rich и Shuguang Zhang
Nature Reviews Genetics 4, No 7, 566 -573 (2003); doi:10.1038/nrg1115


Рис.1.  | Discovery of Z-ДНК.


Рис.2.  | Negative supercoiling stabilizes Z-ДНК.


Рис.3. Transcription stabilizes Z-ДНК.


Рис.4.  | The lethality of mice following intracerebral inoculation of 100 viral plaque-forming units of vaccinia virus constructs.


Timeline  |  From Z-ДНК structure to function

ADAR1 The editing enzyme double-stranded RNA adenosine deaminase, which converts adenine to inosine in pre-mRNA. This enzyme has an N-terminal domain that binds tightly to Z-ДНК.
ANTI- AND SYN-CONFORMATIONS Nucleic-acid bases can rotate about the glycosyl bond. The Watson–Crick hydrogen-bonding atoms point away from the sugar in the anti-conformation (as in B-ДНК), и have the opposite orientation in the syn-conformation. Purines can form the syn-conformation more easily than pyrimidines.
BROWNIAN MOTION The random kinetic thermal motion of molecules.
ДНК FIBRE X-RAY DIFFRACTION ANALYSIS X-rays are scattered by electrons и if a molecule has regular periodicities, they will be detected by the diffraction pattern. In this technique, ДНК molecules are orientated so that their long axes are parallel. Although the diffraction pattern can provide some information about the molecule, the conclusions are often tentative because the number of reflections is relatively small.
CIRCULAR DICHROISM This method measures the difference in absorption of right и left circularly polarized light as it passes through a solution containing molecules that absorb at that wavelength. The circular-dichroism spectrum is plotted as a function of wavelength.
POLYTENE CHROMOSOME A chromosome that has duplicated many times и has remained laterally associated so that it is visible, as seen in Drosophila salivary glands.
of the molecule because large amounts of redundant data are collected.



Box 1 | Discovery of self-assembling peptides from the study of zuotin



Box 2 | Z-RNA The discovery of the structure of left-handed Z-ДНК naturally led to the question of whether RNA could also form this conformation. In 1982, chemically modified oligoribonucleotides indicated that this was a possibility 56 , и further nuclear magnetic resonance, circular dichroism и absorption spectroscopy studies strongly indicated that Z-RNA could be formed in high-ionic- strength solutions 57,58 .More detailed structural information was obtained from X-ray crystallographic studies with chimeric hexamers that were made of alternating CG residues in which the two central CG residues were ribonucleotides, whereas the flanking pair of nucleotides were deoxyribonucleotides. These и other structural studies showed that the conformation of Z-RNA was similar to that of Z-ДНК 59,60 .Z-RNA was also found to be immunogenic and, although Z-RNA specific antibodies could be isolated 61 ,some antibodies recognized both Z-RNA и Z-ДНК. Staining experiments with Z-RNA-specific antibodies showed that the antibody bound to fixed protozoan cells that were visualized by immunofluorescence microscopy. The antibodies were mostly found in the cytoplasm, which indicated that some cytoplasmic sequences in fixed cells existed as Z-RNA 62 .Cytoplasmic microinjection of anti-Z-RNA antibodies was found to inhibit cell multiplication 63 . The experiments on Z-RNA were mostly carried out in the late 1980s, и since 1990 there have been no further publications. However, a possible physiological role for Z-RNA was suggested recently by Brown, и Lowenhaupt et al., who found that the Z-ДНК-binding domain of the editing enzyme double-stranded RNA adenosine deaminase (ADAR1) could bind to Z-RNA и Z-ДНК 64 with similar affinity. It had been known for some time that certain RNA viruses that replicate in the cytoplasm undergo considerable changes in sequence, which were probably the consequence of hyper-editing by ADAR1. Sequence analysis of the virus found in measles encephalitis showed that the RNA undergoes many edits: adenines are replaced by guanines, и uracils by cytosines. So, this virus has been extensively hyper-edited by the editing enzyme 64 .Full length ADAR1 that contains the Z-ДНК-binding domain is upregulated by the interferon response of the cell, which is triggered by the measles virus. Furthermore, ADAR1 accumulates in the cytoplasm in which the measles virus replicates. So, it is possible that the ZαADAR1 binds to negatively torsionally strained double-stranded RNA, which might form during viral replication, targeting the editing enzyme to this site. The Z-ДНК/Z-RNA-binding domain might have a role in the attempts of cells to inactivate the invading virus. More experimental data are needed to test this hypothesis.
1. Wang, A. H. J. et al. Molecular structure of a left-handed double helical DNA fragment at atomic resolution. Nature 282, 680–686 (1979).
2. Pohl, F. M. & Jovin, T. M. Salt-induced co-operative conformational change of a synthetic DNA: equilibrium and kinetic studies with poly(dG-dC). J. Mol. Biol. 67, 375–396 (1972).
3. Thamann, T. J., Lord, R. C., Wang, A. H. J. & Rich, A. High salt form of poly(dG-dC)•poly(dG-dC) is left handed Z-DNA: raman spectra of crystals and solutions. Nucl. Acids Res. 9, 5443–5457 (1981).
4. Behe, M. & Felsenfeld, G. Effects of methylation on a synthetic polynucleotide: the B–Z transition in poly(dG–m5dC)•poly(dG–m5dC). Proc. Natl Acad. Sci. USA 78, 1619–1623 (1981).
5. Rich, A., Nordheim, A. & Wang, A. H.-J. The chemistry and biology of left-handed Z-DNA. Ann. Rev. Biochem. 53, 791–846 (1984).
6. Nordheim, A. & Rich, A. The sequence (dC–dA)n •(dG–dT)n forms left-handed Z-DNA in negatively supercoiled plasmids. Proc. Natl Acad. Sci. USA 80, 1821–1825 (1983).
7. Haniford, D. B. & Pulleyblank, D. E. Facile transition of poly[d(TG) x d(CA)] into a left-handed helix in physiological conditions. Nature 302, 632–634 (1983).
8. Feigon, J., Wang, A. H.-J., van der Marel, G. A., van Boom, J. H. & Rich, A. Z-DNA forms without an alternating purine–pyrimidine sequence in solution. Science 230, 82–84 (1985).
9. Peck, L. J., Nordheim, A., Rich, A. & Wang, J. C. Flipping of cloned d(pGpG)n•d(pCpG)n DNA sequences from right to left-handed helical structure by salt, Co(III), or negative supercoiling. Proc. Natl Acad. Sci. USA 79, 4560–4564 (1982).
10. Haniford, D. B. & Pulleyblank, D. E. The in vivo occurrence of Z-DNA. J. Biomol. Struct. Dyn. 1, 593–609 (1983).
11. Ellison, M. J., Kelleher, R. J., Wang, A. H.-J., Habener, J. F. & Rich, A. Sequence-dependent energetics of the B–Z transition in supercoiled DNA containing nonalternating purine–pyrimidine sequences. Proc. Natl Acad. Sci. USA 82, 8320–8324 (1985).
12. Ho, P. S., Ellison, M. J., Quigley, G. J. & Rich, A. A computer aided thermodynamic approach for predicting the formation of Z-DNA in naturally occurring sequences. EMBO J. 5, 2737–2744 (1986).
13. Marx, J. Z-DNA: still searching for a function. Science 230, 794–796 (1985).
14. Lafer, E. M., Moller, A., Nordheim, A., Stollar, B. D. & Rich, A. Antibodies specific for left-handed DNA. Proc. Natl Acad. Sci. USA 78, 3546–3550 (1981).
15. Moller, A. et al. Monoclonal antibodies recognize different parts of Z-DNA. J. Biol. Chem. 257, 12081–12085 (1982).
16. Lafer, E. M. et al. Z-DNA specific antibodies in human systemic lupus erythematosus. J. Clin. Invest. 71, 314–321 (1983).
17. Nordheim, A. et al. Antibodies to left-handed Z-DNA bind to interband regions of Drosophila polytene chromosomes. Nature 294, 417–422 (1981).
18. Lancillotti, F., Lopez, M. C., Arias, P. & Alonso, C. Z-DNA in transcriptionally active chromosomes. Proc. Natl Acad. Sci. USA 84, 1560–1564 (1987).
19. Arndt-Jovin, D. J. et al. Left-handed Z-DNA in bands of acid-fixed polytene chromosomes. Proc. Natl Acad. Sci. USA 80, 4344–4348 (1983).
20. Lipps, H. J. et al. Antibodies against Z-DNA react with the macronucleus but not the micronucleus of the hypotrichous ciliate Stylonychia mytilus. Cell 32, 435–441 (1983).
21. Liu, L. F. & Wang, J. C. Supercoiling of the DNA template during transcription. Proc. Natl Acad. Sci. USA 84, 7024–7027 (1987).
22. Schroth, G. P., Chou, P.-J. & Ho, P. S. Mapping Z-DNA in the human genome: computer aided mapping reveals a non-random distribution of potential Z-DNA forming sequences in human genes. J. Biol. Chem. 267, 11846–11855 (1992).
23. Jackson, D. A., Yuan, J. & Cook, P. R. A gentle method for preparing cyto- and nucleo-skeletons and associated chromatin. J. Cell Sci. 90, 365–378 (1988).
24. Wittig, B., Dorbic, T. & Rich, A. The level of Z-DNA in metabolically active, permeabilized mammalian cell nuclei is regulated by torsional strain. J. Cell. Biol. 108, 755–764 (1989).
25. Wittig, B., Dorbic, T. & Rich, A. Transcription is associated with Z-DNA formation in metabolically active permeabilized mammalian cell nuclei. Proc. Natl Acad. Sci. USA 88, 2259–2263 (1991).
26. Wittig, B., Wolfl, S., Dorbic, T., Vahrson, W. & Rich, A. Transcription of human C-MYC in permeabilized nuclei is associated with formation of Z-DNA in three discrete regions of the gene. EMBO J. 11, 4653–4663 (1992).
27. Wolfl, S., Wittig, B. & Rich, A. Identification of transcriptionally induced Z-DNA segments in the human C-MYC gene. Biochim. Biophys. Acta 1264, 294–302 (1995).
28. Wolfl, S., Martinez, C., Rich, A. & Majzoub, J. A. Transcription of the human corticotropin-releasing hormone gene in NPLC cells is correlated with Z-DNA formation. Proc. Natl Acad. Sci. USA 93, 3664–3668 (1996).
29. Liu, R. et al. Regulation of CSF1 promoter by the SWI/SNF-like BAF complex. Cell 106, 309–318 (2001). 30. Garner, M. M. & Felsenfeld, G. Effect of Z-DNA on nucleosome placement. J. Mol. Biol. 196, 581–590 (1987).
31. Herbert, A. G. & Rich, A. A method to identify and characterize Z-DNA binding proteins using a linear oligodeoxynucleotide. Nucl. Acids Res. 21, 2669–2672 (1993).
32. Herbert, A., Lowenhaupt, K., Spitzner, J. & Rich, A. Chicken double-stranded RNA adenosine deaminase has apparent specificity for Z-DNA. Proc. Natl Acad. Sci. USA 92, 7550–7554 (1995).
33. Bass, B. L. RNA editing by adenosine deaminases that act on RNA. Annu. Rev. Biochem. 71, 817–846 (2002).
34. Herbert, A. et al. A Z-DNA binding domain present in the human editing enzyme, double-stranded RNA adenosine deaminase. Proc. Natl Acad. Sci. USA 94, 8421–8426 (1997).
35. Kim, Y.-G., Kim, P. S., Herbert, A. & Rich, A. Construction of a Z-DNA-specific restriction endonuclease. Proc. Natl Acad. Sci. USA 94, 12875–12879 (1997).
36. Kim, Y. G., Lowenhaupt, K., Schwartz, T. & Rich, A. The interaction between Z-DNA and the Zab domain of dsRNA adenosine deaminase characterized using fusion nucleases. J. Biol. Chem. 274, 19081–19086 (1999).
37. Berger, I. et al. Spectroscopic characterization of a DNA-binding domain, Z , from the editing enzyme dsRNA adenosine deaminase: evidence for left-handed Z-DNA in the Z -DNA complex. Biochemistry 37, 13313–13321 (1998).
38. Kim, Y.-G. et al. The Zab domain of the human RNA editing enzyme ADAR1 recognizes Z-DNA when surrounded by B-DNA. J. Biol. Chem. 275, 26828–26833 (2000).
39. Oh, D.-B., Kim, Y.-G. & Rich, A. Z-DNA-binding proteins can act as potent effectors of gene expression in vivo. Proc. Natl Acad. Sci. USA 99, 16666–16671 (2002).
40. Schwartz, T., Rould, M. A., Lowenhaupt, K., Herbert, A. & Rich, A. Crystal structure of the Z domain of the human editing enzyme ADAR1 bound to left-handed Z-DNA. Science 284, 1841–1845 (1999).
41. Herbert, A. & Rich, A. Role of binding domains for dsRNA and Z-DNA in the in vivo editing of minimal substrates by ADAR1. Proc. Natl Acad. Sci. USA 98, 12132–12137 (2001).
42. Fu, Y. et al. Cloning of DLM-1, a novel gene that is up-regulated in activated macrophages, using RNA differential display. Gene 240, 157–163 (1999).
43. Schwartz, T., Behlke, J., Lowenhaupt, K., Heinemann, U. & Rich, A. Structure of the DLM-1–Z-DNA complex reveals a conserved family of Z-DNA-binding proteins. Nature Struct. Biol. 8, 761–765 (2001).
44. Brandt, T. A. & Jacobs, B. L. Both carboxy- and amino-terminal domains of the vaccinia virus interferon resistance gene, E3L are required for pathogenesis in a mouse model. J. Virol. 75, 850–856 (2001).
45. Kim, Y.-G. et al. A role for Z-DNA binding in vaccinia virus pathogenesis. Proc. Natl Acad. Sci. USA 100, 6974–6979 (2003).
46. Zhang, S., Lockshin, C., Herbert, A., Winter, E. & Rich, A. Zuotin, a putative Z-DNA binding protein in Saccharomyces cerevisiae. EMBO J. 11, 3787–3796 (1992).
47. Zhang, S., Holmes, T., Lockshin, C. & Rich, A. Spontaneous assembly of a self-complementary oligopeptide to form a stable macroscopic membrane. Proc. Natl Acad. Sci. USA 90, 3334–3338 (1993).
48. Zhang, S. et al. Self-complementary oligopeptide matrices support mammalian cell attachment. Biomaterials 16, 1385–1393 (1995).
49. Holmes, T., Delacalle, S., Su, X., Rich, A. & Zhang, S. Extensive neurite outgrowth and active neuronal synapses on peptide scaffolds. Proc. Natl Acad. Sci. USA 97, 6728–6733 (2000).
50. Kisiday, J. et al. Self-assembling peptide hydrogel fosters chondrocyte extracellular matrix production and cell division: implications for cartilage tissue repair. Proc. Natl Acad. Sci. USA 99, 9996–10001 (2002).
51. Zhang, S. & Rich, A. Direct conversion of an oligopeptide from a в -sheet to an б -helix: a model for amyloid formation. Proc. Natl Acad. Sci. USA 94, 23–28 (1997). 52. Zhang, S. et al. Biological surface engineering: a simple system for cell pattern formation. Biomaterials 20, 1213–1220 (1999).
53. Vauthey, S., Santoso, S., Gong, H., Watson, N. & Zhang, S. Molecular self-assembly of surfactant-like peptides to form nanotubes and nanovesicles. Proc. Natl Acad. Sci. USA 99, 5355–5360 (2002).
54. von Maltzahn, G., Vauthey, S., Santoso, S. & Zhang, S. Positively charged surfactant-like peptides self-assemble into nanostructures. Langmuir 19, 4332–4337 (2003).
55. Zhang, S. Building from bottom-up. Materials Today 6, 20–27 (2003).
56. Uesugi, W., Shida, T. & Ikehara, M. Synthesis and properties of CpG analogues containing an 8-bromoguanosine residue. Evidence for Z-RNA duplex formation. Biochemistry 21, 3400–3408 (1982).
57. Hall, K., Cruz, P., Tinoko, I., Jovin, T. M. & van de Sande, J. H. ‘Z-RNA’ — a left-handed RNA double helix. Nature 311, 584–586 (1984).
58. Davis, P. W., Hall, K., Cruz, P., Tinoco, I. & Neilson, T. The tetraribonucleotide rCpGpCpG forms a left-handed Z-RNA double helix. Nucleic Acids Res. 14, 1279–1291 (1986).
59. Teng, M. K., Liaw, Y. C., van der Marel, G. A., van Boom, J. H. & Wang, A.-H. Effects of the O2’ hydroxyl group on Z-DNA conformation: structure of Z-RNA and (araC)-[ Z-DNA]. Biochemistry 28, 4923–4928 (1989).
60. Davis, P. W., Adamiak, R. W. & Tinoco, I. Z-RNA: the solution NMR structure of r(CGCGCG). Biopolymers 29, 109–122 (1990).
61. Hardin, C. C., Zarling, D. A., Wolk, S. K., Ross, W. S. & Tincoc, I. Characterization of anti-Z-RNA polyclonal antibodies: epitope properties and recognition of Z-DNA. Biochemistry 27, 4169–4177 (1988).
62. Zarling, D. A., Calhoun, C. J., Hardin, C. C. & Zarling, A. H. Cytoplasmic Z-RNA. Proc. Natl Acad. Sci. USA 84, 6117–6121 (1987).
63. Zarling, D. A., Calhoun, C. J., Feuerstein, B. G. & Sena, E. P. Cytoplasmic microinjection of immunoglobulin Gs recognizing RNA helices inhibits human cell growth. J. Mol. Biol. 211, 147–160 (1990).
64. Brown, B. A., Lowenhaupt, K., Wilbert, C. M., Hanlon, C. B. & Rich, A. The Za domain of the editing enzyme dsRNA adenosine deaminase binds left-handed Z-RNA as well as Z-DNA. Proc. Natl Acad. Sci. USA 97, 13532–13586 (2000).
Biologists were puzzled by the discovery of left-handed Z-ДНК because it seemed unnecessary. Z-ДНК was stabilized by the negative supercoiling generated by transcription, which indicated a transient localized conformational change. Few laboratories worked on the biology of Z-ДНК. However, the discovery that certain classes of proteins bound to Z-ДНК with high affinity и great specificity indicated a biological role. The most recent data show that some of these proteins participate in the pathology of poxviruses.

Когда Watson и Crick предложили свою модель правосторонней двойной спиральной структуры ДНК (B-ДНК) в 1953, она м.б. сравнена только с экспериментальными данными по структуре того времени: ДНК FIBRE X-RAY DIFFRACTION анализу. Однако, дифракция волокон также давала слишком мало данных для ‘подтверждения’ структуры. И это продолжалось вплоть до конца 1970s, когда был разработан синтез ДНК, который сделал возможным перенос SINGLE-CRYSTAL X-RAY DIFFRACTION на специфические молекулы, чтобы определить структуру. Удивительно, но общеизвестная правозакрученная B-ДНК двойная спираль, которая находилась в фокусе молекулярной биологии предшествующие 25 лет, не появилась в первых атом-разрешающих картинах двойной спирали. Вместо этого, первая одно-кристаллическая рентгеновская структура фрагмента ДНК — само-комплементарного ДНК гексамера d(CG)3 — оказалась лево-закрученной двойной спиралью с двумя антипараллельными цепочками, которые удерживались вместе с помощью Watson–Crick пар оснований1 (see TIMELINE). Альтернативная структура подчеркивала необычную функцию этой формы ДНК. Организация молекулы оказалась полностью отличной от той, которая прогнозировалась. В самом деле из всех остатков, имеющих основания, организованные в ANTI-CONFORMATION, в этой молекуле каждое второе основание ротировало вокруг glycosyl связей так, что основания чередовались по anti- и SYN-CONFORMATIONS вдоль цепи. Кроме того обнаруживалось зигзагообразное расположение остова молекулы (отсюда, название Z-ДНК), это выгляделао по другому по сравнению с гладким непрерывным закручиванием, видимым в модели B-ДНК (Рис. 1). Вместо спирали, имеющей большую и малую борозды, пары оснований были противопоставлены (set off) по бокам от оси и обнаруживалась только одна борозда, которая аналогична минорной борозде B-ДНК. О отношения между Z-ДНК и более известной B-ДНК продемонстрированы в более ранней работе Pohl и Jovin2, которые показали, что ультрафиолетовый CIRCULAR DICHROISM poly(dG-dC) почти инвертирован в 4 M растворе хлористого натрия. Подозрение, что это является результатом конверсии B-ДНК в Z-ДНК были подтверждены с помощью исследований RAMAN SPECTRA этих расстворов и кристаллов Z-ДНК3. Превращение B-ДНК в Z-ДНК сопровождается ‘flip-ping over’ пар оснований так, что они приобретают upside down (вверх дном) ориентацию относительно той, что в B-ДНК. Подобное кувыркание (flipping over) проявляется как в продукции syn-conformation в каждом втором основании, так и в изменении складки (pucker) деоксирибозного кольца в альтернативных основаниях. Суммарный результат этой реорганизации в том, что фосфатные группы становятся ближе др. к др. в Z-ДНК, чем в B-ДНК. Следовательно, в стандартных клеточных условиях электростатическое отталкивание этих заряженных фосфатных групп должно превращать молекулу в конформацию B-ДНК. В присутствии высоко-соляных расстворов, электростатическое отталкивание фосфатных остатков существенно снижается и Z-ДНК приобретает стабильную конформацию. Некоторые исследования показали, что химические модификации, включая метилирование цитозина и многих др. катионов, таких как spermine и spermidine, д. стабилизировать Z конформацию4. Выяснилось, что самый нижайший энергетический уровень
ground state Сompare with excited state. The lowest energy state for an atom or molecule. When an atom is in its round state, its electrons fill the lowest energy orbitals completely efore they begin to occupy higher nergy orbitals, and they fill ubshells in accordance with Hund's rule (usually!)


ground state ДНК в физиологическом расстворе был у B-ДНК и что Z конформацмя обладает самым высоким энергетическим ground state. Т.к. пурины м.формировать син-конформации без энергетических затрат, то становится очевидным, что специфические последовательности пар оснований будут важны в предпоределении энергии, которая необходима для изменения B-ДНК в Z-ДНК5. Последовательности, которые легче всего конвертируются, имеют альтерации пуринов и пиримидинов, особенно изменения Ц и Г. Эти изменения также возникают легко при изменениях ЦА на одной нити и TГ на другой6,7. однако, многие др. последовательности, как было показано, способны к формированию Z-ДНК8.
Это открытие простимулировало вспышку исследований химиков. которые заинтересовались коныормационными изменениями ДНК. Хотя ионные условия, которые подходящи для стабилизации Z-ДНК во многих экспериментах были отличны от тех, что имеются в клетках, однако, метилирование spermine, spermidine и cytosine, которое также стабилизирует Z-ДНК4, обнаружено in vivo. Более того, открытие, что негативное суперскручивание (supercoiling) должрно стабилизировать Z-ДНК, указывает на биологическое участие9. Негативное суперскручивание нуждается в энергии и стремится к раскручиванию B-ДНК. Напр., в плазмиде с тремя негативными supercoils, если один поворот спирали ДНК изменяется с правозакрученного в левозакрученый, то две негативные суперспирали (supercoils) будут исчезать, а энергия негативного суперскпручивания будет затем стабилизировать малый сегмент Z-ДНК (Рис. 2). Суперскручивание, как известно, является частью биологических систем, это укзывает на связь между этой альтернативной конформацией и биологическими феноменами. Ранние эксперименты показали, что негативное суперскручивание плазмид у прокариот д. стабилизировать Z-ДНК10.
Проведено много экспериментов in vitro, чтобы определить энергию, которая необходима для суперскручивания плазмид с определнными последовательностями, чтобы кувыркнуться из B формы в Z форму. Энергетика этих конформаций была изучена для нескольких отличающихся последовательностей11. Это привело Ho et al. к изобретению компьютерной программы, которая позволяет подсчитывать относительную энергию, необходимую для кувырка любой последовательности из B формы в Z форму12. Исследователи разных лаб. определили кристаллическую и растворенную структуру последовательностей ДНК в Z конформации. Это предоставило большое количество детальной информации о Z конформации и в то же самое время многие химики открыли пути, с помощью которых Z конформация м.б. стабилизирована по сравнению с B конформацией. Тем не менее работы по биологии Z-ДНК прогрессировали медленно. В середине 1980s, после нескольких лет исследований ничего определенного не выявлено относительно функции Z-ДНК. В течение этого периода хотя и была подтверждена функциональная роль Z-ДНК в транскрипции, было также показано, что влияние Z-ДНК на транскрипцию зависит от изучаемого гена, это увеличило скептицизм и снизило энтузиазм исследователей биологической роли Z-ДНК. Многие уверились, что Z-ДНК нефункциональная конформация13. Итак, хотя химики продлжали находить Z-ДНК интересной, но в конце 1980s биология Z-ДНК не привлекала к себе внимания исследователей за исключением лаб. Rich.

Transcription и Z-ДНК


Факически основные достижения в деле выясненеия биологической роли Z-ДНК получены в иммунологических исследованиях. В отличие от B-ДНК, Z-ДНК обладает высокой антигенностью;и поликлональные14 и моноклональные15 антитела были получены к молекулам Z-ДНК. Характеристика этих антител привела к открытию, чтоZ-ДНК-специфические антитела обнаруживаются при аутоиммунных заболеваниях у людей, особенно при системной lupus erythematosus16. Антитела к Z-ДНК также оказались удобным инструментом для характеристики организации хромосом. Они соединяются специфически в областями внутри дисков политенных хромосом Drosophila и это связывание особенно строгое в областях пуффов, которыя являются местами повышенной транскрипционной активности17. Др. нашли тот же самый паттерн окрашивания в нефиксированных POLYTENE CHROMOSOMES18. Однако, некоторые исследования выявили связывание антител и вне этих областей19.
Дальнейшие исследования у protozoa также показали связь с транскрипцией. Ресничатые простейшие импют два ядра: макронуклеус, который является местом транскрипции, и микронуклеус, который содержит ДНК, участвующую в половой репродукции. Анти-Z-ДНК антитела окрашивают макронуклеус у ресничатых простейших Stylonychia, но не микроядро20.
Действительный прорыв произошёл в работе Liu и Wang21 в 1987 по взаимодействию РНК полимеразного комплекса с дуплексной ДНК во время транскрипции. Они предположили, что комплекс не ротирует вокруг спиральной ДНК, а вместо этого пашет прямо вдоль неё. Т.к. концы молекулы ДНК фиксированы, то ДНК благодаря перемещению полимеразы раскручивается и становится предметом негативного торсионного напряжения, которое как известно стабилизирует Z-ДНК. Во фронте перемещающейся полимеразы формируется позитивное торсионное напряжение. Дальнейшие доказательства были получены в работе Ho и др., которые впервые исследовали распределение последовательностей, которые способствуют образованию Z-ДНК в 137 генах человека. Они выявили высокую концентрацию этих последовательностей вблизи сайта старта транскрипции22. В недавших же экспериментах Ho сканировал хромосому 22 человека и подсчитал, что ~80% её генов имеют последовательности, способствуюдщие образованию Z-ДНК вблизи места старта транскрипции (Ho,personal communication). Т.к. эти последовательности отсутствуют в большинстве псевдогенов, то Z-ДНК-формирующие последовательности вблизи места старта транскрипции д. иметь функциональную роль.
Для изучения ассоциации между Z-ДНК и транскрипцией, Rich в сотрудничестве с Wittig и коллегами использовали технику, разработанную Cook в Oxford University. Клетки млекопитающих энкапсулируются в агарозные микро-шарики (microbeads) и с помощью легкой обработки детергентом лизируют цитоплазматическую мембрану и делают проницаемой ядерную мембрану, но во всем остальном оставляют ядро интактным. Образующиеся в результате ‘entrapped’ ядра реплицируют ДНК почти со скоростью in vivo и способны осуществлять транскрипцию23. Используя biotinylated моноклональные антитела против Z-ДНК, определяли уровни Z-ДНК в этих ядрах, и было показано, что они регулируются торсионными напряжениями24. Более т т Z-ДНК, когда C-MYC экспрессируется (Рис. 3), и были идентифицированы Z-ДНК-формирующие нуклеотиды. Однако, эти области быстро ревертировали в B-ДНК, когда транскрипция C-MYC прекращалась26,27. Тем не менее контроль конституитивно экспрессирующегося актина сохраняет его Z-ДНК всё время. Это указывает на корреляцию между транскрипцией и Z-ДНК конформацией, которая обнаружена также и в др. генах28.
Итак, негативное торсионное напряжение, вызываемое перемещением РНК полимеразы21 сталилизирует образование Z-ДНК вблизи стартовой точки транскрипции. Хотя topoisomerases стремится расслабить ДНК, продолжающееся перемещение РНК полимеразы генерирует большее негативное напряжение, чем м. расслабить topoisomerases. Однако, после прекращения транскрипции действие topoisomerase быстро конвертирует ДНК обратно в B конформацию. Итак, Z-ДНК выглядит как метастабильная конформация, которая образуется и исчезает в зависимости от физиологической активности. Как же инициируется образование Z-ДНК при транскрипции? Один из ответов получен в работе Liu et al. , которые изучали систему ремоделирования хроматина SWI/SNF29. Этот комплекс белков помогает разворачиваться (turn on) генам за счёт разворачивания ДНК из нуклеосом. Liu et al. изучали человеческий colony stimulating factor 1 gene (CSF1), который разворачивается с помощью этой системы. Разворачивание нуклеосомы делает ДНК негативно суперскрученной как результат того способа, за счет которого происходило её оборачивание вокруг нуклеосомы. Liu et al. установили, что высвобожденная ДНК находится в Z конформации. А уже давно известно, что Z-ДНК не м. формировать нуклеосомы30. Итак, нуклеосомы не м.б. реформированы и сайт сохраняется открытым, это позволяет накапливать др. транскрипционные факторы и инициировать транскрипцию с помощью РНК полимеразы. Они показали, что транскрипция запускается за счет образования Z-ДНК. Принимая во внимание превалирование последовательностей, которые способствуют образованию Z-ДНК вблизи сайта транскрипции, кажется очевидным, что этот механизм широко распространён22.

Proteins that bind Z-ДНК


Identifying binding proteins. Если Z-ДНК выполняет биологические функции, то кажется очень вероятным, что д.б. класс белков, которые д. соединяться специфически в ней. Первые попытки их выявления имели ограниченный успех, но привели к важному открытию, описанному в BOX 1. Проблемы с Z-ДНК-связывающими белками заставили разработать метод, который позволил выделять белки, селективно связывающиеся с Z-ДНК с высоким сродством. Herbert разработал мощную технику для идентификации Z-ДНК-связывающих белков, исключающий белки, которые м. связваться с B-ДНК31. В методе используется gel-shift assay с радиоактивно меченной химически стабилизированной Z-ДНК в присутствии ~20,000-кратного избытка B-ДНК и однонитчатой ДНК. Эта техника выявляет блеки, которые связываются специфически и тесно с Z-ДНК и привела к выделению в 1995 Z-ДНК-связывающего nuclear-RNA-редактирующего энзима32, названного double-stranded RNA adenosine deaminase (ADAR1 ). ADAR1 действует на двунитчатые сегменты, которые образуются в пре-мРНК, связываясь с двплексом и селектино деаминируя аденозин, чтобы дать inosine. Рибосомы интерпретируют инозин как гуанин, так что он м. менять аминокислотные последовательности ДНК-кодируемого белка. Типичным субстратом для этого энзима является дуплексная РНК, в которой экзон спарен с областью интрона. Деаминаза редактирует некоторые пре-мРНК, включая для glutamate рецептора, которая эксперссируется в ЦНС33. Этот рецептор является ионным каналом, а глютаминовый остаток вблизи центра канала меняется благодаря редактированию в аргинин; его позитивный заряд ограничивает поступление ионов кальция, изменение, которое существенно для функционирования ЦНС. Др. субстратом является серотониновый рецептор33. Во всех этих случаях функциональные свойства редактируемых белков (с аминокислотными альтерациями) отличаются от тех, которые присущи нередактированным белкам. Редактриование эзимов выявлено у всех metazoa и е его действие направлено на увелдичение функционального разнообразия белков, которые транскрипбируются с данного локуса.

A Z-ДНК-binding domain


Протеолитическое вычленение редактирующего ADAR1 сделало возможным выделение домена на N-конце, названного ZαADAR1, который содержит все Z-ДНК-связывающие свойства, которые ассоциированы с редактирующим энзимом34. Этот домен был использован Kim et al. для создания конформационно специфического ограничения эндонуклеазы, которая д.б. разрезать только Z-ДНК35,36. Проведены некоторые эксперименты, иллюстрирующие взаимодействие ZαADAR1 домена с ДНК в растворе. Если dodecamer d(CG)6 оставался в растворе, то он давал типичный спектр circular-dichroism B-ДНК. Когда ZαADAR1 добавлялся в физиологический раствор, то спектр постепенно менялся, это отражало превращение в Z форму37. Это показало, что Z домен в ADAR1 способен стабилизировать dodecamer в Z конформацию, которая, по-видимому, генерируется за счёт BROWNIAN MOTION, которое перекручивает dodecamer фрагмент. После кувырка в Z-ДНК coконформацию, домен ZαADAR1 соединяется с ДНК и препятсвует её возвращению в B конформацию. В последних экспериментах сходный феномен был продемонстрирован в длинной ДНК молекуле, в которой d(CG)6 сегмент был вставлен между двумя длинными сегментами с помледовательностями, которым трудно сформировать Z-ДНК38. В этом случае ZαADAR1 д. соединиться с центральной областью, поддерживая её в Z конформации, в то время как фланкирующие области остаются в B конформации. Следовательно, связывающая энергия должна быть достаточно большой, чтобы удерживать малый сегмент ДНК в Z конформации, а также обеспечивать достаточной энегрией, чтобы стабилизировать два B–Z соединения.
Oh и Kim разработали дрожжевую одно-гибридную систему для изучения Z-ДНК-связывающих белков in vivo39. Они открыли, что когда ZαADAR1, который был слит с активационным доменом, соединяется с Z-ДНК вблизи промотора, то он усиливает транскрипцию репортерного гена. Однако, даже без активационного домена уровень транскрипционной активации сохраняется. Эти находки согласуютсяс предположением Liu et al.29, что формированием Z-ДНК вблизи промотора д. стимулировать траскрипцию. Schwartz et al. открыли, что очищенный ZαADAR1 dдомен из ADAR1 м.б. кристаллизован с d(CG)3. Кристаллическая структура, растворенная при разрешении 2.1 Е (REF. 40), показывает, что ДНК идентична по форме той, что была обнаружена в первой кристаллической Z-ДНК1. Было обнаружено, что в 70 аминокислот связывающий домен принимает форму helix-turn-helix β-sheet мотива (winged helix), в котором распознающая спираль и β-sheet связаны с пятью последовательными фосфатными группами в загзагообразном остове (backbone) Z-ДНК. Кроме того, он распознает syn-conformation гуанина. Итак, the ZαADAR1 домен прденазначен для специфического распознавания структурных признаков Z-ДНК . Он специфичен к конформации, а не к последовательностям. Белковый winged-helix мотив также широко представлен в сиквенс-специфических ДНК-распознающих белках, которые соединяются с основаниями в большой борозде B-ДНК. Использование этого демена для связывания с Z-ДНК конформацией обнаруживает интересную адаптацию широко используемой ДНК-связывающей складки четвертичного белка. Очевидно, что Z-ДНК-связывающий домен ADAR1 находит Z-ДНК-формирующие области в определенных транскрипционно активных генах, как только они приобретают Z-ДНК. Использование exon-intron дуплекса в процессах редактирования обеспечивает, что редактирование происходит быстро, т.к. интроны быстро удаляются с помощью аппарата сплайсинга. ZαADAR1, по-видимому, активен in vivo при редактировании определенных транскриптов, в которых он м. находить ген41; однако, его роль в редактировании double-stranded RNA (dsRNA) не ясна. Интересно, что dsRNA м. принимать конформацию Z-RNA, которая м.б. субстратом для ADAR1 (BOX 2).

Other Z-ДНК-binding proteins


Rj-кристаллическая структура ZαADAR1 и Z-ДНК позволяет идентифицировать те аминокислоты, которые важны для распознавания Z-ДНК. Компьютерны поиск быстро выявил др. белки со сходными сиквенс-мотивами, такие как DLM1, который активируется в тканях, которые находятся в контакте с опухолями, а также во время реакции на interferon42. Ко-кристаллическая структура Z-ДНК-связывающего домена DLM1 (Z DLM1 ) и d(CG)3 получена при разрешении 1.85 A, и показано, что этот второй белковый домен распознаёт Z-ДНК сходным образом, что и ZαADAR1 (REF. 43).
Др. Z-ДНК-binding белком является E3L, который обнаружен у poxviruses, включая vaccinia virus. Это большие ДНК вирусы располагаются в цитоплазме клеток и продуцирут некоторые белки, которые помогают абортировать интерфероновый ответ клетки-хозяина. E3L является небольшим белком, который обязателен для патогенности44. Если vaccinia virus вводится мыша, то мыши погибают в течение недели. Однако, вирус, который мутантен или лишен E3L больше не является патогенным для мышей, даже если вирус все-ещё воспроизводится в культуре клеток44. Белок имеет N-терминальный домен с последовательностями, которые характерны для связывания Z-ДНК (Z E3L ), и C-терминальный домен, который имеет dsRNA-связывающий мотив. В инфицированных клетках E3L экспортируется в ядро, где он накапливается.

Viral pathogenicity


Для изучения патогенности vaccinia virus у мышей и ее взаимоотношения с возможной Z-ДНК-связывающей активностью E3L обеспечено сотрудничество между лабораториями Rich и Jacobs. Были соданы химерные вирусы, в которых N-терминальный домен в vaccinia E3L (Z E3L ) удален. Z E3L имеет сходные последовательности с ZαADAR1 и Z DLM1. Созданы два химерных вируса, у которых два известных Z-ДНК-связывающие домена замещали Z E3L. У несущих этот домен swaps, меньше десятка аминокислот в домене остались неизменными; это были остатки, которые как известно связывают Z-ДНК в ко-кристаллах. Однако, более 50 др. остатков было изменено. Химерные вирусы были столь же патогенны, что и вирусы дикого типа45; однако, когда N-терминальные остатки vaccinia E3L делетировали, то мыши выживали (Рис. 4). В др. экспериментах мутации вносились как в химерные, так и дикого типа вирусы; если связывание Z-ДНК ослаблялось этими мутациями, по патогенность вирусув снижалась45. Предполагается, что Z E3L домен в ядре инфицированных клеток м. связываться с Z-ДНК, которая формируется вблизи стартового сайта транскрипции определенных генов, которые б. нарушать способность клеток-хозяев осуществлять транскрипцию и тем самым ингибировать антивирусную реакцию45. Вероятно небольшая молекула или лекарство м.б. получены, которые б. соединяться с Z-ДНК-связывающим карманом в молекуле E3L. Если такая молекула будет обеспечивать выживание мышам, инфицированным вирусом ваккцины, то она сожет также быть активной и у людей. Такие молекуля д.б. разарботаны, чтобы элиминировать вредные побочные эффекты вакцинации. И что более важно, белок E3L от очень близкого variola вируса, который является агентом оспы (smallpox), почти идентичен с vaccinia E3L45. Итак, небольшая лекарственная молекула, которая соединяется с E3L м. оказаться способной лечить оспу.
Это первый пример того, что Z-ДНК-связывающий белок участвует в вирусном патогенезе. Если др. вируся используют сходный механизм нарушения защиты хозяина, то тогда эти белки м.б. потенциальными мишенями для антивирусных лекарств.

Conclusions


The Z-ДНК conformation has been difficult to study because it does not exist as a stable feature of the double helix. Instead, it is a transient structure that is occasionally induced by biological activity и then quickly disappears. The discovery и bio-logical activity of Z-ДНК-specific binding proteins point the way to a broader under-standing of its biological roles. One active area of research will be the comparison of the occurrence of Z-ДНК-forming sequences и Z-ДНК-binding proteins between prokaryotes и eukaryotes; already, there are indications that sequences that form Z-ДНК are less frequent in prokaryotes (P. S. Ho, per-sonal communication). What we have seen so far is just the beginning, but it has provided insights that are likely to stimulate more research into this unusual left-handed version of the ДНК double helix.
Сайт создан в системе uCoz