Микроглия - основные нейроиммунные клетки мозга, составляющие приблизительно 5-15% от общего числа клеток мозга, с неоднородностью в плотности клеток и в транскрипционных паттернах в различных областях мозга [1-4]. Происходя из мезодермы, микроглия образуется из erythro-myeloid progenitors (EMPs) в желточном мешке развивающегося эмбриона [1, 5, 6]. EMPs дифференцируются в примитивные макрофаги-предшественники (PMPs), которые мигрируют в развивающийся мозг, где они дифференцируются в микроглию [5, 7] (рис. 1). После заселения в мозг микроглия поддерживается посредством процесса самообновления [8], зависящего от цитокинов, включая интерлейкин (IL)-34 и колонии стимулирующий фактор (CSF)-1 [9-11], и от транскрипционных факторов, таких как PU.1 и интерферон-регулирующий фактор 8 [12].



Рис. 1: Краткие пути развития микроглии у мыши. EMPs arise at embryonic day (E) 7.5 during the first wave of hematopoiesis in the yolk sac. EMPs-derived PMPs colonize the developing brain at E9.5 and further differentiate into microglia.

Микроглия хорошо известна своими важнейшими функциями в иммунном надзоре. В головном мозге микроглия служит в качестве резидентных фагоцитов, которые динамически отслеживают окружающую среду. В нормальных физиологических условиях покоящиеся микроглии сильно истончены и разветвлены. В то время как в состоянии болезни или других условиях, нарушающих гомеостаз мозга или иммунную среду, микроглия активизируется и становится короткой и толстой [13]. Активированная микроглия быстро реагирует на эндогенные или экзогенные патологические раздражители и уничтожает патогенные виды посредством пиноцитоза, фагоцитоза или рецептор-опосредованного эндоцитоза, тем самым защищая мозг от повреждений, вызванных патологическими раздражителями [14].

Помимо иммунных функций, микроглия также играет важную роль в развитии нейронов [15], формировании и пластичности синапсов [16, 17] и созревании нейронных сетей [18]. Микроглия избирательно колонизирует пролиферативные зоны коры и фагоцитирует клетки-предшественники нейронов (NPCs), регулируя нейронное развитие [19]. Во время постнатального развития мозга микроглия активно поглощает синаптический материал и устраняет слабые синапсы, формируя нейронные цепи путем синаптической выбраковки [18].

Исследования, проведенные за последние десятилетия, указывают на дисфункцию микроглии при многочисленных заболеваниях мозга [20], начиная от психических расстройств (например, шизофрении, биполярного расстройства и аутизма) [21, 22] и заканчивая нейродегенеративными заболеваниями, включая болезнь Альцгеймера (БА) и болезнь Паркинсона (БП) [23, 24]. Разработка терапевтических средств, направленных на микроглию, стала многообещающим подходом к терапии заболеваний мозга, связанных с микроглией. Чтобы понять, как микроглия способствует развитию и патологии мозга, были созданы многочисленные модели микроглии, включая модели животных in-vivo, двумерные (2D) клеточные культуры, химерные модели человеческой мышинной микроглии и новые трехмерные (3D) культивируемые микроглию содержащие органоиды человеческого мозга (MC-HBOs). Основные плюсы и минусы этих моделей микроглии представлены в Таблице 1.

Table 1 Major pros and cons of microglial models.

Животные модели in-vivo, включая пиявки , рыбок данио, грызунов и не-человекообразных приматов, интенсивно используются для изучения микроглии [25]. Благодаря использованию технологий, включая маркировку in-vivo, живую визуализацию, редактирование генов, высокопроизводительное секвенирование и т.д., животные модели позволили нам многое понять об основных характеристиках, путях развития и функциях микроглии [26]. Животные модели, несомненно, полезны для раскрытия новых важных открытий в биологии микроглии. Однако такие ключевые особенности, как транскрипционные и фармакологические различия между микроглией животных и человека, ограничивают применение животных моделей в исследованиях микроглии человека [27-30]. Например, микроглия человека и мыши противоположно реагирует на вальпроевую кислоту, лекарство от эпилепсии и биполярного расстройства. При воздействии вальпроевой кислоты микроглия мыши избирательно погибала, а микроглия человека - нет [29]. Еще одним ключевым ограничением животных моделей являются генетические различия между животными и людьми. Например, ген риска развития шизофрении - компонент комплемента 4 (C4) [31] - имеет изотипы C4A и C4B у человека, но только C4b у мыши. Учитывая, что активная экспрессия C4A в мозге связана с повышенным риском развития шизофрении [31], мышь с нокаутом C4b может быть не очень хорошей моделью для шизофрении и других заболеваний, связанных с выбраковкой микроглии. Кроме того, модели на животных обычно требуют длительного экспериментального периода и мотивируют разработку моделей клеточных культур in-vitro для изучения микроглии человека.

Поскольку первично выделенные микроглии имеют тот же генетический фон и схожие фенотипы, что и клетки in-vivo, микроглия, выделенная из мозга грызунов, не-человекообразных приматов и человека, использовалась для культур ex-vivo [26, 32]. В частности, человеческая первичная микроглия может быть выделена из посмертных тканей мозга, при хирургии эпилепсии или опухолей мозга [26, 32], что позволяет проводить исследования на генетическом фоне человека. Однако перенос микроглии человека или животных в среду in-vitro приводил к транскриптомным изменениям экспрессии генов, включая подавление специфических для микроглии генов [28, 33]. Остро изолированная первичная микроглия, вероятно, активированая ex-vivo и может иметь характеристики, отличные от микроглии in-vivo. Изолированные первичные микроглии также могут демонстрировать противоречивые фенотипы, поскольку они могут быть выделены из разных областей мозга или у людей с разным состоянием здоровья [26]. Более того, высококачественные человеческие посмертные мозги трудно получить, а для каждой хирургической операции необходима тщательная подготовка. Эти ограничения препятствуют применению первичных культур микроглии [34].

Линии микроглиальных клеток, как правило, представляют собой однородные клеточные популяции с высокой скоростью пролиферации клеток. Использование линий микроглиальных клеток может сократить период эксперимента и сделать возможной недорогую культуру клеток, что делает их подходящими для фундаментальных исследований и высокопроизводительных скрининговых анализов. Благодаря этим преимуществам, для изучения микроглии был использован ряд иммортализованных линий микроглиальных клеток мышиного, крысиного, макак-резус и человеческого происхождения, включая широко используемые линии клеток BV2, N9 и HMO6 [35]. Однако сложные клеточные взаимодействия и среда, подобная среде in-vivo, отсутствуют в линиях клеток микроглии. Исследования подчеркнули ограниченность клеточных линий микроглии в воспроизведении транскрипционных сигнатур, морфологии и функций микроглии in-vivo [32, 35]. Более того, фенотипы и транскрипционные паттерны микроглии могут быть изменены после вирусной инфекции или иммортализации.

В дополнение к первичным микроглиям и immortalized microglial cell lines, iMGs , индуцированные из эмбриональных стволовых клеток мыши [36, 37] или индуцированных из плюрипотентных стволовых клеток человека (hiPSCs) [38-45], могут стать подходящими моделями для изучения микроглии. hiPSCs особенно полезны благодаря своей способности сохранять генетический фон доноров, самообновляться и поддаваться редактированию генов. Хотя технология hiPSCs быстро развивалась с момента ее появления в 2006 году [46], только в 2016 году Muffat et al. опубликовали первый протокол для получения iMGs из hiPSCs [38]. После этого несколько исследований опубликовали аналогичные стратегии по получению iMGs из hiPSCs [39-45]. Подробные сходства и различия между этими протоколами дифференцировки были хорошо рассмотрены в предыдущих обзорах [32, 47]. Здесь мы подчеркиваем, что iMG, полученные в результате всех этих протоколов, функционально напоминают микроглию in-vivo в отношении их способности фагоцитировать экзогенные вещества и отвечать на иммунную стимуляцию. Транскриптомное сравнение и анализ главных компонент подтвердили сходство iMGs с первичной микроглией человеческого плода [38-44] и даже взрослого человека [38-40, 43].

Другая стратегия создания iMGs заключается в трансдифференцировке мононуклеарных клеток периферической крови человека [48, 49] или моноцитов, полученных из hiPSCs [50], в микроглии путем добавления IL34 и GM-CSF или M-CSF в среду дифференцировки. Примерно через две недели культуры клетки дифференцировались в iMGs, которые транскрипционно напоминали первичную микроглию человека и демонстрировали типичные характеристики микроглии in-vivo. Эти подходы к трансдифференцировке могут быть быстро созданы и просты в эксплуатации в качестве альтернативной модели iMGs.

Хотя iMGs являются легкодоступными источниками для изучения микроглии, недостатки iMGs также существуют. iMGs показали транскрипционную и морфологическую гетерогенность в разных протоколах дифференцировки. Например, iMGs, полученные в исследованиях Pandya et al. [40] и Muffat et al. [38], не очень хорошо отделялись от дендритных клеток крови и макрофагов, согласно анализу иерархической кластеризации на основе корреляции. iMGs, полученные в некоторых исследованиях [40, 45, 50], не демонстрировали высокоразветвленной морфологии, как сообщалось в других исследованиях iMGs [38, 39, 41-44]. Более того, насколько iMGs могут имитировать микроглию in-vivo, остается неясным, поскольку взаимодействие микроглии и нейронов и микроокружения в головном мозге как in-vivo обычно отсутствуют в культуральных системах iMGs.

Для изучения человеческой микроглии in-vivo были разработаны химерные модели, в которых в мозг мыши трансплантировали hiPSCs-производные микроглиальные клетки предшественники (MPCs) [51, 52] или микроглия [53, 54]. Ксенотрансплантация микроглии продемонстрировала высокоразветвленную морфологию в гомеостатическом состоянии, и гетерогенность микроглии взрослого человека [51, 52] и транскрипционно напоминали культивированную ex-vivo микроглию, полученную из тканей мозга человека (возраст от 13 до 102 лет) [51-54]. Ксенотрансплантированная человеческвя микроглия показали дифференцированный транскрипционный ответ на амилоид-β (Аβ)-бляшки по сравнению с мышиной микроглией, выявив новые специфические для человека Аβ-реактивные гены [53, 54]. Сравнивая транскриптомные данные 2D-культивированных iMGs [39] и iMGs, трансплантированных в мозг мыши [52], Popova et al. [55] показали, что микроокружение мозга мыши in-vivo значительно повышает точность воспроизведения iMGs. Химерные модели могут лучше моделировать характеристики человеческой микроглии, чем другие подходы in-vitro [53], однако существует несколько важных различий между ксенотрансплантированными iMGs и первичной микроглией человека. Например, сигнатуры цитокинов и хемокинов, которые специфически ассоциируются со средой человеческого мозга, были значительно снижены в iMGs, трансплантированных в мозг мыши [55]. Эти результаты позволили предположить потенциальное влияние межклеточных взаимодействий на формирование транскрипционных и функциональных различий между микроглией человека и мыши [55]. Модель на основе клеток человека, содержащая сложные клеточные взаимодействия и физиологические условия in-vivo, может стать интересной альтернативой для изучения микроглии.

Микроглия функционирует благодаря взаимодействию с другими типами клеток мозга. Межклеточные сигнальные пути позволяют микроглии взаимодействовать друг с другом и окружающей микросредой [56, 57]. Поскольку сложные клеточные архитектуры, подобные человеческому мозгу in-vivo, обычно недоступны в двумерных клеточных культурах, исследования подчеркнули недостатки двумерных культур микроглии в воспроизведении признаков in-vivo [32, 55, 58, 59]. Хотя животные модели или химерные модели могут обеспечить микросреду in-vivo для микроглии, отсутствие генетического фона человека или взаимодействия между микроглией и другими типами клеток человеческого мозга является еще одной проблемой для изучения микроглии. Желательна модель, содержащая несколько типов клеток человека, которая облегчает взаимодействие микроглии с нейронами/макроглией.

3D культивируемые HBOs, разработанные в последние годы, стали эффективным решением для изучения микроглии. HBOs - это трехмерные самособирающиеся структуры, полученные из hiPSCs или эмбриональных стволовых клеток человека (hESCs), которые напоминают клеточную организацию и траектории развития человеческого мозга. В целом, HBOs содержат предшественники (NPCs, клетки радиальной глии и т.д.), нейронные и глиальные типы клеток (астроциты и олигодендроциты), а также другие типы клеток [60-64]. HBOs повторяют эпигенетические и транскриптомные сигнатуры мозга плода человека [65, 66] и даже соответствуют раннему постнатальному созреванию мозга [65, 67], предоставляя уникальную платформу для моделирования развития и заболеваний мозга человека. Например, Pe'rez et al. использовали HBOs для изучения функциональных последствий нокаута металлопептидазы питрилизина 1 (PITRM1). Они обнаружили, что в нокаутированных по PITRM1 HBO спонтанно развивались патологические признаки болезни Алцгеймера, включая накопление агрегатов белка-предшественника амилоида (APP), патологию tau и гибель клеток нейронов. Хотя наблюдалось накопление APP и увеличение соотношения Aβ42/Aβ40, ни явной гибели клеток, ни агрегатов Aβ или патологии tau не было обнаружено в двухмерных нейронных культурах, полученных из hiPSCs [68]. Эти результаты подчеркнули преимущества трехмерных HBOs по сравнению с двухмерными клеточными культурами при моделировании патологических особенностей заболевания. Кроме того, HBOs позволяют проводить исследования на генетическом фоне человека, что делает их привлекательными для моделирования заболеваний, изучения функции генов и скрининга лекарств. На сегодняшний день HBOs широко используются для моделирования широкого спектра заболеваний мозга, включая шизофрению [69], биполярное расстройство [70], расстройство аутистического спектра [71] и нейродегенеративные заболевания, такие как болезнь Паркинсона [72] и болезнь Алцгеймера [73].

Клетки нейрональной линии имеют эктодермальное происхождение. Дифференцировка в направлении эндодермы и мезодермы обычно подавляется во время формирования HBOs. Поэтому обычно считается, что микроглия отсутствует в HBOs из-за их не-нейроэктодермального происхождения. В настоящее время разработано несколько стратегий для создания MC-HBOs, позволяющих лучше понять функции микроглии и их связь с нарушениями работы мозга. Основные плюсы и минусы этих стратегий перечислены в Таблице 2, чтобы сориентировать выбор для изучения микроглии.

Table 2 Summary of strategies used to generate MC-HBOs.

Поскольку считается, что микроглия отсутствует в HBOs, мы естественно предложили кокультивировать HBOs с экзогенной микроглией для создания MC-HBOs (рис. 2). Насколько нам известно, Abud et al. [39] первыми совместно культивировали полученные из hiPSCs iMGs с HBOs, содержащими нейроны, астроциты и олигодендроциты. Они обнаружили, что iMGs способны интегрироваться в HBOs, созревать, развиваться и отвечать на травму так же, как микроглия in vivo. Как iMGs в 2D культуре, так и ксенотрансплантированные в иммунодефицитных мышей с болезнью Альцгеймера, могли интернализировать и фагоцитировать бляшки Aβ или нейрофибриллярные клубки тау, две характерные патологии БА [39]. Однако вопрос о том, могут ли iMGs, интегрированные в HBOs, фагоцитировать патологические виды, не исследовался.



Fig. 2: Co-culture of microglia with HBOs to generate MC-HBOs.

(A-I) The sources of microglia, timeline, and key molecules used to generate MC-HBOs are presented. The markers and methods used for microglia characterization are shown. BDNF Brain-derived neurotrophic factor, CHIR CHIR99021, CSF Colony-stimulating factor, EB Embryonic body, EBFM Embryonic body formation media, EGF Epidermal growth factor, FBS Fetal bovine serum, FGF Fibroblast growth factor, GDNF Glial cell-derived neurotrophic factor, GM-CSF Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, HSA Human serum albumin, KSR Knockout serum replacement, LDN LDN193189, NDM Neural differentiation media, NIM Neural induction media, NMM Neural maturation/maintenance media, SB SB431542, SCF Stem cell factor, Vit.A Vitamin A, Vit.C Vitamin C, Y27 Y27632, ZIKV Zika virus.

После исследования, проведенного Abud et al., в ряде других работ iMGs также были включены в HBOs для создания MC-HBOs. Путем совместного культивирования HBOs с изогенными iMGs, Song et al. [74] создали сфероиды дорсального или вентрального переднего мозга, содержащие iMGs (D-iMGs и V-iMGs, соответственно). В их исследовании D-iMGs и V-iMGs показали различную способность микроглии к миграции, к внутриклеточной передаче сигналов Ca²⁺ и к ответу на провоспалительные стимулы. В D-iMGs и V-iMGs наблюдалась повышенная клеточная пролиферация (большее количество BrdU+ клеток) и снижение количества реактивных форм кислорода по сравнению с таковыми в iMGs. При сравнении транскриптома из D-iMGs и только из iMGs были выявлены наборы дифференциально экспрессированных генов, включая гены, специфичные для нейронов и глиальных клеток. Однако такое сравнение сомнительно, поскольку D-iMGs содержат различные типы клеток в дополнение к микроглии, в то время как iMGs содержат только микроглию. Источники фенотипических и транскрипционных различий не могут быть определены. Эти различия могут просто отражать внутренние различия клеточного состава между кортикальными сфероидами и iMGs. Аналогичным образом, исследование Bejoy et al. [75], изучающее влияние микросреды 3D-культивирования на метаболические фенотипы iMGs, столкнулось с той же проблемой. Они повторно проанализировали транскриптомные данные Song et al. [74], чтобы выявить транскрипционные различия в метаболических путях между D-iMGs и iMGs. Было обнаружено, что гены, связанные с гликолизом, сигнализацией гипоксии и несколькими метаболическими путями, повышены в D-iMGs. Однако, возможно, преждевременно делать вывод о том, что 3D микросреда может изменить иммунитет кортикальных сфероидов in-vitro [75], сравнивая транскриптомы D-iMGs и только iMGs.

Ao et al. [76] использовали стереолитографический 3D-принтер для создания трубчатого устройства для культуры органоидов мозга. Они заявили, что трубчатое устройство уменьшает некроз органоидов и гипоксию. Изогенная микроглия могла встраиваться в трубчатые органоиды и демонстрировать более сильный цитокиновый ответ по сравнению с таковым в двумерных iMGs. В частности, уровень фактора некроза опухоли (TNFα) был значительно повышен в трубчатых органоидах, с инкорпорированной микроглией, но не в двумерных iMGs после воздействия липополисахарида (LPS), что свидетельствует о преимуществе MC-HBOs в моделировании нейровоспаления.

В вышеуказанных исследованиях были созданы модели MC-HBOs, но как микроглия внутри HBOs похожа на первичную микроглию человека и как она влияет на функции HBOs, не изучалось. Недавно Popova et al. [55] провели комплексное сравнение транскриптомных сигнатур микроглии в различных моделях, включая iMGs, iMGs, пересаженные в мозг мыши, первичная микроглия, культивированные ex-vivo или пересаженные в HBOs, для создания табеля микроглии. Они обнаружили, что человеческая первичная микроглия, пересаженная в HBOs, имела самое близкое сходство со своими аналогами in-vivo, это говорит о том, что микросреда органоида мозга сохраняет гомеостатическое состояние микроглии [55]. Далее они обнаружили, что радиальная глия и делящиеся клетки в HBOs - два основных типа клеток, реагирующих на трансплантацию микроглии. Микроглия, пересаженная в HBOs, вызвала транскрипционные изменения, уменьшила клеточный стресс и ослабила экспрессию генов ответа на интерферон. Микроглия также увеличивала синхронизацию и частоту осцилляторных всплесков в HBOs, что способствовало созреванию нейронных сетей [55], подчеркивая вклад микроглии в развитие нейронов. Исследование Popova et al. [55] представило более убедительные доказательства того, как микроглия и органоиды мозга влияют друг на друга.

Используя MC-HBOs, исследователи изучали, как микроглия действует при патологии мозга. Lin et al. [77] совместно культивировали iMGs, несущие APOE3- или APOE4, с HBOs с дупликацией гена APP, в которых были обнаружены агрегаты Aβ для изучения влияния микроглии на патологию болезни Алцгеймера. Они обнаружили, что органоиды с дупликацией гена APP, совместно культивированные с iMGs APOE4, демонстрировали больше внеклеточных агрегатов Aβ, чем органоиды, совместно культивированные с iMGs APOE3. Более того, iMGs APOE4 в органоидах с дупликацией APP показали более длинные отростки, чем iMGs APOE3, это говорит о том, что iMGs с вариантом APOE4 были менее способны чувствовать и реагировать на внеклеточный Aβ Эти результаты подтверждают, что вариант APOE4 влияет на патологию болезни Альцгеймера главным образом через способность iMGs очищать внеклеточный Аβ.

В ряде других исследований MC-HBOs применялись для моделирования ZIKA [78, 79], Dengue [78, 79] и ВИЧ-1 вирусной инфекции [80]. Например, Muffat et al. [78] показали, что предварительно инфицированные вирусом ZIKA iMGs проникали в HBOs и распространяли вирус ZIKA, инициируя заражение соседних клеток, что приводило к остановке роста HBOs. Abreu et al. [79] также использовали MC-HBOs для моделирования ZIKA и вирусной инфекции Денге, включив в HBOs инфицированные вирусом SV40 микроглиальные клетки человека. MC-HBOs поддерживали репликацию вирусов ZIKA и Денге. Повышение экспрессии нескольких генов цитокинов/хемокинов наблюдалось в MC-HBOs после заражения вирусом ZIKA (IL6, IL1β, TNFα и CCL2) и вирусом Денге (IL1β и CCL2). Однако из-за быстрой и неограниченной пролиферации иммортализованных микроглиальных клеток SV40, MC-HBOs могли поддерживаться только в течение 7 дней после включения микроглии. В другом исследовании Reis et al. [80] включили инфицированные ВИЧ-1 человеческие микроглиальные клетки HMC3 в HBOs и обнаружили, что ВИЧ-1 инфекция индуцировала воспалительный ответ и высвобождение провоспалительных факторов (TNFα и IL1β). Как и в исследовании Abreu et al. [79], MC-HBOs можно было поддерживать только в течение 15 дней после инкорпорации микроглии. Чтобы обеспечить долгосрочную культуру MC-HBOs, Reis и др. включили в HBOs первичные человеческие взрослые микроглиальные клетки, предварительно инфицированные ВИЧ-1. Они обнаружили, что ВИЧ-1 инфекция привела к значительной цитотоксичности, потере нейронов и активации астроцитов в MC-HBOs, которые являются основными отличительными признаками, наблюдаемыми в мозге ВИЧ-1 инфицированных людей [80]. Эти исследования показали, что MC-HBOs могут поддерживать вирусную репликацию и вызывать сильный иммунный ответ на вирусную инфекцию.

В целом, вышеприведенные исследования показали, что микроглия может встраиваться в HBOs и изменять иммунитет и функции HBOs. Эта модель ко-культуры может стать полезным инструментом для моделирования развития и патологии мозга. Однако микроглия из разных исследований может отличаться по степени зрелости и способности отвечать на иммунные стимулы, что может привести к противоречивым результатам после включения микроглии в HBOs. Например, iMGs в исследовании Abud et al. [39] секретировали более высокие уровни цитокинов IL6, IL8, IL10 и TNFα после воздействия LPS. Однако в исследовании AO et al. [76] в iMGs после воздействия LPS не было обнаружено изменений уровня TNFα В исследовании Abreu et al. [79] экспрессия генов IL6, IL8 и IL10 также не увеличилась в микроглиальных клетках SV40 после обработки LPS. Интересно, что лечение LPS повысило экспрессию генов IL6, IL8 и IL10 в HBOs, содержащих микроглию SV40, по сравнению с HBOs без микроглии [79]. Эти результаты свидетельствуют о перекрестном взаимодействии между микроглией и другими типами клеток, включая астроциты и олигодендроциты в органоидах мозга. Такие перекрестные связи могут играть важную роль в иммунном ответе [81, 82] и необходимы для специфического воспалительного ответа.

Микроглия - это клетки мезодермального происхождения. Встраивание MPCs (EMPs или PMPs) в HBOs может также привести к образованию микроглии в микросреде HBOs (рис. 3). Путем совместного культивирования hiPSCs-произведенных мезодермальных предшественников (Brachyury+) с нейронными сфероидами, Wörsdörfer и др. [83] воспроизвели васкуляризированные нейронные органоиды с сосудоподобными структурами (CD31+) и включением микроглиеподобных клеток. Это исследование предоставило модель для изучения ангиогенеза и развития нейронов, однако функционирование микроглии в органоидах не изучалось. В другом исследовании Fagerlund et al. [84] сообщили, что полученные из hiPSCs EMPs (CD41+) мигрировали в HBOs, дифференцировались в микроглия-подобные клетки и взаимодействовали с синаптическим материалом. Записи с помощью клеточных патч-клампов (patch-clamp) и многоэлектродных решеток показали, что микроглия в органоидах способствовала созреванию нейронной сети. В частности, спонтанная и NMDA-индуцированная взрывная активность нейронов была сильнее и преобладала в органоидах с микроглией, чем в органоидах без микроглии. Возбуждающие постсинаптические токи (EPSCs) присутствовали только в нейронах из органоидов, содержащих микроглию, после 107-го дня [84]. В недавнем исследовании [85], в котором органоиды среднего мозга человека совместно культивировались с макрофагами-предшественниками, полученными из hiPSCs, также сообщалось, что интеграция микроглии привела к увеличению нейронного созревания и функциональности. Записи с помощью клеточного патч-клампа и многоэлектродных решеток показали, что в органоидах среднего мозга с интеграцией микроглии наблюдался более низкий порог генерации потенциала действия и более короткий межспайковый интервал, что свидетельствует о том, что интеграция микроглии способствовала созреванию нейронов. Присутствие микроглии в органоидах среднего мозга также увеличивало выброс цитокинов (включая IL6, IL10, IL1β и TNFα) и влияло на экспрессию генов, связанных с иммунным ответом, воспалением, фагоцитозом, синаптическим ремоделированием и созреванием [85].



Fig. 3: Co-culture of MPCs with HBOs to generate MC-HBOs.

(A-C) MPCs derived from hiPSCs were co-cultured with HBOs to generate microglia in HBOs. EMP Erythro-myeloid progenitor, MEA multi-electrode array, SAG Smoothened agonist, TPO thrombopoietin, VEGF Vascular endothelial growth factor.

Включение MPCs в HBOs представляет собой перспективную модель для изучения микроглии, поскольку эта стратегия позволяет генерировать MC-HBOs с включением сосудоподобных структур. Появление сосудоподобных структур может улучшить выживаемость и зрелость органоидов мозга, хотя существующие сосудистые структуры далеки от функциональности. Важно отметить, что микроглия, полученная в рамках данной стратегии, имитирует траектории развития микроглии in-vivo, напоминая процесс миграции предшественников микроглии в ранний развивающийся мозг для дальнейшего созревания. Однако количество микроглии и других потенциальных клеток мезодермальной линии, развивающихся в HBOs, не контролируется после включения MPCs. Например, количество микроглии, развившейся в MC-HBOs с использованием этой стратегии, составило только 1,18% от общего числа клеток, как показало секвенирование одноклеточной РНК (scRNA-seq) [85]. Это количество намного ниже, чем в здоровом человеческом мозге.

Исследования показали способность NPCs к самосборке в трехмерные органоиды мозга [86]. Ко-культура человеческих MPCs с NPCs может стать альтернативой для создания MC-HBOs (рис. 4). Эта стратегия позволяет исследователям изучать взаимодействие между микроглией и NPC или развивающимися нейронами во время формирования органоида, а также генерировать однородные и контролируемые по соотношению типов клеток MC-HBOs. Путем совместной кластеризации полученных из hiPSCs PMPs (CD43+ и CD235+) и NPCs, Xu et al. [87] создали MC-HBOs, специфичные для областей мозга, с контролируемой долей микроглии (8% от общего числа клеток). В MC-HBOs микроглия проявляла способность фагоцитировать NPCs, удалять апоптотические клетки, выбраковывать синапсы и отвечать на иммунные стимулы. Микроглия также могла реагировать на вирус ZIKA и демонстрировала повышенную синаптическую элиминацию в MC-HBOs. Важно отметить, что нейроны в MC-HBOs (~90 дней) демонстрировали EPSC, что свидетельствует о создании функциональной нейронной сети в органоидах.



Fig. 4: Co-culture of MPCs with NPCs to generate MC-HBOs.

(A-B) MPCs derived from hiPSCs or hESCs were co-cultured with NPCs to generate MC-HBOs. hLIF human leukemia inhibitory factor, RA Retinoic acid.

Используя методы ко-культуры Xu's [87], Jin et al. [88] создали MC-HBOs для изучения функций микроглии при синдроме Дауна (DS). В их исследовании микроглия DS в HBOs демонстрировала усиленнe. синаптическe. выбраковку без значительных морфологических изменений по сравнению с контрольной микроглией. После трансплантации в мозг мыши, как микроглия DS, так и контрольная микроглия демонстрировали все более сложную морфологию. Однако ксенотрансплантированная микроглия DS демонстрировала менее сложную морфологию, чем контрольные микроглии, о чем свидетельствовали увеличенный объем клеток, сокращенная длина отростков, меньшее количество концевых точек и ветвей. Эти результаты позволили предположить, что MC-HBOs воспроизводят усиленную функцию синаптической выбраковки микроглии DS, но не являются оптимальными для моделирования морфологических изменений микроглии DS. Это может быть связано с тем, что микроглия в HBOs не демонстрировала сильно разветвленную морфологию, как это было in-vivo. Кроме того, для изучения влияния микроглии DS на синаптическую передачу в HBOs было ограничено использование MC-HBOs, так как нейроны не демонстрировали устойчивых EPSC до окончания длительной культуры (~90 дней) [88]. Авторы пересадили микроглию в мозг мыши и обнаружили, что у химерных мышей с DS миниатюрные EPSCs со значительно сниженной частотой и амплитудой. Микроглия DS демонстрировала дистрофические и старческие фенотипы в ответ на патологический tau. Снижение экспрессии генов рецепторов интерферона I типа (IFNARs), кодируемых Hsa21, спасало от ускоренного старения и дистрофических фенотипов микроглии DS [88], что позволяет предположить терапевтические мишени для лечения AD при DS.

Плюрипотентные стволовые клетки, включая hiPSCs и hESCs, обладают потенциалом дифференцироваться во все типы клеток трех зародышевых слоев (эндодерма, мезодерма и эктодерма). В связи с эктодермальным происхождением нейрональных клеток, для индукции нейроэктодермы обычно использовалось двойное ингибирование SMAD-сигнализации, чтобы подавить дифференцировку в направлении эндодермы и мезодермы [89]. Поскольку ингибиторы передачи сигналов SMAD не использовались в неуправляемом протоколе формирования церебральных органоидов [60], возможно, что в церебральные органоиды выходят клетки не-нейрональной линии. Действительно, анализ scRNA-seq выявил мезодермальные предшественники [62], миелоидные клетки [90] и даже кластеры микроглии [68] в HBO, полученных по неуправляемым протоколам. Исходя из гипотезы о том, что мезодермальные предшественники в HBOs способны дифференцироваться в зрелую микроглию в микросреде органоидов, Ormel et al. впервые создали модель с микроглией, врожденно развивающейся в органоидах головного мозга [91] (рис. 5). Интересно, что авторы лишь просто модифицировали неуправляемый протокол, снизив концентрацию гепарина (с 1 ug/mL до 0,1ug/mL ) и отложив встраивание органоидов в матригель, что привело к производству мезодермальных предшественников и последующей генерации микроглии в органоидах (уже на 24-й день). Микроглия, выращенная в органоидах, имела разветвленную морфологию, экспрессировала специфические для микроглии маркеры, функционально напоминала микроглию взрослого человека и вызывала иммунный ответ в органоидах. Интересно, что в исследовании Ormel et al. [91] в MC-HBOs EPSCs можно было обнаружить уже на 52 день, тогда как в исследованиях Xu et al. [87] и Fagerlund et al. [84] EPSCs можно было обнаружить только на 90 и 107 день.



Fig. 5: Spontaneous formation of microglia within MC-HBOs.

(A-E) hiPSCs or hESCs were used to generate microglia that innately developed within the brain organoids. XAV XAV939, DOX Doxycycline.

На основе протокола Ormel et al. [91] в других исследованиях [92-94] также были получены HBOs, содержащие врожденно развитую микроглии. MC-HBOs были использованы для моделирования инфекции SARS-CoV-2 [93] или западно-тихоокеанского комплекса бокового амиотрофического склероза и паркинсонизма-деменции (ALS-PDC, нейродегенеративное заболевание) [94]. При заражении SARS-CoV-2 врожденно развитые клетки микроглии в органоидах реагировали на вирусную инфекцию путем повышения уровня фагоцитоза и путей, связанных с интерфероном. Было также обнаружено, что при заражении SARS-CoV-2 в микроглии повышается уровень нескольких генов предрасположенности к болезни Альцгеймера и рассеянному склерозу, что указывает на потенциальный вклад SARS-CoV-2 в развитие неврологических симптомов [93]. Используя MC-HBOs, исследование ALS-PDC [94] показало, что переход микроглии в более провоспалительное состояние, которое усугубляет воспаление и снижает прочность внеклеточного матрикса, может объяснять этиологию ALS-PDC. В отличие от предыдущих исследований [91,92,93], в данном исследовании концентрация гепарина не была снижена до 0,1 мкг/мл, что также привело к образованию микроглии в церебральных органоидах.

Хотя микроглия может врожденно развиваться в HBOs, пропорция и распределение микроглии в органоидах очень изменчивы из-за спонтанных и стохастических особенностей неуправляемой дифференцировки [91]. Например, доля CD11B+ микроглии в MC-HBOs составляла около 7% в исследовании Bodnar et al. [92], в то время как в исследовании Ormel et al. до 1,5% [91]. Чтобы создать HBOs с регулируемой долей микроглии, Cakir et al. [95] смешали миелоид-специфический транскрипционный фактор PU.1 с родительскими hESCs (90%) для получения MC-HBOs. Анализ scRNA-seq показал, что транскрипционные профили PU.1-индуцированной микроглии напоминают профили на средних и поздних стадиях развития фетальной микроглии. Примечательно, что авторы заявили, что PU.1-индуцированная микроглия продемонстрировала более схожий транскриптомный профиль с первичной микроглией человека, чем микроглия, полученная в исследовании Omel's [91]. Присутствие микроглии в HBOs значительно ослабляло транскрипционную дисрегуляцию дендритного и синаптического развития и апоптотических генов, вызванную воздействием Aβ Используя MC-HBOs, авторы также обнаружили, что подавление генов риска развития болезни Альцгеймера (TREM2 и SORL1) в PU.1+ клетках не повлияло на генерацию микроглии, но повлияло на их реакцию на воздействие Aβ Данное исследование позволило разработать стратегию создания регулируемой доли (~10%) микроглии в органоидах для изучения микроглии. Однако не все сверхэкспрессированные PU.1 клетки в органоидах были преобразованы в микроглиеподобные клетки, что привело к появлению в органоидах миелоидных клеток с определенной идентичностью и зрелостью. [95].

Микроглия, несомненно, играет важную роль в развитии и гомеостазе мозга. Все больше доказательств связывают дисфункцию микроглии с различными заболеваниями мозга. Исследования, основанные на генетике, посмертном исследовании мозга человека, клинической визуализации и животных моделях, убедительно доказали, что микроглия является центральным типом клеток, вносящим вклад в этиологию болезни Альцгеймера [14, 24, 96-99]. Исследования также позволили предположить, что микроглия является ключевым модулятором токсичности синуклеина при болезни Паркинсона [100, 101]. В мышиной модели болезни Паркинсона активация микроглии способствовала передаче агрегатов α-синуклеина от клетки к клетке [100], а ингибирование воспаления, опосредованного микроглией, уменьшало патологию α-синуклеина и дофаминергическую нейродегенерацию [101]. Помимо нейродегенеративных заболеваний, дисфункция микроглии также связана с широким спектром психических расстройств [21, 22]. Исследования, включая исследование геномных ассоциаций [31] и анализ коэкспрессии генов на основе данных транскриптома посмертного мозга человека [102], позволили предположить патологическое участие микроглии в шизофрении, биполярном расстройстве и аутизме. Для понимания роли микроглии в заболеваниях мозга необходима надежная микроглиальная модель, имитирующая человеческий мозг in-vivo.

Недавно созданные MC-HBOs стали перспективной моделью для изучения того, как микроглия модулирует развитие и патологию мозга. В настоящее время разработано несколько стратегий создания MC-HBOs для изучения развития и нарушений мозга и вирусной инфекции, которые рассматриваются в данной статье. В этих исследованиях подчеркивается, что MC-HBOs похожи на микроглию in-vivo, такие как специфические для человека паттерны экспрессии генов цитокинов и хемокинов [55] и уникальные воспалительные реакции на вирусную инфекцию [79]. В такой развивающейся области большинство текущих исследований сосредоточено на создании надежных моделей MC-HBOs. Что касается будущих работ, то включение микроглии в HBOs может быть использовано для изучения того, как специфические для микроглии гены или генетические вариации влияют на фенотипы мозга, и как микроглия сама по себе модулирует функции мозга. Совместное культивирование MPCs с HBOs, которые могут лучше имитировать траектории развития микроглии in-vivo, может быть использовано для изучения того, как среда HBOs влияет на развитие микроглии. Ко-культура MPCs с NPCs может быть использована для изучения совместного развития микроглии и нейронов. Что еще более важно, совместная культура MPCs с NPCs [87, 88] может генерировать MC-HBOs с контролируемой долей микроглии (~8%), аналогичной физиологическим условиям. В дополнение к методам совместной культуры, стратегия, при которой микроглия врожденно развивается в HBOs, является простым методом создания MC-HBOs для изучения генетических вариаций, существующих во всех типах клеток. Этот упрощенный метод подходит для исследований больших выборок, таких как транскриптомные исследования случай-контроль, основанные на MC-HBOs. Учитывая, что микроглия влияет на транскрипционные паттерны и фенотипы органоидов мозга, применение MC-HBOs в транскриптомных исследованиях случай-контроль может дать новые знания, которые могут быть упущены в исследованиях, основанных на органоидах мозга без микроглии.

Мы должны помнить, что надежная модель органоидов мозга необходима для получения воспроизводимых результатов исследований микроглии. Необходимо срочно разработать золотые стандарты для определения того, что такое "истинные" органоиды мозга, поскольку различные протоколы, скорее всего, создадут HBO с различными характеристиками, которые приведут к противоречивым результатам. Органоид человеческого мозга должен демонстрировать аналогичный клеточный состав (предшественники, нейроны и клетки глии и т.д.), клеточные структуры (появление желудочковой зоны, слоев коры и т.д.), паттерны экспрессии генов и траектории развития, как и человеческий мозг in-vivo. Таким образом, сложно назвать трехмерные клеточные культуры путем смешивания нейронов с другими типами клеток (например, микроглией и астроцитами) "органоидами", поскольку клеточная организация и состав, а также пути развития клеток в системе клеточной смеси не могут имитировать таковые в человеческом мозге. По этим причинам в данный обзор не были включены те исследования [103, 104], в которых разрабатывались трехмерные ассемблоиды [105] путем совместного культивирования нейронов, микроглии и астроцитов. Ассемблоиды, по определению Pasca [105], представляют собой трехмерные структуры, образованные в результате слияния и функциональной интеграции нескольких типов клеток. MC-HBO, сформированные с помощью стратегий ко-культуры, также могут быть определены как ассемблоиды [105]. В будущем создание ассемблоидов путем слияния MC-HBOs с различными регионами мозга будет полезно для изучения региональной гетерогенности микроглии.

В дополнение к стандартам для органоидов мозга, верность микроглии внутри MC-HBOs является еще одной ключевой проблемой в изучении микроглии. Микроглия - очень сложный и динамичный тип клеток. Морфология и транскрипционные паттерны микроглии могут быть изменены в ответ на окружающую среду. Насколько индуцированная микроглия может имитировать клетки in-vivo и вызывать последовательные реакции, еще предстоит выяснить. Микроглия, полученная по разным протоколам, может отличаться по своему происхождению и способности воспроизводить сигнатуры in-vivo. Например, микроглия, полученная из hiPSCs разными методами, показала транскрипционную и морфологическую гетерогенность, что привело к потенциально гетерогенным фенотипам после включения в HBOs. Для характеристики микроглии необходимы анализы, используемые для изучения идентичности и состояния микроглии, фагоцитотической функции, ответа на иммунные стимулы и т.д. Также необходима систематическая оценка, чтобы определить, какая стратегия лучше для создания MC-HBOs, которые повторяют истинный онтогенез и признаки микроглии человека in-vivo.

В данном обзоре освещены достоинства и применение MC-HBOs среди нескольких моделей микроглии, следует отметить некоторые очевидные недостатки существующих MC-HBOs. Во-первых, MC-HBOs являются моделями in-vitro по своей природе и вряд ли полностью повторяют особенности человеческого мозга in-vivo. В современных MC-HBO отсутствуют сосудистые системы, что приводит к повышенному клеточному стрессу, который препятствует спецификации типов клеток и созреванию органоидов мозга [106]. Кроме того, отсутствие сложных нейронных цепей и интактной иммунной системы также ограничивает дальнейшее созревание HBOs для изучения мозга взрослого человека и поздних расстройств мозга с помощью современных MC-HBOs. В будущем для культивирования органоидов мозга могут быть использованы такие подходы, как воздушно-жидкостно-интерфазная культура [107], система васкуляризации [108] и микрофлюидная система [109], чтобы ослабить клеточный стресс и способствовать созреванию органоидов.

Каждая модель микроглии имеет свои преимущества и недостатки (Таблица 1), использование подходящей модели в конкретной ситуации или комбинирование использования различных моделей может дать надежные результаты для изучения микроглии. Например, исследователи объединили использование HBOs и мышиной модели и обнаружили, что после трансплантации HBOs установили дальние субкортикальные проекции в мозге мыши. Нейроны, дифференцированные из пересаженных HBOs, функционально интегрировались в нейронные цепи мыши [110, 111]. Химерные модели HBOs-мыши позволяют проводить исследования в условиях, аналогичных in-vivo. Поскольку модель мыши может обеспечить микросреду in-vivo для повышения достоверности состояния нативной микроглии [55] и способствовать созреванию органоидов мозга [106, 111-113], MC-HBOs, трансплантированные в мозг мыши, могут стать перспективной моделью для лучшего имитирования реального человеческого мозга.

В целом, MC-HBOs стали перспективной моделью для иллюстрации роли микроглии в функциях мозга и этиологии заболеваний. MC-HBOs не только ценны для исследования микроглии, но и полезны для создания органоидов, которые лучше имитируют реальный человеческий мозг. Благодаря MC-HBOs у нас есть уникальная возможность углубить наше понимание того, как развивается и работает человеческий мозг. В будущих исследованиях разработка надежной и воспроизводимой модели MC-HBOs в сочетании с редактированием генов и мультиомическим анализом будет в значительной степени способствовать развитию областей моделирования заболеваний и функциональных исследований.